Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
1.1. Источники аргинин-вазопрессина в гипоталамусе 17
1.2. Рефлекторная регуляция освобождения аргинин-вазопрессина из гипофиза 20
1.3. Другие факторы и механизмы регуляции функциональной активности ней росе креторных клеток и секреции аргинин-вазопрессина 31
1.4. Морфофункциональная организация лимбико-гипоталамического контроля супраоптического и паравентрикулярного ядер гипоталамуса 36
1.5. Электрофизиология нейросекреторных клеток 42
1.6. Сопряжение стимула и секреции аргинин-вазопрессина 49
1.7. Физиологические и молекулярные механизмы действия антидиуретического гормона в осморегулирующем эпителии.. 54
1.8. Общие представления о гормональной, ауто- и паракринной регуляции в связи с секрецией аргинин-вазопрессина 64
1.9. Роль простагландинов в регуляции осмотической проницаемости и механизмы их действия в осморегулирующем эпителии 69
1.10. Внегипофизарные источники аргинин-вазопрессина в организме и проблема всасывания пептидных гормонов в желудочно-кишечном тракте 77
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 82
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 94
1. Электрофизиологическое исследование морфофункциональной организации лимбического контроля крупноклеточных нейросекреторных ядер гипоталамуса крыс 94
1.1. Антидромная идентификация неиросекреторных клеток супраолтического и пара вентри кулярного ядер гипоталамуса при стимуляции ножки гипофиза 94
2. Тестирование других групп нейронов в области крупно клеточных неиросекреторных ядер гипоталамуса в процессе антидромной идентификации неиросекреторных клеток 102
3. Влияние электростимуляции лимбических структур на импульсную активность нейронов крупноклеточных неиросекреторных ядер гипоталамуса 113
3.1.3.1. Эффекты стимуляции образований гиппокампальной формации на
нейросекреторные клетки в супраоптическом ядре 113
3.1.3.2. Влияние стимуляции образований гиппокампальной формации на другие группы нейронов в области супраолтического ядра 120
3.1.3.3. Влияние стимуляции лимбических структур на нейросекреторные клетки и другие группы нейронов области пара вентри куля рного ядра.. 125
4. Сравнительный анализ лимбико-гипоталамических проекций и функциональной организации контроля импульсной активности различных нейронов в области супраолтического и паравентрикулярного ядер 127
5. Обсуждение результатов 134
3.2. Изучение механизмов действия аргинин-вазопрессина, аргинин-вазотоцина и роли аутакоидов в регуляции осмотического транспорта воды в мочевом пузыре лягушки 155
3.2.1. Исследование локализации и функциональнойроли рецепторов вазопрессина (вазотоцина) в эпителии мочевого пузыря лягушки 155
3.2.2. Исследование роли мезотоцина в регуляции осмотической проницаемости эпителия мочевого пузыря лягушки 162
3.2.3. Исследование гидроосмотического действия аргинин-вазопрессина и аргинин-вазотоцина в условиях ингибирования протеиназ 165
3.2.4. Анализ участия аутакоидов в снижении осмотической проницаемости для воды эпителия мочевого пузыря лягушки 169
3.2.5. Продукция простагландинов в эпителии мочевого пузыря лягушки при стимуляции V-рецепторов люминальной и базолатеральной клеточных мембран 177
3.2.6. Динамика восстановления водонепроницаемости эпителия мочевого пузыря лягушки после действия аргинин-вазотоцина, десмолрессина и цАМФ 182
3.2.7. Роль аутакоидов и простагландина Е2 в восстановлении водонепроницаемости эпителия мочевого пузыря лягушки 190
3.2.8. Обсуждение результатов 206
3.3. Всасывание и гидроосмотическое действие аргинин-вазотоцина и аргинин-вазопрессина при введении нонапептидов в изолированную тонкую кишку лягушки 228
3.3.1. Исследование всасывания аргинин-вазотоцина и аргинин-вазопрессина в тонкой кишке по изменению осмотического транспорта воды в мочевом пузыре лягушки 229
3.3.2. Количественная оценка всасывания аргинин-вазотоцина и аргинин-вазопрессина в тонкой кишке лягушки 232
3.3.3. Влияние осмотического градиента и гексоз на всасывание аргинин-вазотоцина в тонкой кишке лягушки 238
3.3.4. Исследование влияния антагонистов Vr и \/грецепторов на всасывание аргинин-вазотоцина в тонкой кишке 242
3.3.5. Исследование влияния простагландинов на всасывание в тонкой кишке аргинин-вазотоцина 247
3.3.6. Обсуждение результатов 253
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 266
ВЫВОДЫ 284
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 287
- Источники аргинин-вазопрессина в гипоталамусе
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
- Электрофизиологическое исследование морфофункциональной организации лимбического контроля крупноклеточных нейросекреторных ядер гипоталамуса крыс
Введение к работе
Актуальность темы. В механизмах водно-солевого обмена важнейшая роль принадлежит антидиуретическому гормону (АДГ). Под его влиянием повышается осмотическая проницаемость для воды клеток осморегулирующего эпителия (кожа и мочевой пузырь амфибий, собирательные трубки почки), усиливается всасывание воды в кровь (Гинецинский, 1963; Наточин, 1983; Иванова, 1993; Bentley, 1971). Функцию АДГ у амфибий, рептилий и птиц выполняет аргинин-вазотоцин (АВТ), а у млекопитающих - аргинин-вазопрессин (АВП). Вазопрессин-продуцирующие нейросекреторные клетки супраоптического ядра (СОЯ) и паравентрикулярного ядра (ПВЯ) гипоталамуса являются основными элементами центрального осморегуляторного комплекса и эфферентным звеном осмо- и волюморегулирующего рефлексов, обеспечивая секрецию АДГ в кровь. Для целостного представления о физиологии системы осморегуляции необходимо изучение функциональной организации ее отдельных элементов и механизмов, связанных с регуляцией секреции АДГ и его действием в клетках эффекторных органов.
В центральной регуляции секреции АВП участвуют образования лимбической системы (Cross, Dyball, 1974; Stutinsky, Guerne, 1976; Hayward et al., 1977; Hamamura et al., 1982; Cirino, Renaud, 1985), однако не сформировано ясных представлений о характере, механизмах и значимости их влияний на импульсную активность неиросекреторных клеток и секрецию нейрогормонов. Морфофизиологические исследования указывают на тесную связь гиппокампа и миндалины с продукцией АВП в гипоталамусе (Bester-Meredith, Marler, 2001; Forray, Gysling, 2004; Lee et al., 2004), но не проясняют их роли в контроле освобождения гормона из задней доли гипофиза. Ответ мог дать электрофизиологический анализ афферентных входов гиппокампальной формации и миндалевидного комплекса ядер к нейронам области СОЯ и ПВЯ, в том числе к нейросекреторным клеткам этих ядер.
Прогресс в изучении молекулярных основ действия АДГ, связанный с открытием водных каналов (аквапоринов) и клонированием рецепторов АВП, требует оценки физиологической значимости механизмов регуляции функции осморегулирующего эпителия в связи с сиюминутной потребностью организма. Объектом таких исследований может служить изолированный мочевой пузырь амфибий, являющийся физиологической моделью осмотического транспорта воды. Наличие в базолатеральной мембране клеток мочевого пузыря травяной лягушки двух типов рецепторов АДГ {Natochin, Shakhmatova, 1992; Goncharevskaya et al., 1995) и свидетельства в пользу присутствия рецепторов гормона в люминальной мембране клеток некоторых отделов нефрона и собирательных трубок (Ando et al., 1991; Burgess et al., 1994) дают основания для поиска функциональной роли этих рецепторов в модуляции действия АДГ. Представляет интерес анализ продукции и физиологической роли аутакоидов, их значения для недостаточно изученного явления восстановления водонепроницаемости эпителия. Важны и другие аспекты регуляции эффекта АВП, связанные с влиянием иных гипофизарных нонапептидов, эндогенных протеаз.
Общепринято, что пептидные гормоны поступают в кровь при секреции эндокринной железой. Однако нельзя было исключить возможности всасывания в желудочно-кишечном тракте нокапептидных гормонов. Установлено всасывание физиологически активного АВП у крыс in vivo из изолированной петли тонкой кишки (Наточим и др., 20036). Необходимым этапом анализа внегипофизарного пути поступления в кровь циклических нонапептидов является изучение возможности всасывания АДГ из тонкой кишки в опытах in vitro. Все сказанное свидетельствует об актуальности исследований экстрагипоталамического контроля нейросекреторных клеток и секреции АДГ, его всасывания в кишечнике, механизмов действия гормона в осмо регулирую щем эпителии, что имеет значение для развития представлений о способах регуляции водно-солевого обмена.
Цель и задачи исследований. Целью работы явилось исследование нервных, гормональных, ауто- и паракринных механизмов осморегуляции, связанных с лимбико-гипоталамическим контролем секреции АВП и гидроосмотическим действием АДГ в осморегулирующем эпителии. Были поставлены следующие задачи:
Исследовать функциональную организацию афферентных входов структур лимбической системы в область СОЯ и ПВЯ гипоталамуса в процессе антидромной идентификации нейросекреторных клеток.
Выяснить наличие рецепторов АВП (АВТ) в люминальной плазматической мембране клеток мочевого пузыря лягушки и роль W и \/2-рецепторов в модуляции гидроосмотического действия АВТ.
Проанализировать механизмы модуляции эффекта АДГ со стороны базолатеральной мембраны клеток мочевого пузыря.
Исследовать динамику и механизмы восстановления водонепроницаемости эпителия после действия АДГ и роль аутакоидов в этом процессе.
Изучить возможность всасывания физиологически активных АВТ и АВП в изолированной тонкой кишке и влияние на этот процесс различных физиологических факторов.
Научная новизна работы. Впервые осуществлен комплексный анализ функциональной организации афферентных входов структур лимбической системы в крупноклеточные нейросекреторные ядра гипоталамуса крыс с оценкой характера и значимости механизмов контроля импульсной активности функционально различных групп клеток. Впервые показано, что структуры вентрального гиппокампа, субикулума и корти ко-медиапьной миндалины осуществляют возбуждающий и тормозный контроль неиросекреторных клеток, вставочных и других нейронов области СОЯ и ПВЯ. Наиболее обширные проекции от лимбических структур получают интернейроны. Впервые установлено, что вентральный гиппокамп обеспечивает возбуждение неиросекреторных клеток СОЯ, а субикулум - торможение. Впервые продемонстрирована функциональная пластичность неиросекреторных клеток и интернейронов СОЯ, в том числе изменения их афферентных входов в связи с лактацией и активацией механизмов осморегуляции.
Впервые показано, что не только в базолатеральной, но и в апикальной мембранах клеток эпителия мочевого пузыря лягушки имеются рецепторы, функционально сходные с V2- и \/грецепторами. Впервые продемонстрировано, что мезотоцин увеличивает осмотическую проницаемость мочевого пузыря лягушки и усиливает гидроосмотический эффект АВТ и десмопрессина. Впервые обнаружено увеличение гидроосмотической реакции на АДГ при ингибировании протеиназ овомукоидом со стороны базолатеральной мембраны клеток. Установлено, что простагландин Еі (ПГЕ-О, простагландин Е2 (ПГЕ2) и простагландин F2a (nrF2a) секретируются клетками мочевого пузыря в раствор со стороны не только серозной, но и слизистой оболочек с преобладанием продукции ПГЕ2, которая угнетается диклофенаком. Установлена эффективность различных эйкозаноидов в снижении осмотической проницаемости эпителия мочевых пузырей: ПГЕї > ПГЕ2 > nrF2a > простагландин І2 (ПП2). При действии АВТ на рецепторы люминальной мембраны клеток впервые обнаружено повышение секреции ПГЕ2 и П^ в раствор со стороны серозы и ПГЕ! в раствор у мукозы. Впервые показано, что время восстановления водонепроницаемости определяется степенью повышения осмотической проницаемости, а способность клеток к восстановлению водонепроницаемости замедляется при ингибировании фосфолипазы А2 кинакрином и циклооксигеназы диклофенаком.
Впервые продемонстрировано всасывание АВТ и АВП в тонкой кишке лягушки с сохранением их физиологической активности и выявлены факторы, влияющие на этот процесс.
Основные положения, выносимые на защиту:
Структуры лимбической системы осуществляют возбуждающий и тормозный контроль нейросекреторных клеток, вставочных и других нейронов области СОЯ и ПВЯ. Влияния вентрального гиппокампа, субикулума и кортикомедиальной миндалины в наибольшей степени адресованы интернейронам, имеющим возбуждающие входы от нейросекреторных клеток, что обеспечивает возможность вовлечения последних в интегративные функции гипоталамуса.
Влияния гиппокампа на импульсную активность нейросекреторных клеток более значимы для ПВЯ, чем СОЯ; в ПВЯ они преобладают над влияниями миндалины. Возбуждающие входы гиппокампа и тормозные -субикулума к нейросекреторным клеткам СОЯ могут являться основой различной функциональной роли этих структур в механизмах регуляции секреции нейрогипофизарных гормонов.
Нейросекреторным клеткам и интернейронам СОЯ свойственна функциональная пластичность, проявляющаяся при стимуляции ножки гипофиза, лимбических структур и активации механизмов осморегуляции.
Рецепторы, подобные Vr и \/2-рецепторам, имеются не только в базолатеральной, но и апикальной мембранах клеток эпителия мочевого пузыря травяной лягушки. Роль триггера гидроосмотического действия АВТ играют \/2-рецепторы базолатеральной мембраны, а функциональная роль Угподобных рецепторов апикальной мембраны заключается в негативной модуляции эффекта АВТ.
Мезотоцин повышает осмотическую проницаемость клеток эпителия мочевого пузыря лягушки и усиливает гидроосмотическое действие АВТ.
Действие АДГ усиливается при замедлении инактивации гормон-рецепторного комплекса овомукоидом со стороны внешней поверхности плазматической мембраны клеток.
Повышение секреции ПГЕ2 является возможным механизмом негативной модуляции эффекта АВТ при стимуляции рецепторов люминальной мембраны клеток.
Восстановление водонепроницаемости эпителия определяется степенью повышения осмотической проницаемости. Восстановление осмотической непроницаемости замедляется при угнетении синтеза проста гланди нов, не связано с запуском механизма отрицательной обратной связи через \Л-подобные рецепторы, обусловлено не только прекращением действия АДГ, но и участием аутакоидов, в частности ПГЕ2.
В тонкой кишке лягушки частично всасываются АВТ и АВП. Всасывание АВТ снижается с увеличением осмотического градиента и не связано непосредственно с всасыванием воды. Всасывание гормона угнетается антагонистом \/2-рецепторов, простагландинами Ej и F2a, усиливается под влиянием ПГЕ2, что свидетельствует о функциональном контроле этого процесса.
Научно-практическое значение работы. Полученные результаты имеют фундаментальное значение, существенно расширяют представления о работе системы осморегуляции. Часть экспериментальных данных послужила основой изобретения полипептидной композиции, предназначенной для использования в клинике (патент № 2171687). Результаты исследований используются в курсах лекций «Механизмы регуляции функций висцеральных систем» и «Частная эндокринология», читаемых магистрантам кафедры общей физиологии биолого-почвенного факультета СПбГУ.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 2-й Всесоюзной конференции по нейроэндокринологии (Иваново, 1982); Международном симпозиуме по нейроэндокринологии (Л., 1985); VII и VIII Всесоюзных симпозиумах по физиологии и биохимии лактации (М., 1986; Алма-Ата, 1990); III Всесоюзной и IV и VII Всероссийских конференциях по нейроэндокринологии (Л., 1988; СПб., 1995, 2005); I международном симпозиуме «Структура и функции вегетативной нервной системы» (Воронеж, 1995); II съезде нефрологов России (М., 1999), Международной конференции, посвященной 150-летию академика И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999), International Workshop on developmental nephrology: genes, morphogenesis, and function (Canada, Victoria, British Columbia, 2001); IX Всероссийской конференции по физиологии и патологии почек и водно-солевого обмена (Спб., 2001); 10-й Всероссийской конференции по физиологии почек и водно-солевого обмена (Новосибирск, 2003); III Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Спб., 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Болезни почек: эпидемиология, диагностика, лечение» (Кызыл, 2004); XVII, XVIII и XIX съездах физиологического общества имени И.П. Павлова (Ростов-на-Дону, 1998; Казань, 2001; Екатеринбург, 2004).
Тема диссертации связана с планом основных научно-исследовательских работ НИИ физиологии им. А.А. Ухтомского СПбГУ и ИЭФБ им. И.М. Сеченова РАН по приоритетному направлению фундаментальных исследований РАН 5.13. «Физиологические механизмы деятельности висцеральных систем» (постановление Президиума РАН № 233 от 01 июля 2003 г.), включена в плановую тему «Исследование клеточных механизмов эволюции водно-солевого обмена у позвоночных животных» (№ гос. регистрации 01.9.70007006), а также в Программу Президиума РАН (№ 14, 2002), Программу ОБН РАН (гос. контракт № ОБН 5/2003, 2004), ФЦП «Интеграция» (проект № 326.68), Программу СПб НЦ РАН (инициативный проект, 2003); исследования поддержаны грантами РФФИ (96-04-48622; 96-15-97847; 99-04-49189; 02-04-48065), Ведущих научных школ (00-15-97803; НШ-2106.2003.4), ИНТАС <№ 97-11404).
Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 56 работах, опубликованных в отечественных и зарубежных изданиях, список основных публикаций содержит 29 статей и 1 патент на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из традиционных разделов, содержит 78 рисунков и 5 таблиц. Список литературы включает 625 ссылок на 102 работы отечественных авторов и 523 зарубежных источника. Общий объем диссертации - 359 с.
Источники аргинин-вазопрессина в гипоталамусе
АВП, а также другой нейрогипофизарный гормон - окситоцин, вырабатываются в парных крупноклеточных нейросекреторных ядрах гипоталамуса - супраоптических, а также паравентрикулярных (в их крупноклеточной части). АВТ амфибий вырабатывается в преоптическом ядре гипоталамуса, гомологами которого считают СОЯ и ПВЯ амниот. В зарубежной литературе применительно к нейрональным элементам с ярко выраженной секреторной функцией, в том числе к вазопрессин- и окситоцин-продуцирующим клеткам СОЯ и ПВЯ, закрепился термин «нейросекреторные нейроны» (Sharrer, 1990). В данной работе используется термин, исторически обоснованный и применяемый отечественными нейроэндокринологами - «нейросекреторная клетка» (Поленов, 1993).
В нейросекреторных клетках синтезируется препрогормон, состоящий из сигнального пептида АВП, нейрофизина и гликопротеина (Waller et al., 1998). Упакованный в гранулы АВП вместе с белком носителем нейрофизином II поступает в аксоны, по которым транспортируется в область нейрогипофиза. Аксоны вазопрессинергических нейросекреторных клеток вместе с окситоцинергическими волокнами (содержащими окситоцин, транспортируемый в комплексе с нейрофизином I) образуют нейросекреторные тракты от ПВЯ и СОЯ, объединяющиеся в гипоталамо-гипофизарный тракт, в составе ножки гипофиза проходят в заднюю долю гипофиза, где разветвляются на многочисленные нейросекреторные терминали. Во время транспорта по аксонам АВП и нейрофизин II освобождаются от упакованного в секреторные гранулы препрогормона за счет протеолитического расщепления и накапливаются в нейросекреторных терминалях. Выделение нейрогормонов и нейрофизинов происходит путем Са -зависимого экзоцитоза. Эти представления отражены в соответствующих монографиях и обзорах {Sharrer, Sharrer, 1963; Поленов, 1968,1993; Алешин, 1973; Константинова, Наточин, 1979; Иванова, 1993). Вазопрессинергические нейросекреторные клетки вместе с окситоцинергическими, локализованными в тех же ядрах, а также их аксонами и нейрогемальным органом - задней долей гипофиза, представляют собой гипоталамо-гипофизарную нейросекреторную систему (Поленов, 1968).
Количество нейросекреторных клеток, их внутриядерная локализация и соотношение вазопрессин- и окситоцинергических клеток в СОЯ и ПВЯ имеют видовые различия (см. Грачев, Пруцкова, 1974; Иванова, 1993). Согласно некоторым подсчетам, в ПВЯ крыс больше окситоцинергических клеток, чем крупноклеточных вазопрессинергических (Swaab et al., 1975), по другим данным соотношение клеток этих групп приблизительно одинаково (Rhodes et al., 1981). В СОЯ крыс неиросекреторных клеток втрое больше, чем в крупноклеточной части ПВЯ (Swaab et al., 1975) при соотношении вазопрессинергических и окситоцинергических клеток приблизительно 2:1 (Rhodes et al., 1981). Нейросекреторные клетки представляют собой крупные (от 20 до 35 и более мкм в диаметре) мультиполярные или биполярные клетки. Наряду с ними в ядрах присутствуют мелкие нейроны, у которых отсутствует иммуноцитохимическая реакция на нонапептиды (Felten, Cashner, 1979; lijima et al., 1984; Koichi, Naosuka et al, 1985; Yasunobi et al., 1986), а также глиальные элементы. Неиросекреторных клетки имеют обширную синаптическую иннервацию (до 600 синапсов на клетку), многочисленные ветвления дендритов, тесные сопри лежания тел и отростков (Hatton, Tweedle, 1982; Theodosis et al., 1986).
Материалы и методы исследования
Объекты исследования. Эксперименты проведены на 165 самках крыс линии Вистар массой тела 200 - 250 г (из питомника «Рапполово»), в том числе на 98 лактирующих (5 - 10 дни лактации). До опытов, проводимых с октября по май, животные находились в виварии СПбГУ в стандартных условиях содержания и кормления. В опытах с водной депривацией группу крыс, за 18 ч до опыта лишенных доступа к воде, а также контрольных животных, имевших свободный доступ к воде и пище, содержали на гранулированном корме. В экспериментах in vitro использовали самцов травяной лягушки Rana tern рога ri a L, полученных из зоокомбината Санкт-Петербурга. Эти опыты проводили в период с ноября по май, до экспериментов животных содержали в виварии или холодильной камере при температуре 5-7 С.
Хирургические процедуры. Острые опыты на крысах проводили под уретановым наркозом (1.3 - 1.5 г/кг массы тела, внутрибрюшинно, в виде 25% раствора). Животное фиксировали в стереотаксическом аппарате (СЭЖ-2 и СЭЖ-3), находящемся в специальной экранирующей камере. Температуру тела (ректальную) поддерживали с помощью грелки и лампы. После скальпирования поверхности черепа и нанесения разметок на основании координат стереотаксического атласа мозга крысы (А!Ье-Fessard et al., 1966) осуществляли трепанацию зубоврачебными борами. Через отверстия в черепе в мозг, после предварительного удаления мозговых оболочек, вводили сначала стимулирующие электроды, а затем регистрирующий (ипсилатерально к области стимуляции) по координатам от лямбдовидного шва (в мм): в область СОЯ - А 7.3, L 1.5-1.8, Н 7.5; к ПВЯ - А 6.7, L 0.5, Н 6.3; к ножке гипофиза - А 3.0, L 0.0, Н - до упора в основание черепа; к вентральному гиппокампу - А 3.5-3.8, L 3.5-4.0, Н 7.0 -7.5; к дорзальному гиппокампу - А 4.0-4.2, L 3.5, Н 2.5-3.0; к субикулуму - А 4.0, L 3.5 - 4.0, H 8.0 - 8.2; к кортикомедиальной группе ядер миндалины -в пределах координат медиального и кортикального ядер (А 6.7-7.0, L 2.8-3.5; Н 7.5-8.0). У 6 крыс в конце опыта брали кровь из бедренной вены для определения осмоляльности сыворотки крови. Эвтаназию животных после опыта осуществляли введением летальной дозы уретана или нембутала.
Лягушек обездвиживали разрушением спинного мозга препаровальной иглой, вскрывали переднюю брюшную стенку, заполняли обе доли мочевого пузыря раствором Рингера, выделяли их разработанным ранее методом, помещая парные мочевые пузыри в стакан с раствором Рингера (Наточин, 1963; Наточин, Шахматова, 1966). Для изоляции отрезка тонкой кишки перевязывали двенадцатиперстную кишку ниже желчного протока, вводили в нее шприц и делали надрез в области толстой кишки. С помощью шприца раствором Рингера промывали кишечник, после чего перевязывали дистальный отдел тонкой кишки (в 3-8 мм от толстой кишки). Шприцем с насаженным на иглу полиэтиленовым зондом длиной около 7 мм и диаметром 0.7 мм вводили в тонкую кишку 0.1 - 0.15 мл раствора Рингера, накладывали лигатуру в верхней части подвздошной кишки в соответствии с анатомией кишечника лягушки (Ноздрачев, Поляков, 1994). Отрезок тонкой кишки выделяли из брюшной полости животного. Как и мочевые пузыри, кишку ополаскивали в стакане с раствором Рингера, удерживая за нить, переносили на марлевую салфетку, дважды переворачивали для удаления избытка жидкости с поверхности органа перед взвешиванием. Время процедур с момента заполнения кишки или мочевых пузырей раствором Рингера не превышало 20-40 с.
Электрофизиологическое исследование морфофункциональной организации лимбического контроля крупноклеточных нейросекреторных ядер гипоталамуса крыс
Согласно методу антидромной идентификации, возникающий в аксоне ПД проводится антидромно, и волна возбуждения, распространяясь » на тело клетки от места стимуляции, вызывает антидромный ПД, регистрируемый расположенным вблизи сомы электродом (рис. ЗА). Признаки, по которым антидромные ПД отличали от ортодромных, спонтанно возникающих ПД удовлетворяли общепринятым критериям, проанализированным в основополагающих работах применительно к нейросекреторным клеткам (Yagi, Iwasaki, 1977; Wakerley, 1987). Примеры представлены на рис. ЗБ-В и 4А-Г. Выполнялись следующие условия: 1) постоянство латентного периода антидромного ПД (суперпозиции на рис. ЗБ и 4); 2) отсутствие антидромного ПД после ортодромного в результате коллизии - их столкновения и взаимного погашения на аксоне, если стимул наносится раньше, чем фоновый ПД успеет распространиться по аксону к месту стимуляции (рис. ЗБ, 3, 4А, 3 и 4Б, 2); 3) воспроизведение антидромного ПД при частоте стимуляции 50 - 100/с (рис ЗБ, 2, 4). Наряду с основными критериями, отмечали другие характерные для нейросекреторных клеток признаки. Один из них - перегиб на восходящей фазе антидромного ПД, разделяющий его на два компонента, считающиеся потенциалами соответственно начального сегмента аксона (аксональный компонент) и сомы (сомато-дендритный компонент).
А: Г - гипофиз, Эл - раздражающий электрод. Б: 1 - антидромные ПД на одиночные стимулы (суперпозиция 5-ти разверток); 2 - то же на серии из 2-х стимулов с частотой 50/с; 3 - отсутствие антидромных ПД на 1-й из 2-х стимулов в результате столкновения со спонтанным ПД; 4 -антидромный ПД на серию из 5-ти стимулов с частотой 100/с. В: 1-3 -воспроизведение антидромных ПД на сдвоенные стимулы с частотой 400/с, 440/с и 480/с соответственно с усилением разделения 2-го ПД на компоненты по мере увеличения частоты; 4 - отсутствие антидромного ПД на 2-й стимул при частоте 500/с, обусловленное рефрактерным периодом данной клетки. Калибровка: 10 мс; точка над артефактом раздражения -момент раздражения ножки гипофиза. Пояснения в тексте. Разделение весьма отчетливо при частотной стимуляции, в процессе которой снижается возбудимость нейросекреторной клетки и затрудняется вторжение аксонального спайка на сому (рис. ЗВ). Раздражение сдвоенными стимулами позволяло судить о рефрактерном периоде клетки, который для сомато-дендритной и аксональной мембраны, как правило, был одинаков, составляя 3-5 мс. На рис. 4 (Г, 2) видно, что он составляет около 3 мс - антидромный ПД клетки на второй стимул не появляется при частоте 300/с. Встречались также клетки с пониженной возбудимостью сомато-дендритной мембраны, когда разделение антидромного ПД на компоненты наблюдалось уже при частоте 50/с (рис. 4Б, 3), а при частоте 100/с появлялся только компонент начального сегмента аксона и уже не на каждый второй стимул в паре (рис. 4Б, 4), т.е. величина рефрактерного периода составляла в этом случае около 10 мс.
Отмечены особые случаи одновременного отведения импульсной активности двух ней росе креторных клеток, различавшихся по амплитуде спайков и порогу антидромной активации (рис. 5). Рис. 5А - пример антидромного ПД «молчащей» клетки и фонового ПД другой клетки, антидромный ПД которой имел более высокий порог и возникал только с увеличением амплитуды стимула. При этом антидромный ПД первой клетки был аксональным спайком, так как изредка (на суперпозиции осциллограмм рис. 5А, 5 - на один стимул из пяти) появлялся сомато-дендритный компонент. Таким образом, можно говорить о существенных различиях в возбудимости сомато-дендритных мембран расположенных поблизости нейросекреторных клеток. Рис. 5Б - иллюстрация отведения импульсной активности двух фоноактивных нейросекреторных клеток, четко различающихся не только по амплитуде фоновых ПД (Б, 1), но и по частоте разряда в фоне, латентному периоду и порогу генерации антидромного ПД. Показателен феномен коллизии у одной из этих клеток при одновременной регистрации антидромного ПД другой клетки (Б, 6).
