Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 11
2.1.Кальций в нервных клетках 11
2.1.1. Содержание ионов кальция в нейрона 11
2.1.2. Са + как универсальный вторичный посредник 12
2.1.3. Потенциал-зависимые кальциевые каналы 13
2.1.4. Рецептор-управляемые кальциевые каналы 17
2.1.5. Внутриклеточные кальциевые буферы 18
2.1.6. Внутриклеточные депо ионов кальция 24
2.1.7. Регуляция свободного кальция в цитоплазме 28
2.2. Функциональная роль ионов кальция в нервных клетках 29
2.2.1. Действие ионов кальция на поверхность возбудимой клетки29
2.2.2. Роль ионов кальция в генерации потенциалов действия в соме и в аксоне нейрона 31
2.2.3. Влияние ионов кальция на калиевые каналы 33
2.2.4. Другие функции ионов кальция внутри клетки 36
2.3. Пластичность и ассоциативное обучение 37
2.4. Роль ионов Са2+ в механизмах пластичности 41
3. Объекты и методы исследования 49
3.1. Объект исследования 49
3.2. Идентифицированные нейроны виноградной улитки 50
3.3. Выработка условного оборонительного рефлекса на постукивание по раковине 53
3.4. Введение кофеина 54
3.5 Препарат 54
3.6. Растворы, использованные в работе 55
3.6.1. Изменение внеклеточной и внутриклеточной концентрации кальция 55
3.6.2. Блокада потенциал-зависимых Са2+-каналов и Са2+-зависимых К+-каналов при изменении внутриклеточной концентрации кальция 56
3.6.3. Аппликация антител к белку S100 57
3.7. Регистрация электрических характеристик нейронов 57
3.7.1. Микроэлектроды 57
3.7.2. Установка для регистрации электрических характеристик клеточных мембран 58
3.7.3. Измерение электрических характеристик 59
4.Резулыаты исследований и их обсуждение 61
4.1. Исследование эффектов изменения концентрации внеклеточного кальция на электрические характеристики командных нейронов интактных улиток и улиток после выработки условного оборонительного рефлекса 61
4.1.1. Влияние различных концентраций ионов Са2+ на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток 61
4.1.2. Влияние блокатора потенциал-зависимых Са -каналов верапамила и блокатора Са +-зависимых К+-каналов хинина на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток 67
4.2. Исследование эффектов изменения содержания внутриклеточного кальция на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток 75
4.2.1. Влияние кофеина на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток 75
4.2.2. Влияние кофеина на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток в условиях блокады потенциал-зависимых Са"+-каналов верапамилом и блокады Са2+-зависимых К+-каналов хинином 78
4.2.3. Влияние внутриклеточной инъекции ЭГТА на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток 83
4.3. Исследование влияния антител к Са- связывающему белку S100 на электрические характеристики командных нейронов после обучения 87
4.4. Исследование эффектов хронического введения кофеина на выработку условного рефлекса у виноградной улитки 92
4.4.1. Формирование условного оборонительного рефлекса при хроническом введении кофеина 92
4.4.2. Исследование электрических характеристик командных нейронов интактных и обученных улиток после хронического введения кофеина 94
5. Заключение 98
6. Выводы 104
7. Литература 106
- Потенциал-зависимые кальциевые каналы
- Идентифицированные нейроны виноградной улитки
- Влияние различных концентраций ионов Са2+ на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток
- Исследование влияния антител к Са- связывающему белку S100 на электрические характеристики командных нейронов после обучения
Введение к работе
Актуальность исследования. Внутренний, глубинный уровень процессов, лежащих в основе поведенческих реакций представляет большой интерес для нейробиологии. Он связан с анализом нейронных механизмов поведения (Kandel E.R., Schwartz J.H., 1982; Goelet P. et al., 1986; Соколов E.H., 1992; Bailey C.H. et al., 1996). Современные представления об этих механизмах основываются на представлении о пластических свойствах нервных клеток и синаптической передачи (Гайнутдинов Х.Л., Штарк М.Б., 1986; Котляр Б.И., Пивоваров А.С. и др., 1989; Балабан П.М., Захаров И.С, 1992; McPhie D.L. et al., 1993; Balaban P.M., 1993). Среди исследователей поведения существует полное согласие в том, что углубление наших представлений о процессах памяти и обучения должно проистекать из знаний о клеточных и молекулярных механизмах этих процессов (Hawkins R.D. et al., 1993; Пивоваров А.С, 1995; Matzel L.D. et al., 1998; Balaban P.M., 2002). В данном случае речь идет о мембранных системах клетки, включая ионные каналы.
Популярным объектом исследования механизмов обучения и памяти являются моллюски, обладающие относительно простой нервной системой с идентифицируемыми клеточными элементами и достаточно сложным поведенческим репертуаром (Кэндел Э., 1980; Соколов Е.Н., 1981; Максимова О.А., Балабан П.М., 1983; Сахаров Д.А., 1992; Krasne F.B., Glanzman D.L., 1995; Никитин В.П., Судаков К.В., 1997). Показано, что моллюски способны к образованию как условнорефлекторноподобных, так и истинных условных рефлексов (Carew Т.J., Sahley C.L., 1986; Балабан П.М., Захаров И.С, 1992; Krasne F.B., Glanzman D.L., 1995; Гайнутдинов Х.Л. и др., 2002). Ранее в нашей лаборатории было показано, что в результате выработки условного оборонительного рефлекса в командных нейронах оборонительного рефлекса виноградной улитки снижаются мембранный и пороговый потенциалы этих нейронов, что свидетельствует о повышении их возбудимости (Гайнутдинова Т.Х., 2000). Так как ионы Са2+ являются регуляторами возбудимости нервных клеток и играют важную роль в процессах индукции ассоциативного обучения (Byrne J., 1987; Hawkins R.D. et al., 1993; Matzel L.D. et al., 1998), то представлялось необходимым в продолжение этих исследований провести
анализ роли кальциевой системы в проявлении долговременных эфектов обучения на электрофизиологические характеристики командных нейронов.
Ионы кальция играют чрезвычайно важную роль в регуляции разнообразных нейрональных процессов, что обусловлено их специфическими физико-химическими характеристиками, благодаря которым они являются наиболее универсальным внутриклеточным посредником (Brini М., Carafoli Е., 2000; Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф., 2002; Rizzuto R. et al., 2002; Kostyuk P., 2003; Berridge M.J., 2003). Ионы кальция, поступающие внутрь клетки во время ее возбуждения, с одной стороны приводят к изменению свойств ионных каналов мембраны, а с другой стороны служат сигналами для активации различных биохимических реакций. Таким образом, ионы кальция, осуществляя связь между электрическими явлениями, происходящими в поверхностной мембране клетки, и реакциями, протекающими внутри ее, принимают непосредственное участие в интегративной деятельности нервной клетки (Костюк П.Г., 1986; Berridge M.J., 1998; Северин Е.С. и др., 2001; Blackwell К.Т., AlkonD.L., 1999).
Известно, что кальций играет важную роль в долговременных формах пластичности (Hawkins R.D. et al., 1993). Речь идет, прежде всего, об индукции пресинаптического облегчения. В последнее время появились работы, показывающие, что при выработке условного рефлекса наблюдаются изменения на уровне постсинаптических нейронов (Murphy G.G., Glanzman D.L.. 1996). Так было показано, что внутриклеточное введение хелатора кальция ЭГТА в постсинаптический нейрон блокирует индукцию долговременной депрессии (Lin X.Y, Glanzman D.L., 1996), а инъекция СаС12 производит изменения, сходные с синаптическим облегчением (Malyshev A.Y., Balaban P.M., 1999). Было найдено, что определяющую роль при этом играет высвобождение ионов Са2+ из внутриклеточных депо, в то время как вход Са + через потенциал зависимые каналы имеет только дополнительный эффект (Talk A., Matzel L., 1996). Поэтому исследование роли кальциевой системы в проявлении долговременных эффектов обучения на характеристики нейрональной мембраны и ионных каналов представляются нам актуальными.
Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось исследование роли ионов кальция в электрогенезе командных нейронов при формировании условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Исследование влияния изменения внеклеточной концентрации кальция на электрические характеристики командных нейронов виноградных улиток после формирования условного оборонительного рефлекса.
Анализ эффектов изменения уровня внутриклеточного кальция на электрические характеристики командных нейронов улиток после формирования условного оборонительного рефлекса.
Исследование эффектов блокады Са- и Са-зависимых К-каналов на электрические характеристики командных нейронов виноградных улиток после формирования условного оборонительного рефлекса.
Изучение действия антител к Са-связывающему белку S100 на электрические характеристики командных нейронов улиток после обучения.
Исследование поведенческими и электрофизиологическими методами эффектов хронического введения кофеина на формирование условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки.
Положения, выносимые на защиту:
1 .После формирования условного оборонительного рефлекса в командных нейронах виноградной улитки снимается эффект стабилизации мембраны кальцием, который выражается в снижении порога генерации потенциалов действия при увеличении внеклеточной концентрации ионов кальция в противоположность его увеличению у интактных улиток.
2.При увеличении внутриклеточной концентрации ионов Са2+ порог генерации потенциалов действия командных нейронов снижается как у интактных, так и у обученных улиток, однако в условиях блокады Са- и Са-зависимых К-каналов у обученных улиток этот эффект пропадает. Снижение внутриклеточной концентрации ионов Са + приводит к повышению порога генерации потенциала действия у интактных, но не у обученных улиток.
3.Ежедневная инъекция кофеина улиткам сразу после процедуры обучения увеличивает скорость формирования условного оборонительного
рефлекса по сравнению с группой активного контроля. Хроническая инъекция кофеина сопровождается снижением порога генерации потенциала действия командных нейронов за счет снижения мембранного потенциала.
Научная новизна. Впервые экспериментально показано, что у обученных улиток отменяется стабилизирующий эффект ионов кальция на плазматическую мембрану, который обнаруживается у интактных улиток.
Повышение внутриклеточной концентрации ионов Са~+ кофеином снижает порог генерации потенциалов действия командных нейронов как у интактных, так и у обученных улиток, блокатор потенциал-зависимых Са-каналов верапамил и блокатор Са- зависимых К- каналов хинин снижают мембранный потенциал командных нейронов и увеличивают продолжительность потенциала действия.
Среди спонтанно активных идентифицированных нейронов виноградной улитки определены клетки, отвечающие на аппликацию антител к Са-связывающему белку S100 как увеличением, так и уменьшением частоты генерации потенциалов действия. Аппликация антител к Са- связывающему белку S100 приводит к снижению величины мембранного потенциала, причем в группе обученных улиток такое смещение почти вдвое меньше чем в группе интактных.
Впервые найдено, что хроническая инъекция кофеина сразу после процедуры обучения увеличивает скорость формирования условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки по сравнению с улитками активного контроля и показан деполяризационный сдвиг мембранного потенциала командных нейронов после хронической инъекции кофеина.
Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли ионов кальция в механизмах обучения и сохранения долговременной памяти. Установление факта отмены эффекта стабилизации мембраны кальцием после формирования условного рефлекса позволяет по-новому подойти к роли ионов Са + не только в индукции пластичности, но и в сохранении изменений, наступивших после обучения. Повышение порога генерации потенциала действия у интактных улиток при внутриклеточной инъекции кальциевого хелатора ЭГТА и отсутствие этого
10 эффекта у обученных улиток позволяет уточнить роль уровня внутриклеточного кальция в сохранении следов памяти. Результаты, свидетельствующие об увеличении скорости формирования условного оборонительного рефлекса при хроническом введении кофеина сразу после процедуры обучения, а также эффекты верапамила позволяют объяснить механизм действия кальциевых препаратов.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговых конференциях Казанского научного центра РАН (Казань, 2000-2005 гг), на 6, 7. 8 Всероссийских школах молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии» (1999, 2000, 2001 гг), Central European Conference of Neurobiology, (Krakow, Poland, 2001 r), XVIII съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова, (Казань 2001 г), 6-ой, 7-ой и 9-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино 2002, 2003, 2005 гг), VI и VII Всероссийских симпозиумах "Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке" (Казань, 2002 г и Набережные Челны, 2004 г.) Jerzy Konorski Memorial: Integrative Activity of the Brain (Варшава, 2003 г), Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kaliningrad, 2003 r), III съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004 г), XIX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова, (Екатеринбург 2004 г), Всероссийской конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005 г).
Реализация результатов исследования. Материалы исследования отражены в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, и в 20 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 128 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, главы результатов исследования, общего их обсуждения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 264 источников, из них 183 - иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 21 рисунком и содержит 3 таблицы.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Потенциал-зависимые кальциевые каналы
Как и другие клетки нейроны используют и вне-, и и внутриклеточные ресурсы кальция. Вход ионов кальция извне регулируется потенциал-зависимыми и рецептор-управляемыми каналами. Например, потенциал-зависимые Са- каналы используются для инициации высвобождения медиатора в синапсе и способствуют развитию дендритных потенциалов действия (Berridge M.J., 1998; Бухараева Э.А., 2001; Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф., 2002). Эти каналы кроме ионов кальция пропускают также другие двухвалентные катионы, но не пропускают одновалентные катионы. Исследования показали, что кальциевые каналы пропускают двухвалентные катионы в предпочтительной последовательности Ba Sr Ca Mg, с помощью расположенной внутри канала связывающей группировки, Другие двухвалентные катионы (Со, Ni, Mn, Cd), связывающиеся с этой группировкой слишком сильно, становятся конкурентными блокаторами каналов. При отсутствии двухвалентных катионов во внеклеточной среде кальциевые каналы теряют свою селективность и начинают эффективно пропускать одновалентные катионы. Причиной такой трансформации является отрыв связанных ионов кальция от особой регулирующей группировки в устье кальциевых каналов, о чем говорят результаты, свидетельствующие об обратимом превращении кальциевых каналов в натриевые при полном удалении двухвалентных катионов из внеклеточной среды посредством введения кальций-хелатирующих веществ (Костюк П.Г., Крышталь О.А., 1981). В то же время такие каналы по-прежнему блокируются фармакологическими веществами, специфически блокирующими кальциевые каналы и не влияющие на натриевые (производные верапамила и нифедипина), они даже становятся к ним более чувствительными (Костюк П.Г., Шуба Я.М., 1982). Характерной чертой потенциал-зависимых кальциевых каналов возбудимых мембран является их способность активироваться только под влиянием изменения трансмембранного электрического поля. В состоянии покоя (при высоком уровне мембранного потенциала клетки) эти каналы закрыты, и ионы кальция через мембрану не проходят. Потенциал-зависимые кальциевые каналы, таким образом, могут существовать в двух функциональных состояниях - проводящем и непроводящем. Переход между этими состояниями сопровождается внутримембранным перемещением зарядов - "воротным током". При длительной деполяризации мембраны кальциевые каналы переходят в инактивированное состояние, которое связано с возвратным блокирующим действием на каналы проникших в клетку ионов кальция (Костюк П.Г., 1984).
В восьмидесятые годы появились данные о возможной неоднородности популяции кальциевых каналов. Так, на диализированных изолированных нейронах спинальных ганглиев крыс было обнаружено два типа кальциевых каналов, " быстрые" или низкопороговые каналы - активирующиеся при мембранных потенциалах от -70 до -65 мВ и "медленные" или высокопороговые, активирующиеся при деполяризации до -45 мВ (Веселовский Н.С., Федулова С.А., 1983). В дальнейшем на основе чувствительности к дигидропиридинам высокопороговые кальциевые каналы были разделены на L-тип (long-lasting) - дигидропиридин-чувствительные и N-тип (neither Т nor L) -дигидропиридин-нечувствительные (Reuter Н. et al., 1985; McCleskey E.W. et al., 1986). Р-тип (Purkinje) высокопороговых кальциевых каналов был обнаружен в клетках Пуркинье мозжечка, его свойства схожи со свойствами каналов Q-типа и поэтому их объединяют в P/Q-тип кальциевых каналов (Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф., 2002). Низкопороговые каналы, которые активируются и инактивируются при низких значениях мембранного потенциала получили название каналы Т- тип (transient) (McCleskey E.W. et al., 1986; Yunker A.M.R., McEnry M. W., 2003). Известно, что каналы N-типа вносят вклад в такие виды пластичности, как пресинаптическое торможение, гомосинаптическую депрессию и пресинаптическое облегчение (Edmonds В. et al., 1990; Brini М, Carafoli Е., 2000).
Наиболее изученными являются каналы L-типа. Они состоят из 5 субъединиц: al, a2, р, у, 5. а2 и б связанны с дисульфидными цепями. Субъединица al, которая содержит сам Са +-канал, а также субъединицы у, 5 находятся непосредственно в пределах мембраны, в то время как субъединица а2 расположена за пределами мембраны с внеклеточной стороны мембраны а 3 с внутриклеточной (Sather W.A. et al., 1993; Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф., 2002; Крутецкая З.И. и др., 2003). Наиболее решающей субъединицей в функционировании канала является al: она имеет такое же строение, как и в других потенциал-зависимых каналах, то есть служит сенсором напряжения. Роль других субъединиц пока не выяснена, однако известно что субъединица 6 фосфорилируется протеинкиназой А, что ведет к увеличению вероятности открытого состояния канала (Brini М., Carafoli Е., 2000).
Активность электроуправляемых кальциевых каналов может находиться под прямым метаболическим контролем. Впервые представление об этом было высказано на основании изучения кальциевых входящих токов в сердечных мышечных волокнах. Известно, что такие токи существенно потенцируются под действием катехоламинов. Как показал Ройтер, параллельно с потенциацией ионных токов происходит увеличение содержания 3 ,5 -цАМФ внутри клеток (Reuter Н., 1974). На основании представлений о роли циклических нуклеотидов и катализируемого ими фосфорилирования клеточных белков было высказано предположение, что усиление кальциевого компонента сердечного потенциала действия под влиянием катехоламинов опосредуется через активацию синтеза цАМФ аденилатциклазой и последующее фосфорилирование цАМФ-зависимой протеинкиназой белков, имеющих отношение к поддержанию кальциевой проводимости мембраны (Greengard Р., 1979). Как показали специальные исследования, при этом эффекте не происходит изменения селективности или кинетических характеристик кальциевых токов; следовательно, предполагаемое фосфорилирование увеличивает число работающих каналов. Анализ роли цАМФ в функционировании одиночных кальциевых каналов показал, что основным при этом является увеличение времени их пребывания в открытом состоянии (Reuter Н. et al., 1983). При регистрации синаптического действия, оказываемого определенным нейроном моллюска аплизии на другой нейрон, было обнаружено усиление этих процессов под влиянием внеклеточного приложения серотонина. Такое же действие оказывала инъекция цАМФ внутрь нейрона или инкубация ганглия в растворе, содержащем блокатор фосфодиэстеразы - фермента, расщепляющего цАМФ внутри клетки. Так как входящий ток кальция является непременным посредником в осуществлении синаптического действия, был сделан вывод, что серотонин усиливает такой ток посредством повышения внутриклеточного уровня цАМФ (Shimahara Т., Tauc L., 1977; Klein М., Kandel E.R., 1980). В экспериментах с применением метода перфузии клетки было показано, что по мере замещения цитоплазмы искусственной солевой средой происходило прогрессивное уменьшение амплитуды кальциевого тока, при этом скорость ослабления тока была существенно более медленной, чем скорость замещения цитоплазмы внутриклеточной среды (Костюк П.Г. др., 1984). Наиболее успешно такое нарушение кальциевой проводимости мембраны можно предотвратить при совместном введении в перфузирующий раствор цАМФ, АТФ и ионов Mg2+. Перфузия клетки АТФ- и Mg-содержащим раствором не приводила к восстановлению тока. Удаление АТФ из раствора снимало эффект цАМФ. Таким образом, факторы, которые могут изменить уровень эндогенного цАМФ в перфузируемой клетке, оказывают на кальциевую проводимость соматической мембраны такое же регулирующие влияние, как и введение внутрь клетки экзогенного цАМФ.
Идентифицированные нейроны виноградной улитки
У виноградной улитки наиболее полно описана нейронная структура оборонительного рефлекса закрытия дыхательного отверстия (пневмостома) (рис. 1). Закрытие дыхательного отверстия реализуется через командные нейроны оборонительного поведения левого и правого париетальных ганглиев (рис. 2), которые относятся к эфферентному звену этого безусловного рефлекса, так как импульсный разряд каждого из этих нейронов, вызванный внутриклеточным разрядом, приводит к реализации оборонительной реакции закрытия дыхальца. К настоящему времени в ЦНС улитки обнаружены девять нейронов париетальных и плевральных ганглиев, которые можно отнести к классу командных - ЛПаЗ, ППаЗ, ЛПа2, ППа2, ЛПа5, ЛПлІ, ЛПл2, ППл1, ППл2. Основной отличительной чертой этих нейронов является отсутствие фоновых потенциалов действия на препарате изолированной ЦНС и крайне редкие спайки синаптического происхождения на полуинтактном препарате. Порог генерации потенциала действия у этих нейронов значительно выше, чем у спонтанно-активных. Особенностью сенсорного входа является необычайно широкое рецептивное поле. Моторное поле девяти изученных командных нейронов представляет собой все эффекторы, реагирующие при нанесении опасных стимулов, т.е. система командных нейронов обеспечивает реализацию оборонительных реакции виноградной улитки. В то же время каждый командный нейрон обеспечивает запуск отдельного поведенческого акта, входящего в целостное оборонительное поведение (Балабан П.М., Захаров И.С, 1992). В висцеральном ганглии найдены спонтанно-активные нейроны, по косвенным характеристикам представляющие собой группу мотонейронов. Видимо, они действуют как пул, поскольку внутриклеточная активация только одного из них не приводит к движениям (Максимова О.А., Балабан П.М., 1983; Иерусалимский В.Н. и др., 1992). На этот пул оказывают влияние командные нейроны закрытия пневмостома. При закрытии пневмостома в ответ на тактильное раздражение в мотонейронах закрытия наблюдалось учащение спайков, а в мотонейронах открытия - урежение (Гайнутдинов Х.Л. и др., 1989; Балабан П.М., Захаров И.С, 1992). А во время открытия пневмостома в мотонейронах открытия наблюдалось восстановление частоты спайков. а в мотонейронах закрытия пневмостома - урежение. Сенсорную часть оборонительного рефлекса закрытия дыхательного отверстия представляют идентифицированные нейроны - ЛПа7 и ППа8 (Логунов Д.Б., 1983; Balaban P.M., 2002). Экспериментально установлено, что эти нейроны моносинаптически связаны со всеми командными нейронами оборонительного рефлекса возбудительными связями, поэтому их можно отнести к элементам афферентного звена данного рефлекса. При исследовании идентифицированной моносинаптической связи между нейронами ЛПа7, ЛПа8 и гигантскими нейронами ЛПа2. ЛПаЗ. ППаЗ, было выявлено, что после разрядов пресинаптических нейронов ЛПа7 и ЛГ1а8 в командных нейронах безусловного оборонительного рефлекса закрытия дыхальца виноградной улитки возникают "быстрые" и "медленные" возбудительные постсинаптические потенциалы (ВПСП), причем для определенного синаптического контакта амплитуда быстрого ВПСП находится в линейной зависимости с амплитудой последующего медленного ВПСП, кроме того, медленные ВПСП обладают свойством суммации (Логунов Д.Б., 1983).
Наши исследования проводились на идентифицированных командных нейронах оборонительного рефлекса закрытия пневмостома ЛПаЗ, ППаЗ, ЛПа2 и ППа2, находящихся в правом и левом париетальных ганглиях нервной системы виноградной улитки. Они обладают достаточно крупными размерами до 250-300 мкм, и являются молчащими нейронами (Максимова О.А., Балабан П.М., 1983; Иерусалимский В.Н. и др., 1992). Всего было исследовано 300 нейронов ЛПаЗ. ППаЗ. ЛПа2 и ППа2. В экспериментах по исследованию влияния антител к белку S100 на электрические характеристики нейронов объектами исследования также были спонтанно-активные нейроны висцерального ганглия В4, В6. В10, В17 (рис. 2).
Одной из наиболее удобных и хорошо изученных форм поведения у улиток является оборонительное поведение (Захаров И.С, 1992). Виноградная улитка не имеет средств активной защиты от врагов и почти на любое раздражение отвечает комплексом пассивно-оборонительных реакций, в который входят реакции втягивания щупалец (омматофоров), закрытие дыхательного отверстия (пневмостома) и втягивание всего тела в раковину. Схема по которой вырабатывали классический условный оборонительный рефлекс (УОР) на постукивание по раковине была предложена группой исследователей в 70-х годах (Литвинов Е.Г. и др., 1976; Максимова О.А., Балабан П.М., 1983). В качестве условного стимула использовались постукивания по раковине, которые в норме не вызывали оборонительной реакции у улитки. Безусловным стимулом служило вдувание струи воздуха в отверстие легочной полости, что вызывало у животных безусловную оборонительную реакцию закрытия пневмостома. Условные стимулы предъявлялись в течение 3 секунд с интервалами 2-4 минуты. Подкрепляющее раздражение подавали одновременно с окончанием действия условного стимула. Условные ответы на постукивание по раковине появлялись уже в первом опыте, количество их быстро достигало 40% общего количества применения условного стимула в опыте. В дальнейшем число условных ответов без ярко выраженных колебаний возрастало и после 210 сочетаний достигало 97%, на этом рефлекс стабилизировался (Максимова О.А., Балабан П.М., 1983).
Мы вырабатывали классический условный оборонительный рефлекс на постукивание по раковине у 80 интактных улиток, у 36 улиток после инъекции кофеина и у 11 улиток после введения солевого раствора. В качестве УС использовали постукивание по раковине. БС служило вдувание струи воздуха в отверстие легочной полости. Сочетания стимулов предъявляли с интервалом 2-4 мин., рефлекс вырабатывался в течении недели, в день предъявлялось 60 сочетаний условного и безусловного стимулов. Результатом такого обучения являлось полное закрытие пневмостома в ответ на условный стимул, что отмечалось как положительная реакция.
Влияние различных концентраций ионов Са2+ на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток
В семидесятых годах было высказано предположение, что возбуждение -это процесс, сопровождающийся переходами между двумя устойчивыми конформационными состояниями образующих ее полярных макромолекул. Эти мембранные макромолекулы несут полярные группы и фиксированные заряды и играют роль катионообменника (Тасаки И., 1971; Геннис Р., 1997). Устойчивое состояние покоя обеспечивается в основном двухвалентными катионами из внешней среды, которые связываются с анионными участками мембраны. Сравнение эффектов замещения ионов Са + в среде на ионы Mg + позволило И.С.Магуре с сотрудниками сделать заключение, что ионы Са преимущественно экранируют поверхностные заряды (Магура И.С. и др., 1979). Однако позднее при сравнении натриевых и кальциевых токов в соматической мембране моллюсков было показано наличие эффектов связывания ионов Са + с фиксированными зарядами (Дорошенко П.А. и др., 1980). Наиболее вероятными связывающими группировками на клеточной мембране могут быть фосфатидильные остатки, которые при диссоциации переходят в ионизированное состояние (Костюк П.Г., Крышталь О.А., 1981; Тасаки И., 1971; Генис Р., 1997). В устойчивом возбужденном состоянии эти участки заняты главным образом одновалентными катионами, которые в процессе возбуждения переносятся на внешнюю сторону мембраны из внутриклеточной жидкости (Тасаки И., 1971). Таким образом, ионы Са нейтрализуют отрицательные фиксированные заряды на наружной стороне мембраны и поэтому повышение внеклеточной концентрации ионов Са+ приводит к снижению общего наружного отрицательного заряда и увеличению отрицательного потенциала, действующего на ионные каналы (Костюк П.Г., 1986; Магура И.С, 1981). Сами по себе эти фиксированные заряженные группировки не должны вносить прямой вклад в измеряемый мембранный потенциал, что определяется их малой плотностью на мембране (Костюк П.Г., Крышталь О.А., 1981). Однако в комбинации с диффузионными потенциалами они могут изменять внутримембранное электрическое поле, которое определяет потенциалзависимую активацию ионной проводимости мембраны (Костюк П.Г., Крышталь О.А., 1981; Ходоров Б.И., 1975). В настоящей работе на интактных улитках мы также показали, что повышение внеклеточной концентрации ионов Са+ ведет к увеличению значения порогового потенциала и смещению величены критического уровня деполяризации в сторону положительных значений в применении к командным нейронам оборонительного поведения. Это свидетельствует о снижении возбудимости этих нейронов, которое происходит при «стабилизации» мембраны. Однако нами было обнаружено, что возбудимость плазматической мембраны нейронов обученных улиток повышается при увеличении внеклеточной концентрации ионов Са +, хотя у интактных улиток повышение внеклеточной концентрации ионов Са2+ ведет к стабилизации мембраны. По-видимому, при обучении величина наружнего отрицательного заряда уменьшается, возможно, вследствие изменения конформации мембранных макромолекул, и в результате этого снимается стабилизирующий эффект ионов Са2+. Увеличение же возбудимости при повышении внеклеточной концентрации ионов Са + может свидетельствовать о том, что ионы Са2+ активно входят в нейрон через потенциал зависимые Са-каналы и, по-видимому, сами ионы Са2+ непосредственно участвуют в развитии потенциала действия (Геннис Р., 1997). Уменьшение внеклеточной концентрации ионов Са2+ до 5мМ в группе обученных улиток не приводило ни к увеличению, ни к снижению возбудимости командных нейронов. Это подтверждает факт, что ионы Са2+ вне клетки не влияют непосредственно на отрицательный заряд на наружной части мембраны, однако при достаточно сильном снижении наружной концентрации ионов Са + до 2.5мМ возбудимость увеличивается.
Таким образом, у интактных улиток с увеличением внеклеточной концентрации кальция снижается возбудимость командных нейронов, и в этом проявляется свойство кальция как стабилизатора мембраны. Однако этот эффект кальция пропадает у обученных улиток, что свидетельствует об изменениях, происходящих при обучении на мембране нейронов.
В последние годы накапливаются сведения о вовлечении в механизм ассоциативного обусловливания также и изменения мембранных характеристик постсинаптических структур и свойств внутриклеточной сигнализации (Lin X.Y., Glanzman D.L., 1994; Murphy G.G., Glanzman D.L., 1996; Bao, J.X. et al., 1998; Malyshev A.Y., Balaban P.M., 1999; Bailey C.H., et al., 2000; Schaffhausen, J.H. et al., 2001). Известно, что при ассоциативном обучении происходит повышение возбудимости сенсорных и командных клеток (Литвинов Е.Г., Логунов Д.Б., 1979; Klein М. et al., 1980; Максимова О.А., 1980; Davis W.J., 1986). Работы по исследованию механизмов классического условного рефлекса у моллюска Hermissenda показали, что в ходе выработки ассоциативного обучения были отмечены продленный деполяризационный сдвиг мембранного потенциала, длительное увеличение амплитуды и увеличение скорости инактивации быстроинактивирующегося К- тока в фоторецепторах типа В (Alkon L.D., 1984; Crow Т., Forrester J., 1993; Frysztak R.J., Crow Т., 1997). Долговременная деполяризация мембраны и увеличение возбудимости сопровождаются также повышением внутриклеточной концентрации Са2+, которую можно регистрировать с помощью красителя fura-2 (Muzzio LA. et al., 1999). Показано, что ключевую роль в экспрессии клеточных изменений, важных для ассоциативного обучения, у Hermissenda играет увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са +, которая, в свою очередь, увеличивается за счет входа ионов Са + через потенциал-зависимые каналы и их выхода из внутренних депо клетки через каналы рианодиновых рецепторов (Talk A., Matzel L., 1996; Blackwell К.Т., Alkon D.L., 1999). Видимо, в процедуре выработки условного рефлекса кальциевый ток из-за своей медленной инактивации создает возможность ассоциирования стимулов, пришедших в разное время (Matzel L.D. et al., 1998). В идентифицированных нейронах плевробранха показаны явление Са-зависимого увеличения продолжительности потенциала действия и модуляция залповой активности (Gillette R. et al., 1982; Kovac M.P. et al., 1985). Увеличение продолжительности потенциала действия, зависимое от входа Са + в клетку, обнаружено после обучения в механоафферентных нейронах аплизии (Walters Е.Т., Byrne J.H., 1983; Hawkins R.D., 1984; Billy A., Walters E., 1989; Abrams T.W. et al, 1991; Murphy G.G., Glanzman D.L., 1996). В премоторных интернейронах оборонительного рефлекса виноградной улитки при использовании полуинтактного препарата было найдено появление реакций на пищевой стимул в форме деполяризационного сдвига мембранного потенциала, сопровождающегося возбуждающим постсинаптическим потенциалом, которые через 90-120 минут проявлялись в виде хорошо выраженной спайковой активности (Максимова О. А., Балабан П.М., 1983). Эти результаты свидетельствуют о большой значимости в исследованиях мембранных механизмов ассоциативного обучения таких характеристик, как мембранный потенциал покоя и порог генерации потенциалов действия. Поэтому следующая серия экспериментов была посвящена сравнению влияния блокаторов ионных каналов на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток.
Исследование влияния антител к Са- связывающему белку S100 на электрические характеристики командных нейронов после обучения
Критическая роль внутриклеточного кальция доказана для посттетанической потенциации, гетеросинаптического облегчения, долговременного торможения, сенситизации, ассоциативного обучения (Hawkins R. D. et al., 1993; Lin X.Y., Glanzman D.L., 1994; Bao, J.X et al., 1998; Malyshev A.Y., Balaban P.M., 1999; Bailey, C.H. et al., 2000; Никитин В.П., Козырев C.A., 2002). Было показано, что пресинаптическое облегчение сопровождается увеличением продолжительности потенциалов действия, генерируемых в сенсорном нейроне и увеличением амплитуды ВПСП в мотонейроне (Klein М. et al., 1980; Hawkins R.D., 1984; Braha О. et al., 1990; Sugita S. et al., 1994). Имеющиеся в литературе результаты указывают, что поступление Са в терминаль является необходимым условием пресинаптического облегчения (Eliot L.S. et al., 1993; Hawkins R.D. et al., 1993).
Известно, что кальций играет важную роль в долговременных формах пластичности. Речь идет, прежде всего, об индукции пресинаптического облегчения. В последнее время появились работы, показывающие, что при выработке условного рефлекса наблюдаются также изменения на уровне постсинаптических нейронов (Murphy G.G., Glanzman D.L., 1996). На уровне постсинаптического нейрона было показано, что внутриклеточное введение хелатора кальция ЭГТА блокирует индукцию долговременной депрессии (Lin X.Y., Glanzman D.L., 1994), а инъекция СаСІг в постсинаптический нейрон производит изменения, сходные с синаптическим облегчением (Malyshev A.Y., Balaban P.M., 1999). Было найдено, что определяющую роль при этом играет высвобождение ионов Са2+ из внутриклеточных источников хранения, в то время как вход Са2+ через потенциал зависимые каналы имеет только дополнительный эффект (Talk A., Matzel L., 1996).
Bao J.X. et al. (1998) на клеточной культуре нашли, что инъекции медленного кальциевого хелатора ЭГТА и быстрого ВАРТА сильно ослабляли облегчение ВПСП, вызванное сочетанной стимуляцией, но не влияли на облегчение в ответ на несочетанную стимуляцию, либо только на серотонин (Bao J.X. et al., 1998). Исследователи не обнаружили аддитивности пре- и постсинаптического механизмов, что свидетельствует об их взаимном влиянии и тесном переплетении. Недавно появилась работа, демонстрирующая, что постсинаптическая Са-компонента посттетанической потенциации у аплизии необходима только для синапса от сенсорных нейронов к моторным, а для других синапсов она не обязательна (Schaffhausen J.H. et al, 2001).
Было найдено, что первичными клеточными коррелятами ассоциативного обучения у гермиссенды служат изменения свойств фоторецепторов типа В -специфичная для сочетанных стимулов деполяризация, которая накапливается с каждым последующим опытом (Alkon D.L., 1984). Значительным эффектом обучения является также повышение входного сопротивления фоторецепторов типа В (Shuman T.V., Clark G.A., 1994; Muzzio LA. et al., 1997). Долговременная деполяризация мембраны и увеличение возбудимости сопровождаются также повышением внутриклеточной концентрации Са2+, которую можно регистрировать по абсорбции индикатора арсеназо III (Farley J., Alkon D.L., 1985) или визуализацией внутриклеточного Са2+ с помощью красителя fura-2 (Muzzio LA. et al., 1999). В дальнейших экспериментах с помощью внутриклеточной инъекции хелатора Са ЭГТА и антагониста выделения внутриклеточного Са + гепарина было эффективно заблокировано повышение возбудимости, вызванной светом (Matzel L.D., Rogers R.F., 1993; Talk A., Matzel L., 1996). Отсюда возникает предположение, что освобождение Са2+ из внутриклеточных источников хранения может играть более значительную роль, чем Са2+, входящий через Са-каналы.
Модулирующая роль ионов кальция в пластических изменениях показана в целом ряде экспериментов по гетеросинаптическому облегчению и гомосинаптической депрессии (Hawkins R.D. et al., 1993). Повышение внутриклеточной концентрации ионов Са при добавлении в физиологический раствор кофеина происходит, в основном, за счет активации рианодиновых рецепторов и выхода ионов Са2+ из эндоплазматического ретикулума (Ткачук В.А., 2001). Такое повышение внутриклеточного Са + в наших экспериментах приводило к снижению порога генерации потенциала действия и смещению критического уровня деполяризации в сторону положительных значений мембранного потенциала командных нейронов примерно на одинаковую величину, как в группе интактных, так и в группе обученных улиток. Это свидетельствует о том, что внутриклеточный кальций не задействован в сохранение повышения возбудимости командных нейронов при обучении. Блокада потенциал-зависимых Са +-каналов на фоне увеличения внутриклеточной концентрации кальция вызывала деполяризацию мембранного потенциала, как и при блокаде этих каналов без кофеина. Так как продолжительность потенциала действия увеличивается при блокаде потенциал-зависимых Са +-каналов без воздействия кофеина и не изменяется при сходной блокаде в условиях увеличения внутриклеточной концентрации кальция, можно сделать предположение, что ионы кальция, входящие через эти каналы, оказывают активирующие влияние на Са +-зависимые К+-каналы, ведущее к увеличению продолжительности потенциала действия, а во втором случае для активации Са2+-зависимые К+-каналы используется кальций из внутриклеточных депо.
Добавление хинина или верапамила не изменяло эффекта кофеина на мембранный потенциал и порог генерации потенциала действия в группе интактных улиток, однако в группе обученных улиток порог генерации потенциала действия уменьшался незначительно, т. е. эффект кофеина на порог генерации потенциала действия в группе обученных улиток при добавлении хинина или верапамила отменялся. Снижения внутриклеточной концентрации кальция инъекцией ЭГТА приводило к достоверному увеличению значения порога генерации действия только в группе интактных улиток, видимо, в группе обученных улиток внутриклеточный кальций вносит меньший вклад в развитие потенциала действия.
Таким образом, накопленный экспериментальный материал свидетельствует, что роль ионов Са2+ не столь однозначна, как это может показаться на первый взгляд. Результаты показывают, что у каждой клеточной системы имеются свои механизмы регуляции, которые, в принципе, укладываются в общую схему. Поэтому исследование роли ионов Са+ в механизмах ассоциативного обучения, несомненно, является актуальным.
