Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль ГАМКА-рецепторов в эпилепсии темпоральной зоны (обзор литературы) 15
1.1. Строение ГАМКд-рецепторов 15
1.1.1. Сайты связывания агонистов ГАМКд-рецепторов 15
1.1.2. Сайты связывания бензодиазепинов, барбитуратов, пикротоксина и стероидов 16
1.1.3. Молекулярная структура субъединиц ГАМКд-рецепторов 18
1.1.4. Хромосомная локализация генов ГАМКд-рецептора 23
1.1.5. Многообразие комплекса ГАМКд-ионных каналов 24
1.1.6. Фармакологические свойства субъединиц ГАМКд-рецептора 27
1.2. Хронические эпилептогенные изменения на клеточном уровне в лимбической системе 31
1.2.1. Анатомические изменения в лимбической системе при ЭТЗ 31
1.2.2. Изменения в ГАМКд-рецепторах из гиппокампа животных, больных ЭТЗ 37
1.2.3. Изменения ГАМКд-рецепторов, очевидные в синаптических реакциях 38
1.2.4. Изменения в транскрипции субъединиц ГАМКд-рецепторов . 39
1.2.5. Функция ГАМКд-рецепторов в эпилептических ЗФ-нейронах человека: корреляция с моделями животных 42
1.2.6. Прочие изменения в эпилептическом гиппокампе 44
Глава 2. Материалы и методы исследований 46
2.1. Подготовка экспериментальных животных 46
2.2. Выделение РНК 47
2.3. РНК-и слот-блот анализ 47
2.4. Синтез радиоактивных меток для РНК- и слот-блотов 48
2.5. Выделение одиночных нейронов 49
2.6. Электрофизиологические эксперименты: вольтаж-кламп рекординг 50
2.7. Полимеразно-цепная реакция на одиночных нейронах 51
2.8. Антисенс-РНК амплификация 55
2.9. Окрашивание срезов 60
2.10. Материалы 61
Результаты собственных исследований
Глава 3. Связанные с ЭТЗ изменения в молекулярной структуре ГАМКА-рецепторов в отдельных зонах мозга эпилептических животных 62
3.1. Результаты окрашивания по Тимму гиппокампа контрольных и эпилептических животных 62
3.2. Анализ изменений в экспрессии мРНК отдельных субъединиц ГАМКд-рецептора на тканевом уровне 64
3.3. Изменения в экспрессии мРНК субъединиц ГАМКд-рецептора в одиночных нейронах у эпилептических животных 69
3.3.1. Связанные с ЭТЗ изменения в молекулярной структуре ГАМКд-рецепторов в зоне Fascia Dentata гиппокампа хронически эпилептических животных 69
3.3.2. Изменения в молекулярной структуре ГАМКд-рецепторов в зоне Fascia Dentata гиппокампа в латентном периоде ЭТЗ 79
3.3.3. Изменения в экспрессии мРНК декарбоксилаз глутаминовой кислоты в гранулярных клетках из зубчатой фасции эпилептических животных 84
3.3.4. Связанные с эпилепсией изменения в молекулярной структуре ГАМКд рецепторов в зонах СА1 и САЗ гиппокампа 86
Заключение 92
Выводы 105
Литература 107
- Молекулярная структура субъединиц ГАМКд-рецепторов
- Антисенс-РНК амплификация
- Связанные с ЭТЗ изменения в молекулярной структуре ГАМКд-рецепторов в зоне Fascia Dentata гиппокампа хронически эпилептических животных
- Связанные с эпилепсией изменения в молекулярной структуре ГАМКд рецепторов в зонах СА1 и САЗ гиппокампа
Молекулярная структура субъединиц ГАМКд-рецепторов
Важнейшим достижением в определении молекулярной структуры ГАМКд-рецепторов было открытие возможности фотоафинно метить белок рецептора бензодиазепином [ Н]флунитразепамом (Mohler Н. et al., 1980). Одиночный полипептид был специфически помечен в грубом гомогенате мозга, имевший молекулярный вес 51 кДа (SDS-PAGE, электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Впоследствии была показана микрогетерогенность бензодиазепинового фотомечения - были выявлены второстепенные полосы 53, 55 и 59 кДа.
Эти дополнительные бензодиазепин-связывающие полипептиды отличаются по степени экспрессии в различных зонах мозга и в ходе онтогенеза, а также различаются по специфичности связывания (Sieghart W. and Drexler G., 1983), что соответствует наличию семейства генных продуктов. Эти данные были впоследствии подтверждены молекулярным клонированием.
Для сольюбилизации ГАМКд-рецепторов мембран мозга использовались разнообразные мягкие детергенты. Высокая степень сольюбилизации была получена с помощью деоксихолата. Хотя связывание ГАМК и бензодиазепинов достаточно стабильны в растворе Тритон Х-100, модулирование барбитуратами, байкукулином и связывание ТБПС хорошо сохраняются с помощью цвиттерионового детергента 3[(3-холамидопропил)диметил аммоний]-1-пропан сульфонат (CHAPS) в присутствии ингибиторов протеаз (Sigel Е. et al., 1983; DeLorey Т.М. and Olsen R.W., 1992). Очищенный рецептор содержал два основных полипептида - а, 51 кДа, и р, 56 кДа (данные SDS-PAGE). На основании этих данных был предположен гетероолигомерный комплекс весом 220-300 кДа (Sigel Е. et al., 1983). ct-полоса очищенного рецептора была фотоафинно помечена [ Н]флунитразепамом, в то время как р-полоса была помечена [ Н]мусцимолом (Deng L. et al., 1986; Stauber G.B. et al., 1987).
Впоследствии микрогетерогенность обеих полос была продемонстрирована посредством белкового окрашивания, фотоафинного мочения и иммуноблота (Bureau М. and Olsen R.W., 1990, 1993; Fuchs К. et al., 1990; Park D. and DeBlas A.L, 1991). To, что вначале представлялось двумя полипептидными полосами, наделе содержало более дюжины полипептидов сходного размера (Табл.2).
Основываясь на гомологии сиквенса, 19 известных у млекопитающих субъединиц ГАМКд-рецептора объединяют в 7 семейств (6а, 4р, Зу, 18, 1є, 1тс, Зр) (Burt D.R. & Kamatchi G.L, 1991; Barnard E.A. et al., 1998). Гомология сиквенса между семействами субъединиц достигает 30-40 %. Около 20-30 % гомологичности сиквенса существует между всеми субъединицами ГАМКд-рецептора и другими генными продуктами суперсемейства (Schofield P.R. et al., 1987; Olsen R.W. & Tobin A.J., 1990; DeLorey T.M. and Olsen R.W., 1992). Большинство семейств субъединиц имеет многочисленные субтипы (a1-6, pi-4, у1-3, 5, е, тг, р1-3). Сиквенсы внутри субъединичных семейств имеют гомолргию около 70-80%.
Дополнительное разнообразие возникает вследствие альтернативного сплайсинга эксонов на уровне предшественников мРНК, описанного для у2 (Whiting P.J. et а!., 1990; Kofuji P. et al., 1991), p2 (Harvey R.J. et al.,1994) и p4 (Bateson A.N. et al., 1991) субъединиц. В каждом случае пептидные продукты сплайсинга отличаются длиной внутриклеточной петли между 3 и 4 трансмембранными доменами. Явление сплайсинга известно и для других субъединиц, но он либо не влияет на белковую последовательность, либо такие сплайс-варианты субъединиц не образуют функциональных рецепторов. ДНК каждой субъединицы ГАМКд-рецептора кодирует полипептид около 50 кДа, с предполагаемыми сайтами N-гликозилирования и четырьмя ос-спиралевидными гидрофобными регионами, пронизывающими мембрану (Schofield P.R. et al., 1987; Olsen R. & Tobin A.J., 1990; Рис.2). Между третьим и четвертым трансмембранными доменами предположительно находится гидрофильный цитоплазматический участок с высокой вариабельностью сиквенса, который участвует во внутриклеточных регуляторных механизмах, таких как фосфорилирование.
Антисенс-РНК амплификация
Антисенс-РНК (аРНК) амплификацию одиночных нейронов проводили по методу J. Eberwine et al. (1992, 1997) с модификациями (Рис.5). Синтез первой цепи ДНК проводился в присутствии буфера, содержавшего 50 мМ Tris-HCI, рН 8.3, 150 мМ KCI, 10 мМ MgCl2, 10 мМ ДТТ, 0.5 mM dNTPs, 3 нг/цЛ oлигo(с!Т)T7 (Genosys), 1 U/цл RNasin (Promega), 1.5 U/ил обратной транскриптазы (AMV RT, Seikagaku America Inc.), ДЭПК-Н2О до конечного объема 30 ил. Реакцию инкубировали 90 мин при 42С. Образцы содержащие синтезированную первую цепочку ДНК, экстрагировали с помощью фенол-хлороформной смеси для удаления белков. Образцы преципитировали не менее 12 часов при -80С в 2.5 объемах этанола, 0.5 мМ NaCI с добавлением 5 цг tRNA.
Преципитат осаждали центрифугированием, растворяли в 20 ил ДЭПК-воды, денатурировали при 95С в течение 3 мин и быстро охлаждали на льду. Синтез второй цепочки ДНК проводили в растворе, содержавшем 100 мМ Tris-HCI, рН 7.4, 20 мМ KCI, 10 мМ MgCІг, 300 мМ (NH4)2S04, 250 uM dNTPs, 1 U Т4 ДНК полимеразы (Boehringer Mannheim), 2 и Кленов-полимеразы (Promega), ДЭПК-воды в конечном объеме 50 ил. Реакцию инкубировали не менее 14 часов при 14С. Образовавшиеся петли ДНК разрезали нуклеазой S1 (Boehringer Mannheim) при 37С 5 мин (1 и нуклеаза S1, 200 мМ NaCI, 50 мМ ацетат Na, рН 4.5, 1 мМ ZnS04). Затем образцы экстрагировали и преципитировали как описано ранее. Осадок растворяли в 18 цл ДЭПК-воды и затупливали концы дпухцомочсчмои ДНК с момощью Т4 ДНК полиморазы (1 U) и ДНК полимеразы Кленова (1 U) в растворе, содержавшем 20 мМ Tris-HCI, рН 7.5, 10 мМ MgCl2, 5 мМ ДТТ, 5 мМ NaCI, 250 цМ dNTPs при 37С 15 минут.
После экстракции и преципитации этанолом образцы растворяли в 20 цл ТЕ буфера и диализовали на фильтрах (0.025 цм, Mlllipore) не менее 4 часов против 40 мл ДЭПК-воды при комнатной температуре для снижения в образцах концентрации солей и несвязанных dNTPs. 25-50 % полученной ДНК использовали для первого круга аРНК амплификации в буфере, содержавшем 40 мМ Tris-HCI, рН 7.5, 7 мМ MgCl2, 10 мМ NaCI, 8 мМ ДТТ, 2 мМ спермидин, 1 U/цл RNasin, 40 U/дл Т7 РНК полимеразу (Epicentre Technologies), 250 JIM ATP, GTP, DTP, 50 цМ СТP и 15 пмоль a-32P-CTP (3000 Ci/mmol Amersham).
Для проверки успешности амплификации полученные образцы аРНК разделяли на агарозном геле, содержавшем 1.1 % формальдегид в 1х МОПС буфере. По окончании электрофореза гель отмывали в 10 % ТХУ и высушивали. Популяцию видов РНК визуализировали с помощью авторадиографии,
Один цикл амплификации, как правило, не является достаточным для использования в качестве маркера. Второй цикл амплификации подобен первому. аРНК из первого цикла экстрагировали фенол-хлороформной смесью и преципитировали этанолом. Осадок аРНК, растворенный в ДЭПК-воде, использовали для синтеза первой цепи ДНК в буфере, содержавшем 4 ng/ші гексамеров в качестве праймеров (Promega), 10 мМ ДТТ, 250 цМ dNTPs, 1 U/цл RNasin and 1 U/цл AMV RT в течение 90 мин при 42С. По окончании реакции образцы экстрагировали фенол-хлороформной смесью и преципитировали этанолом. Осадки растворяли в ДЭПК-воде, денатурировали при 95"С в течение 3 мин и быстро охлаждали на льду. Синтез двухцепочечной ДНК проводили в растворе, содержавшем 4 нг/цл oлигo(сГГ)T7 праймер, 250 цМ dNTPs, 2 U Т4 ДНК полимеразы и 5 U полимеразы Кленова при 14С не менее 14 часов. После экстракции фенол-хлороформной смесью и преципитации этанолом образцы диализовали как описано выше. Реакционная смесь повторной амплификации включала 25 пмоль а-32Р-СТР. Полученные в результате маркеры использовали для гибридизации со слот-блотами, содержавшими клоны ДНК.
Каждая мембрана содержала 14 ДНК клонов субъединиц ГАМКдР (выделены Dr. D. Pritchett, Dr. Е. Kirkness, Dr. Т.A. Morris, Dr. J. Eberwine), a также ДНК-клоны р-актина (выделен Dr. D. Pritchett), GFAP (glial fibrillary acidic protein, маркер глиального фенотипа, предоставлен Dr. J. Eberwine), нейрофиламентов NFL и NFM (маркеры нейронального фенотипа, дар Dr. J. Weiss) (Табл.7). Для- оценки неспецифического сигнала использовали плазмиду pBS SK- (Stratagene), в которую было склонировано большинство клонов. Для проверки идентичности все использованные клоны были секвенированы. Большинство клонов содержало полный кодирующий сиквенс. Исключение составляли а2 (100 Ьр), а4, у1 и 5 (все - более 1Kb), которые представляли собой дистальные З -фрагменты кодирующего сиквенса.
ДНК-клоны линеаризовали у З -конца соответствующими ферментами рестрикции в течение 3 часов при 37С и наносили на нейлоновую мембрану (Hybond-N+, Amersham) с помощью слот-блот аппарата, по 1 цг каждого клона. ДНК-блоты кросслинковали (Stratalinker, Stratagene) и прегибридизовали не менее 12 часов при 42С в растворе, содержавшем 50 % формамид, 5х SSC, 200 цд/мл salmon sperm DNA, 5Х раствор Денхардта, 0.1 % SDS, 1мМ пирофосфат Na, 10 % декстран. После двух циклов продукт аРНК-амплификации каждого нейрона, меченный а-32Р-СТР, денатурировали при 95С 3 мин, быстро охлаждали на льду и добавляли к прегибридизационному раствору, содержавшему один слот-блот. После гибридизации при 42С в течение 48 часов слот-блот отмывали в три этапа:
1. 2xSSC, 37С, 15 мин;
2. 1хSSC, 42С, 30мин;
3. 0.2х SSC, 0.1 % SDS, 42С, 30 мин.
После отмывки несвязанных радионуклеотидов слот-блоты визуализировали с помощью рентгеновской пленки. Для количественной оценки гибридизационных сигналов слот-блоты помещали в кассету для фосфоримиджинга.
Интенсивность гибридизационного сигнала определялась с помощью фосфоримиджинга и компьютерной программы ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Относительная величина экспрессии определялась как сигнал гибридизации одиночной субъединичной мРНК ГАМКд-рецептора, из которого вычитали величину неспецифического сигнала (pBS SK-), и результат делили на сумму гибридизационных сигналов всех субъединиц ГДМКдР в индивидуальной клетке. Статистический анализ (Стьюдент-тест, Манн-Витни тест) проводили с помощью программы SigmaStat (Jandel Scientific, San Rafael, CA).
Связанные с ЭТЗ изменения в молекулярной структуре ГАМКд-рецепторов в зоне Fascia Dentata гиппокампа хронически эпилептических животных
Вначале детектируемый уровень экспрессии мРНК субъединиц сс1, ос2 и а5 был проанализирован с помощью метода ПЦР в одиночных нейронах из зубчатой фасции (ЗФ) (Рис.10). Нами сравнивались процентное соотношение ЗФ-нейронов, в которых мы смогли обнаружить мРНК субъединиц ос1, сс2 и ос5 в клетках у контрольных и хронически эпилептических животных, ограничив анализ нейронами, в которых была выявлена по крайней мере одна из этих субъединиц (приблизительно 50% клеток, проанализированных с помощью ПЦР). Было обнаружено, что мРНК субъединицы х1 ГАМКд-рецептора присутствует только в 17% ЗФ-нейронов у эпилептических животных, по сравнению с 40% у контрольных животных (Рис.11). мРНК субъединицы а2 ГАМКд-рецептора была выявлена в 93% контрольных и 100% эпилептических ЗФ-нейронов, в то время как мРНК а5-субъединицы была детектирована в 53% контрольных и 33% эпилептических ЗФ-нейронов (Рис.11). Идентичность всех ПЦР-продуктов из этих одиночных нейронов была подтверждена с помощью ДНК-блотов. Эти данные предполагают, что в значительном количестве эпилептических ЗФ-нєйронов уровень экспрессии (ХІ-мРНК опустился ниже порога чувствительности применявшегося метода ПЦР, в то время как экспрессия других ct-субъединиц в этих клетках осталась на детектируемом уровне.
Таким образом, результаты этих ПЦР-экспериментов на одиночных нейронах могут означать, что одним из механизмов, влияющих на изменения свойств ГАМКд-рецепторов в гранулярных клетках из зубчатой фасции гиппокампа эпилептических животных может быть измененная транскрипционная продукция мРНК субъединиц ГАМКд-рецепторов.
Полуколичественный анализ экспрессии 14 субъединиц ГАМКдР в одиночных нейронах был осуществлен с помощью метода аРНК-амплификации. Одиночные гранулярные нейроны из зоны FD ПИЛО-крыс анализировали посредством сочетания метода пэтч-клампа целой клетки и профилирования экспрессии мРНК субъединиц ГАМКдР. Репрезентативный анализ одиночного гранулярного нейрона из FD ПИЛО-крысы, сочетающий пэтч-кламп рекординг целой клетки и мРНК-профиль экспрессии ГАМКдР субъединиц, представлен на рисунке 12. Эта клетка представляет собой пример значительно измененных функции и фармакологии ГАМКдР, характерных для эпилептических FD нейронов с минимальной аугментацией реакции на ГАМК золпидемом и значительной блокадой реакции на ГАМК цинком. Среднее значение эффективности ответа ГАМКдР (определенная как реакция клетки на аппликацию насыщающей концентрации ГАМК [1мМ]) было значительно увеличено в эпилептических FD-клетках (на 59%, Р 0.04; Рис.1 ЗА). Чувствительность ГАМКдР к блокаде цинком была увеличена на 64% (Р 0.001), в то время как чувствительность к аугментации Б31-селективным бензодиазепиновым агонистом золпидемом была снижена на 82% (Р 0.001) у эпилептических животных относительно контрольных (Рис.13Б,В).
По окончании электрофизиологического эксперимента содержимое клетки было всосано в микроэлектрод, и относительная экспрессия мРНК различных субъединиц ГАМКдР в контрольных и эпилептических FD нейронах была изучена с помощью метода аРНК-амплификации одиночных клеток. Такой подход позволил оценить, насколько мРНК профиль данного нейрона коррелировал с его наблюдавшимися функциональными изменениями (Рис.12). мРНК субъединиц ГАМКдР была амплифицирована и проанализирована на 13 контрольных и 23 эпилептических FD-нейронах (не менее 5 животных в каждой группе), в которых свойства ГАМКдР были охарактеризованы электрофизиологически.
Изучение рекомбинантных ГАМКдР показало, что содержащие сс1 субъединицу ГАМКд-рецепторы демонстрируют повышенную аугментацию золпидемом (рецепторы типа Б31) по сравнению с ГАМКдР, содержащими другие а-субъединицы (рецепторы типа Б32; Pritchett, D. et al., 1989а). Основываясь на значительно пониженной аугментации золпидемом в эпилептических FD-нейронах (Рис.13Б), можно предположить, что эти клетки экспрессируют относительно сниженное количество а1-мРНК по сравнению с мРНК других а-субъединиц.
Действительно, соотношение экспрессии сс1-мРНК к экспрессии мРНК остальных а-субъединиц в эпилептических ЗФ-нейронах было понижено на 40% по сравнению с контрольными нейронами (0.81+/-0.14 в контроле, 0.49+/-0.08 в эпилептических FD нейронах, Р 0.04), что находится в соответствии с пониженной золпидем-аугментацией ГАМК-тока в этих клетках {Рис.14А). Среднее значение величины экспрессии мРНК ос1-субъединицы относительно суммированной экспрессии мРНК всех субъединиц ГАМКдР было понижено на 27% в эпилептических FD-нейронах по сравнению с контрольными. В то же время экспрессия мРНК а4-субъединицы возросла на 45% в эпилептических FD-нейронах относительно контрольных (Р 0.05). В экспрессии мРНК субъединиц ос2, аЗ и а5 значительных изменений не произошло.
Чувствительность ГАМК-токов к блокаде ионами цинка была заметно выше в эпилептических FD-нейронах, чем в контрольных. Этому может способствовать снижение экспрессии а1-мРНК относительно других а-субъединиц, так как известно, что рекомбинантные ГАМКдР, содержащие сс4, а5 и а6 субъединицы, наряду с р и у субъединицами, значительно более чувствительны к ингибированию ионами цинка, чем рецепторы, содержащие а 1-субъединицу (White, G. and Gurley, D.A., 1995; Burgard, E.G. et al., 1996; Knoflach, F. et al., 1996; Saxena, N. and Macdonald, R., 1996; Fisher, J. and Macdonald, R., 1998). Ha чувствительность к ионам цинка также могут влиять изменения в субъединицах у, 8 и 8, Для рекомбинантных ГАМКдР, состоящих только из субъединиц аир, характерна повышенная чувствительность к блокаде ионами цинка, в то же время добавление у- или s-субъединицы существенно снижает чувствительность к ионам цинка (Draguhn, А. et al., 1990; Whiting, P.J. et al., 1997). Замещение у-субъединицы на б в a, (5-содержащих рекомбинантных ГАМКдР придает последним повышенную чувствительность к ионам цинка (Saxena, N. and Macdonald, R., 1994).
Основываясь на изучении рекомбинантных рецепторов, можно было бы ожидать значительных изменений в экспрессии у-субъединиц в эпилептических нейронах. Однако нами не наблюдалось существенных перемен в относительной экспрессии мРНК какой-либо из у-субъединиц (РИС.14Б). Экспрессия же мРНК 5- и s-субъединиц была повышена на 215% (Р 0.02) и 270% (Р 0.03), соответственно, в эпилептических по сравнению с контрольными нейронами (Рис.14Б). Учитывая, что колебания в уровне экспрессии мРНК могут приводить к изменениям в белковой экспрессии, такой сдвиг в относительном количестве 5- и 8-содержащих рецепторов по сравнению с у-содержащими рецепторами в комбинации с относительным снижением числа a1-содержащих реiіепторов мОЖРТ по крайней мере отчасти объяснять значительно повышенную чувствительность к ионам цинка в эпилептических FD-нейронах.
Существенные изменения произошли также в экспрессии мРНК р-субъединиц (Рис.145). Экспрессия мРНК р1-субъединицы понизилась на 41% в эпилептических FD-нейронах (Р 0.008), в то же время экспрессия мРНК рЗ-субъединицы возросла на 150% (Р 0.02). Известно, что природа р-субъединиц также влияет на свойства ГАМКд-рецепторов (Verdoorn, Т. et а!., 1990), эффективность бензодиазепинов (Sigel, Е. et аі., 1990; vonBlankenfeld, G. et al., 1990), аффинность ГАМК-аналогов и эффективность аллостерического модулирования барбитуратами, стероидами, ионами цинка и лореклезолом (Bureau, М. and Olsen, R., 1990; Donnelly, J. and Macdonald, R.,1996; Wooltorton, J. et a!., 1997). Однако специфические изменения в функциональных свойствах ГАМКдР в эпилептических FD-нейронах, которые могут быть ассоциированы с наблюдавшимися изменениями в экспрессии р-субъединиц, не были предметом изучения в данной работе.
Связанные с эпилепсией изменения в молекулярной структуре ГАМКд рецепторов в зонах СА1 и САЗ гиппокампа
Полуколичественный анализ экспрессии 14 субъединиц ГАМКдР в одиночных нейронах СА1 и САЗ был осуществлен с помощью метода аРНК-амплификации.
Наши исследования показали, что индивидуальные контрольные и эпилептические нейроны из зон СА1 и САЗ гиппокампа, также как и ЗФ-нейроны, экспрессируют огромное разнообразие субъединичных мРНК ГАМКд-рецептора (в среднем 8-9 видов мРНК ГАМКдР в одном нейроне; Рис.17, 18). аРНК амплификация позволила продемонстрировать, что в одиночных контрольных и эпилептических пирамидальных нейронах из зон СА1 и САЗ присутствуют мРНК многочисленных субъединиц ГАМКд-рецептора (сх1, а2, аЗ, а5, (31, (32, (33, у2, 8). Среди а-субъединиц наиболее проэкспрессированы в этих зонах были сс1, сх2 и а5 мРНК. Среди других классов субъединиц ГАМКдР. одиночные контрольные и ПИЛО-нейроны из зон СА1 и САЗ гиппокампа показали высокий уровень экспрессии мРНК субъединиц р1 и р2 и умеренные уровни экспрессии мРНК субъединиц у2 и 5. Это предполагает, что как в контрольных, так и в эпилептических СА1- и САЗ -нейронах присутствует значительное разнообразие композиции ГАМКдР. Относительные уровни экспрессии мРНК субъединиц ГАМКдР в одиночных А1- и САЗ-нейронах хорошо коррелируют с профилями ГАМКд-рецепторов экспрессии на тканевом уровне для большинства субъединиц (Wisden W. et al., 1992; Fritschy J.M., MohlerH., 1995).
В эпилептических нейронах из зоны СА1 гиппокампа мы обнаружили значительное снижение экспрессии мРНК ос5-субъединицы (61% от уровня контроля, Р 0.005, Рис.19). Аналогичное снижение экспрессии мРНК этой субъединицы было продемонстрировано в работах по in situ гибридизации на тканевом уровне (Houser C.R. and Esclapez М., 1996; Rice А. et al., 1996). Уровень экспрессии мРНК р, у и 5 субъединиц ГАМКдР не отличался существенно от контроля,
В эпилептических нейронах из зоны САЗ нами наблюдался значительный рост экспрессии мРНК р1-субъединицы (171.3% от уровня контроля, Р 0.05, Рис.20). Экспрессия мРНК 5-субъединицы была понижена и составила 64.1% от уровня контроля (Р 0.03). Изменения в экспрессии остальных субъединиц ГАМКдР в зоне САЗ гиппокампа не отличались существенно от контроля или не достигли статистической значимости.
Изменения в экспрессии мРНК отдельных субъединиц может иметь существенное значение для функции ГАМКд-рецептора в зонах СА1 и САЗ гиппокампа эпилептических животных. В связи с этим необходимы дальнейшие исследования для прояснения взаимосвязи между изменениями в рецепторной функции и экспрессией субъединиц в эпилептических СА1- и САЗ-нейронах.
