Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 14
1.1.Современные представления о базисных молекулярно-клеточных механизмах повреждения и толерантности мозга к действию неблагоприятных факторов 14
1.1.1. Вовлечение внутриклеточных сигнальных каскадов в формирование патологических и адаптивных реакций нейронов мозга 14
1.1.2. Транскрипционные факторы 22
1.1.2.1. Классификация 22
1.1.2.2. Транскрипционные факторы, активируемые фосфорилированием (CREB,NF-kB) 23
1.1.3. Экспрессия генов раннего и позднего действия и их продуктов 28
1.1.4. Факторы регуляции апоптоза 41
1.2. Гормон-зависимые механизмы адаптации к повреждающим факторам 46
1.2.1. Классические теории адаптации. Понятие о стрессе 46
1.2.2. ГАС-основная гормональная система адаптации организма 48
1.2.3. Нейроэндокринная регуляция адаптивных процессов 54
1.3. Нейроэндокринные механизмы дезадаптивных состояний 62
1.3.1. Депрессии 62
1.3.2. Постстрессовые тревожные расстройства 64
1.4. Прекондиционирование - эффективный способ повышения толерантности мозга к повреждающим воздействиям 67
1.4.1. Прекондиционирование: теоретические и практические аспекты 67
1.4.2. Гипоксическое прекондиционирование 72
2. Материалы и методы исследования 77
2.1. Гипобарическая гипоксия 77
2.2. Гистологические методы 78
2.3. TUNEL метод детекции апоптоза 79
2.4. Иммуноцитохимия 80
2.5. Гибридизация in situ 81
2.6. Молекулярно-биологические методы 82
2.7. Модели различных форм психоэмоционального стресса, вызывающего развитие постстрессорных психопатологий 84
2.7.1. «Выученная беспомощность» - экспериментальная модель эндогенной депрессии 84
2.7.2. Парадигма «стресс-рестресс» - модель посттравматического стрессового расстройства 84
2.7.3. Тесты с применением антидепрессантов
2.8. Методы изучения поведения 86
2.9. Методы исследования гормональных функций 88
2.9.1. Радиоиммунный анализ кортикостероидных гормонов 89
2.9.2. Определение стрессореактивности ГАС 92
2.9.3. Методы изучения регуляции ГАС по принципу отрицательной обратной связи 92
2.10. Компьютерный анализ микроизображений 94
2.11. Статистическая обработка результатов 96
3. Результаты экспериментальных исследований 97
3.1. Нейропротективные эффекты прекондиционирования умеренной гипобарической гипоксией 97
3.1.1. Повышение резистентности нейронов мозга к тяжелой гипоксии 97
3.1.2. Прекондиционирование нивелирует нарушения обучения и памяти, индуцируемые тяжелой гипоксией 102
3.1.3. Повышение устойчивости к тяжелым формам психоэмоционального стресса, вызывающего развитие постстрессорных тревожно-депрессивных патологий 105
3.1.3.1. Антидепрессивный эффект: предотвращение формирования депрессивноподобного состояния «выученной беспомощности» 105
3.1.3.2. Анксиолитический эффект: коррекция развития экспериментального тревожного состояния в модели посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) 111
3.2. Молекулярно-клеточные механизмы повышения устойчивости мозга, активируемые гипоксическим прекондиционированием 118
3.2.1. Прекондиционирование модифицирует активность МАРК каскада после тяжелой гипоксии 119
3.2.2. Изменения экспрессии и активности транскрипционных факторов 124
3.2.2.1. Активационные транскрипционные факторы: CREB и NF-kappaB 124
3.2.2.2. Индуцибельные транскрипционные факторы: ранние гены (c-fos, c-jim, ngfi-a) и их продукты 129
3.2.2.3. Гипоксия-индуцибельный фактор: HIF-1 138
3.2.3. Модификация соотношения факторов-регуляторов апоптоза семейства генов bcl-2 140
3.2.4. Изменения экспрессии поздних генов и их продуктов 143
3.2.4.1. Антиоксиданты 147
3.2.4.2. Металлопротеазы семейства ADAM 150
3.2.4.3. Белок-предшественник Р-амилоида (АРР) 157
3.3. Гормон-зависимые механизмы нейропротективных эффектов гипоксического прекондиционирования 159
3.3.1. Особенности функционирования ГАС у прекондиционированных животных 161
3.3.1.1. Динамика активности ГАС 161
3.3.1.2. Модификации стрессореактивности ГАС 162
3.3.2. Модификация механизмов глюкокортикоидной обратной связи, опосредуемых стероидными рецепторами гиппокампа 165
3.3.3. Участие кортиколиберинергической системы мозга 168
3.3.4. Участие вазопрессинергической системы мозга 174
4. Обсуждение результатов 178
4.1. Использование гипобари ческой гипоксии в режиме прекондиционирования: теоретические аспекты и нейропротективные эффекты 178
4.2. Базисные молекулярно-клеточные механизмы нейропротекции, активируемые прекондиционированием гипобарической гипоксией 181
4.3. Гормональные механизмы протективных эффектов прекондиционирования 201
Выводы 210
Список литературы 212
- Вовлечение внутриклеточных сигнальных каскадов в формирование патологических и адаптивных реакций нейронов мозга
- Парадигма «стресс-рестресс» - модель посттравматического стрессового расстройства
- Прекондиционирование нивелирует нарушения обучения и памяти, индуцируемые тяжелой гипоксией
- Базисные молекулярно-клеточные механизмы нейропротекции, активируемые прекондиционированием гипобарической гипоксией
Вовлечение внутриклеточных сигнальных каскадов в формирование патологических и адаптивных реакций нейронов мозга
Согласно современным представлениям, в формирование механизмов повреждения и толерантности мозга к различным неблагоприятным факторам (гипоксии, электромагнитным и ионизирующим излучениям, токсинам) вовлекаются компоненты внутриклеточной сигнальной транедукции, транскрипционные факторы, гены раннего и позднего действия, их продукты — белки, ответственные за гибель и выживание нервных клеток. В этих процессах важная роль отводится механизмам «проводниковой» (нейромедиаторной) и «объемной» (гормональной, нейропептидной) межклеточной транедукции адаптогенных и патологических сигналов (Самойлов, 1999). Внеклеточные лиганды, называемые первичными посредниками, или мессенджерами, взаимодействуют с клеточными рецеп горами - молекулами белковой природы, которые инициируют образование химических соединений, запускающих внутриклеточные процессы сигнальной транедукции. Такие промежуточные соединения несут в себе информацию о первичном регуляторном сигнале и являются вторичными его переносчиками, поэтому они получили название вторичных посредников, или мессенджеров (second messenger). Вторичные мессенджеры — это компоненты системы передачи сигнала в клетке, малые сигнальные молекулы; они быстро образуются и далее активируют эффекторные белки, которые опосредуют ответ клетки. К наиболее распространенным вторичным посредникам относятся цАМФ и цГМФ, ионы кальция, инозиттрифосфат, оксид азота и др. Концентрация вторичных посредников в цитозоле может быть повышена различными путями: активацией ферментов, которые их синтезируют, как, например в случае активации циклаз, образующих циклические формы нуклеотидов (цАМФ, цГМФ), либо путем открытия ионных каналов, позволяющих потоку ионов, в частности, кальция войти в клетку. Эти малые молекулы могут далее активировать или ингибировать эффекторные молекулы — протеинкиназы, протеазы и другие белки.
Вторичные посредники не являются независимыми внутриклеточными регуляторами - они представляют собой «лишь часть сложноорганизованных внутриклеточных регуляторних систем (ВРС), включающих кроме вторичных посредников их субстраты-источники, субстраты-эффекторы и вспомогательный аппарат» (Самойлов, 1999). Ключевыми ВРС являются качьциевая (основные компоненты - ионы кальция, кальций-связывающие белки, Са +-кальмодулин зависимые протеинкиназы, Са +-зависимые протеазы, эндонуклеазы, фосфолипазы), фосфоинозитидная (монофосфоинозитид, полифосфоинозитиды, инозиттрифосфаты, диацилглицерол, Са2+-фосфолипид-зависимые протеинкиназы С, фосфолипаза С и др. ферменты) и система циклических нуклеотидов (цАМФ, цГМФ, аденилатциклаза, гуанилатциклаза, фосфодиэстераза, цАМФ- и цГМФ-зависимые протеинкиназы). Протеинкиназы, входящие в состав ВРС, каскадно фосфорилируют по Ser- и Thr остаткам молекулы белков, участвующих в регуляции клеточных процессов, а также адаптивных и патологических реакциях. Аденилатциклазная система циклических нуклеотидов связана с Gs- и Gi- белками, которые реципрокно регулируют активность фермента аденилатциклазы (АС) плазмалеммы. Рецептор-зависимая активация Gs-белка стимулирует образование цАМФ (сАМР) с участием аденилатциклазы. Образованный цАМФ связывается с каталитическими субъединицами (с) протеинкиназы А (РКА), что вызывает их диссоциацию от каталитических субъединиц и транспорт последних через ядерные поры в ядро (рис.1), где они специфически фосфорилируют транскрипционные факторы, участвующие в формировании адаптивных реакций (в частности CREB, АР-1, АР-2, и др.). В фосфоинозитидиой системе активация G-белков регулирует мембранные изоформы фосфолипазы С (PLC), стимулируя или ингибируя их активность. Мембранная фосфолипаза С является фосфоинозитид-специфической и гидролизует инозитолдифосфат мембраны до инозитолтрифосфата (IP3). Другим продуктом гидролиза является диацилглицерол, имеющий в боковой цепи арахидоновую кислоту. IP3, взаимодействуя с собственными рецепторами внутриклеточных депо, вызывает выброс Са"+ в цитоплазму и ядро и запуск Са"+-зависимых процессов (активация протеинкиназы С (РКС) и других киназ, взаимодействие с Са -связывающими белками (кальмодулин, парвальбумины, S-100), и др.) (Berridge, 1984, 1993). Умеренная активация полифосфоинозитидной системы вовлекается в формирование адаптивных реакций мозга, а гиперактивация -патологических реакций (Самойлов, 1999). Ионы Са"+ и Са"+-связывающие белки являются компонентами кальциевой ВРС. Кальций-опосредованная сигнальная трансдукция в нейронах включает различные звенья внутриклеточных молекулярных процессов, в том числе активацию протеинкиназы С, II, IV, аденилатциклазы, фосфодиэстеразы, протеаз, эндонуклеаз, фосфолипаз A,C,D, Са -зависимый транспорт макромолекул, экзоцитоз, взаимодействие с ядерными белками (Berridge, 1985). В нейронах кальциевая ВРС участвует в фосфорилироваиии и дефосфорилировании белков транскрипционных факторов, рецепторов, ионных каналов, цитоскелета, синаптической передаче, а также оказывает влияние на функционирование других ВРС и экспрессию генов (Самойлов, 1999; Carvalho, 1982; Alema, 1984; Peters, 1986; West et al., 2001). Умеренная активация кальциевой ВРС необходима для индукции адаптивных реакций мозга (Самойлов, 1999; Самойлов и др, 2001; Semenov et al., 2002). Вместе с тем, избыточное накопление внутриклеточного Са + запускает каскад реакций с активацией протеолитических ферментов и разрушением клеточных структур, что ведет к увеличению синтеза оксида азота, возрастанию перекисного окисления липидов с последующим развитием оксидативного стресса, нарушением синтеза нейротрофических факторов, запуском механизмов некроза и апоптоза, приводящих в конечном итоге к гибели клетки (Choi, 1993). Вызываемая различными патогенными воздействиями гиперактивация ВРС, приводящая к кальциевой перегрузке, является центральным механизмом патологических реакций нейронов (Самойлов, 1999). Механизмы кальций-опосредованной эксайтотоксичности играют особую роль в развитии острой церебральной ишемии и формировании инфаркта мозга. Показано (Ginsberg, 1990; Pulsinelli et al., 1982 и др.), что при одинаковых условиях снижения перфузии и энергетического дефицита определенные типы нейронов (пирамидные клетки СА1 области гиппокампа) проявляют повышенную чувствительность к ишемии. Морфологические исследования позволили связать особую уязвимость к ишемии с высокой плотностью кальциевых каналов на поверхности нейронов, создающих локусы накопления кальция в дендритах. Доказано, что увеличение концентрации Са2+ обусловлено высокой плотностью агонист-зависимых кальциевых каналов, контролируемых NMDA-рецепторами к глутамату. Именно вызванная ишемией внеклеточная аккумуляция глутамата является основным фактором избирательного повреждения нейронов (Хаспеков и др., 1999; Drejer et al., 1989; Johansen et al., 1993; Rothman and Olney, 1986). Мощная стимуляция глутаматных рецепторов вызывает огромное увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, а также Na+ и С1-. Кроме того, определенный вклад в повышение цитозольного Са2+ при аноксии может вносить активация потенциал-зависимых Са +-каналов и инверсия №+/Са2+-трансмембранного обмена (Siesjo, Bengtsson, 1989). Существенное значение в поддержании высокой внутриклеточной концентрации свободных ионов Са + имеет процесс высвобождения кальция из мембран эндоплазматического ретикулума и митохондрий, а также нарушение механизмов его секвестрирования и выведения из клеток. Таким образом создается мощная внутриклеточная кальциевая «перегрузка», вследствие которой происходит активация целого ряда протеаз, киназ, эндонуклеаз, накопление арахидоновой кислоты и эйкозаноидов. Результатом этого являются необратимые повреждения мембран и нуклеиновых кислот, стимуляция свободно-радикальных процессов.
Парадигма «стресс-рестресс» - модель посттравматического стрессового расстройства
Модель «стресс-рестресс» была предложена Либерзоном и коллегами в 1997 году (Liberzon et al., 1997). Она выгодно отличается от других моделей своей этиологической обоснованностью. Основу этой модели составляет парадигма «тяжелый травматический стресс - рестресс», что воспроизводит патогенетическую роль предшествующей психотравматизации в ситуации, связанной с угрозой жизни. Известно, что подобная психотравматизация является пусковым фактором для развития посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) и вызывет длительную и устойчивую сенситизацию к факторам, ассоциирующимся с предшествующими травматическими событиями. Действие такого фактора, напоминающего о травматическом стрессе, приводит к развитию реактивного тревожно-депрессивного состояния, тяжесть которого нарастает с течением времени. В модели «стресс-рестресс» в качестве такого фактора применяется краткая стрессирующая процедура, в которой используется стресс той же модальности, что и травматический стресс. Первые же исследования, проведенные с использованием этой модели, показали, что наряду с поведенческой симптоматикой, у крыс наблюдаются нарушения функции и регуляции гипофиз-адреналовой системы, специфические для ПТСР - снижение базального уровня глюкокортикоидов в крови и сенситизация глюкокортикоидной обратной связи, которая ранее была описана как феномен «fast feedback».
Крыс подвергали тяжелому комбинированному стрессу, состоящему из 2-часовой иммобилизации, 20-минутного вынужденного плавания и, после 15-минутного перерыва, воздействию эфира до потери сознания. Триггером для развития тревожно-депрессивного патологического состояния являлся рестресс, заключавшийся в 30-минутном иммобилизационном стрессе.
Людиомип. Для оценки эффективности антидепрессанта в модели эндогенной депрессии (парадигме ВБ) был использован тетрациклический антидепрессант последнего поколения препаратов, применяемых в клинике депрессий - людиомил (мапротилин). Выбор был сделан на основании известной эффективности препарата при лечении эндогенных депрессий в клинике. Мапротилин оказывает выраженное и селективное ингибирующее действие на обратный захват норадреналина пресинаптическими нейронами коры головного мозга. Для инъекций использовался раствор мапротилина метансульфоната (Novartis Pharma, USA), который вводили каждому животному в дозе 15 мкг/кг внутрибрюшинно. Инъекции производились каждый день в течение 3 дней после выработки ВБ. Контрольным крысам в этой серии вводили физиологический раствор в том же объеме. Эффект антидепрессанта на приспособительное поведение и уровень кортикостерона оценивался соответственно на 5- и 10-й день после выработки ВБ.
Количество животных в контрольной группе (животные, которым вводился физиологический раствор) и опытной группе (животные, которым вводился раствор мапротилина) по п=6.
Паксил. В экспериментах по терапевтической коррекции экспериментального тревожного состояния был использован современный антидепрессант-анксиолитик паксил (пароксетина гидрохлорид, GlaxoSmithKline, UK), относящийся к группе ингибиторов обратного захвата серотонина и являющийся наиболее эффективным при лечении ПТСР в клинике (Stein et al., 2000). Паксил является наиболее специфическим блокатором обратного захвата серотонина среди селективных серотонинергических антидепрессантов-анксиолитиков. Механизм действия паксила основан на его способности избирательно блокировать обратный захват серотонина пресинаптической мембраной, с чем связано повышение свободного содержания этого нейромедиатора в синаптической щели и усиление действия серотонина в ЦНС, ответственного за развитие тимоаналептического (антидепрессивного) эффекта. Паксил в виде суспензии на физиологическом растворе вводили каждому животному в дозе 20 мг/кг перорально, трехкратно - на 4-й, 5-й, 6-й день после травматического стресса. Контрольным крысам в этой серии вводили физиологический раствор в том же объеме. Корректирующий эффект паксила на приспособительное поведение наблюдали в «открытом поле» на 1-е сутки после повторного стресса (рестресса), анксиолитический эффект - в тесте ПКЛ на 5-е сутки после рестресса. Количество животных в контрольных и опытных группах - по п=6.
Одной из задач исследования было изучение изменений приспособительного поведения животных в ходе развития тревожно-депрессивных состояний в рассматриваемых моделях, а также для оценки эффекта гипоксического прекондиционирования на поведение. Для анализа поведения экспериментальных животных использовался простой, но вместе с тем показательный тест «открытое поле», признанный одним из наиболее адекватных методов оценки локомоторной активности и стрессорного ориентировочно-исследовательского поведения в целом (Holl, 1936; Маркель и др., 1988; Belzung, 1999). Вместе с тем данный тест широко применяется для скрининга корректирующего эффекта антидепрессантов и анксиолитиков (Pal and Dandia, 1993; Prut and Belzung, 2003). Существует несколько модификаций метода, но в данной работе мы ориентировались на стандартную методику (Holl, 1936). Открытое поле представляло собой четырёхугольную камеру размером 90x90 см со стенками высотой 45 см, освещенное лампочкой мощностью 60 Вт. Следует отметить, что дополненное световым стимулом «открытое поле» усиливает аверсивный контекст стресса новизны обстановки, поскольку грызуны инстинктивно боятся открытых освещенных пространств. Пол камеры был расчерчен на квадраты 15x15 см. Крысу помещали в центр арены и в течение 5 минут регистрировали количество пересечённых квадратов (горизонтальная двигательная активность, или локомоторная активность), число вставаний на задние лапы, т.е. стоек (вертикальная двигательная активность, или исследовательская активность), длительность реакции груминга и время неподвижности (иммобилизация, или замирание). Тестирование животных в парадигме ВБ проводилось на 1, 5 и 10-е сутки после неизбегаемого стресса, а в парадигме «стресс-рестресс» - через сутки после рестресса. После каждого тестирования пол камеры протирался слабым раствором перекиси водорода. Количество животных в контрольных группах по п=12, в каждой опытной группе п=6-8.
Другим важным методом изучения стрессорного поведения животных является приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ). В дополнение к характеристике общей двигательной и исследовательской активности он даёт возможность исследовать тревожность животных, как одну их важных характеристик приспособительного поведения (Pellow et al., 1985). Преобладающим анксиогенным стимулом в ПКЛ является боязнь открытого пространства и высоты. Этот тест также применяется для анализа корректирующего эффекта анксиолитиков (Pellow and File, 1986; Rodgers and Cole, 1994). ПКЛ состоял из 2 открытых (10x50 см) и 2 закрытых рукавов без крыши (10x50x40см), имеющих входы в открытые рукава (10x20 см). Каждый рукав лабиринта был разделён на 5 равных квадратов (10x10см). Лабиринт располагался на высоте 75 см над уровнем пола. Основным показателем тревожности в этом тесте служило время, проведённое крысой в открытых рукавах лабиринта. Регистрировали время пребывания в открытых рукавах лабиринта в течение 5 минут на 11-е сутки после неизбегаемого стресса в парадигме ВБ и на 5-е сутки после рестресса в парадигме «стресс-рестресс». После каждого тестирования пол лабиринта протирали слабым раствором перекиси водорода. На основании подсчета времени, проведённого животным в открытых рукавах лабиринта, вычислялся коэффициент тревожности - 1/время в открытых рукавах. Чем меньше промежуток времени, проведённый животным в открытых рукавах ПКЛ, тем больше коэффициент тревожности. Количество животных в контрольных группах по п=12, в каждой опытной группе п=6-8.
Прекондиционирование нивелирует нарушения обучения и памяти, индуцируемые тяжелой гипоксией
Таким образом, проведенное исследование показало, что тяжелая гипобарическая гипоксия («подъем» животных на высоту 11000 м, 3 часа) приводит к выраженным структурным изменениям, развивающимся по «светлому» и «темному» типам в нейронах СА1, СА2, СА4 областях гиппокампа, фронто-париетальной области неокортекса и других областях коры крысы. Очевидно, у части нейронов, характеризующихся сильным хроматолизом, вакуолизацией цитоплазмы, образованием теней клеток, развивается некроз. Вместе с тем, большая часть поврежденных нейронов (пикнотические, хромофильные клетки) проявляет признаки апоптоза.
Схожая, но менее выраженная картина выявлена при длительном (в течение 4 дней) «подъеме» крыс на высоту 6400 м - это уровень гипобарической гипоксии, при котором в условиях хронической экспозиции у человека проявляются устойчивые неврологические расстройства (Shukitt-Hale et al., 1996; Kadar et al., 1998). В наших исследованиях применялось более жесткое острое экстремальное воздействие, приводящее к гибели более 50% животных. Судя по полученным результатам, такое воздействие индуцирует значительно более сильные нейродегенеративные повреждения в различных образованиях мозга, чем при предъявлении указанной выше модели гипоксии. сравнению с контролем, Р 0.05; , изменения достоверны по сравнению с ТГ, Р 0.05.
Обращает на себя внимание диффузная селективная локализация выявленных повреждений нейронов в различных образованиях мозга как в старой (древней) коре, так и неокортексе, похожая на ту, которая проявляется после ишемических воздействий (Lipton, 1999). Так, в гиппокампе наиболее уязвимыми структурами являются области СА1/СА2, СА4 и наименее - зубчатая извилина. Интересен также обнаруженный факт неодинакового развития во времени повреждения нейронов разных образований мозга. По всей видимости, в неокортексе они проявляются позже, чем в гиппокампе.
Используемая нами модель гипоксического прекондиционирования (2-х часовой трехкратный «подъем» на высоту 5000 м) оказалась достаточно эффективной для повышения структурной резистентности нейронов мозга к тяжелой гипоксии. Согласно клиническим наблюдениям, «подъем» на эту высоту, хотя и является сильным воздействием на организм, но не вызывает неврологических расстройств (Shukitt-Hale etal., 1996).
Как следует из полученных результатов, применяемое прекондиционирующее воздействие в значительной мере, хотя и не полностью, предотвращает развитие структурных повреждений нейронов мозга, индуцируемых тяжелой гипоксией. Выше указывалось, что подобный эффект обнаружен при использовании в качестве прекондиционирования сублетальных ишемических воздействий (Kirino et al., 1991; Kitagawa et al., 1990).
Оценка степени индукции апоптоза после ТГ в нейронах мозга непре- и прекондиционированных крыс: TUNEL метод.
Наряду с морфологическим анализом деструктивных изменений нейронов чувствительных областей после ТГ, выявившим обширные повреждения клеток по «темному» типу, проводилась детекция поврежденных по типу апоптоза нейронов с применением метода TUNEL. Этот метод позволяет выявлять «ранние» апоптотические клетки с фрагментацией ДНК, у которых еще слабо выражены морфологические изменения, характерные для апоптоза (Sanders and Wride, 1996). В связи с тем, что при глобальной ишемии, как хорошо известно, преобладает и несет наибольшую опасность индукция отсроченной волны нейронального апоптоза (через 2-3 суток), мы также использовали этот срок для мониторинга про-апоптотических изменений в нейронах после тяжелой гипобарической гипоксии.
У непрекондиционированных крыс через 3 суток после ТГ обнаруживалось большое количество TUNEL-позитивных клеток во всех исследованных областях мозга - СА1 (Рис.20, la), СА2-САЗ (Рис.20, На), СА4 (Рис.20, Ша) гиппокампа и фронтопариетальном неокортексе (Рис.20, IVa). Предварительная экспозиция животных прекондиционирующей умеренной гипоксии существенно снижала количество TUNEL-позитивных клеток в ответ на ТГ в этот период (Рис.20, IVb).
Следует отметить, что повреждения клеток мозга, выявленные нами после тяжелой гипобарической гипоксии, имели паттерн, в значительной степени отличающийся от описанного в ишемических моделях, а также после интервальной гипоксии. При интервальной гипоксии описана наибольшая уязвимость нейронов области СА1, в то время как нейроны вентральной зоны Аммонова рога гиппокампа (в частности, САЗ) оказались относительно устойчивы к повреждению (Gozal et al., 2002). Вместе с тем, при глобальной церебральной ишемии-реперфузии наибольшей уязвимостью характеризуются нейроны СА1 и СА4 гиппокампа и нейроны III и V слоев неокортекса (White et al., 1996). В наших исследованиях после тяжелой гипобарический гипоксии отмечалась приблизительно одинаковая степень структурных повреждений нейронов всех областей Аммонова рога (СА1, СА2, САЗ, СА4) и неокортекса. Это свидетельствует о том, что гипобарическая гипоксия индуцирует более генерализованные реакции, охватывающие все уязвимые отделы мозга. Тот факт, что предлагаемый нами способ ГП эффективно предотвращает возникновение генерализованных нейрональных повреждений вслед за гипобарической гипоксией свидетельствует о его мощном нейропротективном потенциале.
Таким образом, ГП с использованием умеренной гипобарической гипоксии по предложенной схеме оказывает выраженный нейропротективный эффект, предотвращая повреждения и гибель нейронов чувствительных областей мозга, а также запуск апоптоза вслед за тяжелой гипобарической гипоксией.
Установлено, что ГП предотвращает не только структурные, но и функциональные нарушения вслед за ТГ. В частности, у ГП крыс заметно нивелируются нарушения обучения и памяти, вызываемые ТГ, что было показано нами в экспериментах с использованием модели обучения рефлексу пассивного избегания. Изучали воспроизведение навыка пассивного избегания у крыс, обученных рефлексу за 60 мин до экспозиции ТГ.
Базисные молекулярно-клеточные механизмы нейропротекции, активируемые прекондиционированием гипобарической гипоксией
В эксперименте 2, когда ГП предшествовало рестрессу, анксиолитический эффект гипоксии оказался более значительным. В этом случае уровень тревожности животных снижался ниже контрольного уровня, о чем свидетельствует заметное увеличение побежек в центральных квадратах «открытого поля» и времени пребывания в центре ПКЛ (F,,,о=11.63, р=0.009 и F,.,о=12.35, /?=0.006) (рис.28). Наряду с этим достоверно возрастало число выходов в центр (12.17 vs. 4 в контроле, Fjo=9.228,/?=0.013) и входов в открытые рукава лабиринта (4.2 vs. 2 в контроле, Fjo=6.809, /7=0.026). Следует отметить, что при этом время пребывания этих крыс в открытых, потенциально более опасных, рукавах ПКЛ не отличалось от контроля (F\t\ f=0.0\3, р=0.9\ 1; рис.28,5), т. е., несмотря на заметный анксиолитический эффект, у животных сохранялось нормальное восприятие опасности, что является адаптивной реакцией. Кроме того, в отличие от антидепрессанта, ГП не снижало двигательную активность и не оказывало побочного эффекта на груминг в использованных тестах.
Таким образом, ГП при различных схемах предъявления оказалось эффективным а качестве воздействия, предотвращающего и корректирующего посттравматические нарушения стрессорного поведения крыс в модели тревожного расстройства (ПТСР). Важной задачей настоящей работы являлось не только изучение влияния ГП на ориентировочно-исследовательское поведение и уровень тревожности крыс при развитии ПТСР, но и проведение сравнительного анализа его эффектов с действием антидепрессанта паксила, широко применяемого в клинике для лечения ПТСР. Оказалось, что при трехкратном введении паксил оказывал заметное анксиолитическое действие, однако при этом наблюдался ряд побочных изменений (снижение вертикальной двигательной активности и груминга). При этой же схеме предъявления (трехкратно, на 4-й, 5-й, 6-й дни после травматического стресса) анксиолитический эффект гипобарической гипоксии оказался намного более значительным, при отсутствии побочного действия.
Как известно, симптоматика посттравматических тревожных расстройств и, в особенности, ПТСР включает в себя не только отклонения поведенческих показателей, но и характерный гормональный паттерн. Этот паттерн значительно отличается от нарушений функции ГАС, сопровождающих развитие депрессивных патологий, однако он также затрагивает процессы активации и регуляции ГАС. В отличие от депрессий, у больных ПТСР отмечается нормальная либо пониженная функция ГАС и ее сенситизация к сигналам глюкокортикоидной обратной связи (Yehuda et al., 1991b). При ПТСР наблюдается «включение» патологического, так называемого, быстрого торможения ГАС (fast feedback), которое, вероятно, составляет основу ведущего симптомокомплекса патологий данного типа - флешбек феномена (от англ. - flashback phenomenon). На основании этих клинических наблюдений был разработан гормональный тест, позволяющий выявлять «включение» патологического быстрого торможения в экспериментальных моделях на лабораторных животных (Liberzon et al., 1997). Мы использовали этот нагрузочный тест с целью выявления у экспериментальных крыс, наряду с поведенческими симптомами ПТСР, характерных гормональных нарушений, а также для исследования эффектов ГП на показатели быстрого торможения. Согласно классической методике, тест применяли у не- и прекондиционированных крыс спустя 7 дней после травматического стресса. Животные получали «нагрузку» экзогенно вводимым гормоном (гидрокортизон, 30 мкг/100 г/0.1 мл физ.р-ра, в/б), после чего сразу же помещались в узкие пластиковые пеналы на 30 мин (процедура, аналогичная рестрессу), и у них производили определение уровня кортикостерона через 3, 10, 30 и 60 мин. Наряду с этими, исходя из сведений о том, что у пациентов с ПТСР флэшбек феномен возникает при предъявлении ситуационных триггеров без экзогенной гормональной нагрузки, нами была добавлена экспериментальная группа ПТСР-м. Это предложенная нами модификация теста, в которой животным не производили инъекцию гидрокортизона.
Как следует из рис.29, у непрекондиционированных животных (группы ПТСР и ПТСР-м) уровень кортикостерона в крови к 60 мин сроку оказывался значительно ниже, чем на 30 минуте, то есть наблюдалась инактивация ГАС, вызванная включением быстрого (патологического) торможения. При этом следует отметить, что существенных различий между классическим вариантом теста (группа ПТСР) и предложенной нами модификацией (ПТСР-м) не выявлено - величина подавления стрессорного уровня (8 60-30) в обеих группах существенно не различалась (5птст= -199 и 8ПТСР-М= -178). У прекондиционированных крыс, также как и у контрольных, уровень гормона на 60-й минуте был не ниже, чем на 30-й, то есть продолжалась фаза активации ГАС, что характерно для нормальной динамики ГАС в ответ на стресс. Очевидно, что у прекондиционированных животных значительно повышается реактивность ГАС на стресс, что, возможно, представляет собой важное звено протективных механизмов, активируемых ГП, однако этот вопрос будет обсужден в отдельной главе (см. гл. 3.3.1.2.).
Обобщая результаты экспериментов по изучению эффектов ГП в моделях тяжелых гипоксических, стрессорных психоэмоциональных и травматических воздействий, изложенные в этой главе, можно заключить, что ГП в предложенном нами режиме оказывает мощное нейропротективное действие, предотвращая структурные и функциональные повреждения мозга в условиях тяжелых повреждающих воздействий. Исключительно важным как с теоретической, так и с практической точки зрения представляется тот факт, что нейропротективное действие ГП проявляется вне зависимости от модальности повреждающего фактора, то есть ггтоксическая толерантность мозга, формирующаяся в результате ГП, является универсальной, и этот феномен описан нами впервые. Ранее были известны случаи кросс-толерантности мозга к гипоксии, ишемии и токсинам, то есть факторам, механизмы повреждающего действия которых, включающие оксидативный стресс, во многом родственны (Gidday et al., 1994, 1999), Tauskela et al., 2001). В нашей работе удалось впервые продемонстрировать эффективность гипоксического прекондиционирования мозга по отношению к действию принципиально других повреждающих факторов -психоэмоциональных и травматических стрессов, патогенное действие которых основано на расстройствах системных и неспецифических механизмов адаптации. Таким образом, становится очевидным, что кросс-толерантность мозга — это явление универсальное, оно представляет собой неспецифическое повышение резистентности нейронов мозга.
В связи с этим имеются два важнейших аспекта — практический и теоретический. Прикладной аспект связан с тем, что наши данные существенно расширяют современные представления о терапевтическом потенциале гипобарической гипоксии, используемой в режиме ГП. Как хорошо известно, умеренная гипобарическая гипоксия - это естественное воздействие, встречающееся в природных условиях при подъеме в горы на определенную высоту.
