Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 13
2.1. Ассоциативные и неассоциативные модификации поведения 13
2.1.1. Простые формы обучения и пресинаптическое облегчение 13
2.1.2. Ассоциативное обучение 18
2.1.3. Долговременная сенситизация 23
2.1.4. Мембранные и кальций-зависимые метаболические механизмы долговременной сенситизации 26
2.2. Биологическая роль оксида азота 30
2.2.1. Синтез оксида азота 30
2.2.2. Физико-химические характеристики оксида азота 31
2.2.3. Доноры и блокаторы синтеза оксида азота. Применение
их в клинике и экспериментальных исследованиях 33
2.2.4. Эффекты действия оксида азота 35
2.2.5. Оксид азота у беспозвоночных животных 39
2.3. Кальций и пластичность нервной системы 42
Функциональная роль ионов кальция в нервных клетках 42
2.3.2. Действие ионов кальция на плазматическую
мембрану возбудимой клетки 46
2.3.3. Ионы кальция как универсальный вторичный посредник 47
2.3.4. Регуляция свободного кальция в цитоплазме 49
2.3.5. Роль ионов кальция в пластичности 51
3. Объект и методы исследования 54
3.1. Объект исследования 54
3.2. Выработка долговременной сенситизации 55
3.3. Растворы, используемые в исследовании. Экспериментальные группы животных 56
3.4. Препарат, идентифицированные нейроны виноградной улитки 58
3.5. Регистрация электрических характеристик нейронов 62
3.6. Количественное измерение содержания оксида азота 65
3.6.1. Методы количественного измерения продукции оксида азота в биологических системах 65
3.6.2. Преимущества метода ЭПР перед другими методами количественного измерения оксида азота 68
3.6.3. Отработка метода. Опорные образцы 69
4. Результаты исследований и их обсуждение 74
4.1. Исследование роли N0 в формировании долговременной сенситизации 74
4.1.1. Поведенческие и электрофизиологические исследования действия экзогенного донора N0 и блокатора N0 синтазы на формирование долговременной сенситизации 74
4.1.2. Исследование содержания N0 методом ЭПР -спектроскопии в органах виноградной улитки после долговременной сенситизации 81
4.2. Влияние различных концентраций ионов Са2+ на
электрические характеристики командных нейронов интактных и сенситизированных улиток 84
4.3. Исследование воздействия хелатора кальция ЭГТА и кофеина на электрические характеристики командных нейронов улитки после формирования ДС 89
4.4. Исследования влияния хронической инъекции кофеина на формирование ДС у виноградной улитки и электрические характеристики командных нейронов 97
5. Заключение 105
6. Выводы 112
7. Список литературы 113
- Ассоциативные и неассоциативные модификации поведения
- Мембранные и кальций-зависимые метаболические механизмы долговременной сенситизации
- Растворы, используемые в исследовании. Экспериментальные группы животных
- Поведенческие и электрофизиологические исследования действия экзогенного донора N0 и блокатора N0 синтазы на формирование долговременной сенситизации
Введение к работе
Актуальность исследования. К настоящему времени многочисленные экспериментальные данные показывают, что длительные пластические модификации поведения на клеточном уровне поддерживаются через изменение мембранных характеристик и параметров ионных каналов (Byrne J.H., 1987; Балабан П.М. и др., 1992; Hawkins R.D. et al., 1993; Пивоваров А.С., 1995; Никитин В.П., Козырев С.А., 1995; Гайнутдинов Х.Л. и др., 1998; Staras К. et al., 1999; Balaban P.M., 2002). Найдены изменения многих биофизических характеристик и показана несомненно решающая роль ионов кальция (Са2+) в индукции ассоциативных и неассоциативных форм обучения (Kandel E.R., 1981; Fischer Т.М. et al., 1997; Lechner H.A., Byrne J.H., 1998; Bao J.X. et al., 1998; Malyshev A.Y., Balaban P.M., 1999; Blackwell K.T., Alkon D.L., 1999; Muzzio LA. et al., 1999; Никитин В.П., Козырев C.A., 2002). Популярным объектом исследования клеточных механизмов обучения и памяти являются моллюски, обладающие относительно простой нервной системой с идентифицируемыми клеточными элементами и достаточно сложным поведенческим репертуаром (Кэндел Э.Р., 1980; Максимова О.А., Балабан П.М., 1983; Сахаров Д.А., 1992; Самойлов М.О. и др., 1993; Benjamin P.R. et al., 2000; Dyer J.R. et al., 2003). Ha уровне отдельных клеток можно проследить не только сенсорные сигналы, поступающие в нервную систему, и моторные команды на ее выходе, но и всю последовательность промежуточных событий, лежащих в основе той или иной поведенческой реакции (Krasne F.B., Glanzman D.L., 1995).
Молекулярные механизмы сохранения следов памяти широко исследуются в контексте взаимоотношений ассоциативного обучения с сенситизацией как элементарной формой обучения, при которой животное учится усилению ответной реакции на ранее неэффективный стимул, следующей за нанесением сильных стимулов в другом участке (Никитин В.П., Судаков К.В., 1997; Гайнутдинов Х.Л. и др., 2002). Такая нейробиологическая модель как долговременная сенситизация (ДС) позволяет успешно исследовать мембранные механизмы долговременных модификаций поведения (Castellucci V.F. et al., 1986; Никитин В.П. и др., 19926; Walters Е.Т., Ambron R.T., 1995; Береговой H.A., 1996; Cleary LJ. et al., 1998; Гайнутдинова T.X. и др., 1999). Данные литературы показывают, что формирование ДС происходит вследствие значительного увеличения выброса серотонина из синаптических окончаний (Clark G.A., Kandel E.R., 1993). Известно, что ДС как у аплизии, так и у виноградной улитки на поведенческом уровне сохраняется более 2-х недель и блокируется ингибиторами белкового синтеза анизомицином и циклогексимидом (Castellucci V.F. et all., 1989; Береговой Н.А. и др., 1990; Никитин В.П., Козырев С.А., 1993; Bartsch D. et al., 1995). Долговременная сенситизация является видонеспецифическим феноменом, т.е. она характерна для животных разного уровня организации. Это позволяет проводить исследование реакций высших животных на относительно простых объектах или моделях, удобных для анализа (Кэндел Э.Р., 1980; Гайнутдинов Х.Л., Береговой Н.А., 1994; Никитин В.П., Козырев С.А., 1995; Walters Е.Т., Ambron R.T., 1995).
Оксид азота (II) (N0) является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции (Schuman Е.М., Madison D.V., 1994; Реутов В.П. и др., 1998; Уразаев А.Х., Зефиров А.Л., 1999). Молекула N0 синтезируется в ответ на физиологическую потребность в клетке из L-аргинина с участием NO-синтазы (NOS), активирующейся увеличением содержания ионов Са2+. Изменение внутриклеточной концентрации Са2+ происходит при активации потенциал чувствительных Са-каналов клеточной мембраны и Са-каналов эндоплазматического ретикулума, связанных с инозитолтрифосфатными рецепторами. Увеличение внутриклеточной концентрации N0 способно активировать гуанилатциклазу и аденозиндифосфатрибозотрансферазы, повышать концентрацию цГМФ и стимулировать образование пероксинитритов. Эффекты оксида азота связаны с его влиянием на ионные каналы, секрецию медиатора, обмен ионов кальция, метаболизм клетки и ее геном (Balligang J.-L. et al., 1993; Mohan P. et al., 1995; Яковлев A.B. и др., 2002).
В последние годы NO-синтезирующие нейроны обнаружены и в нервной системе беспозвоночных, в том числе моллюсков. Показано, что у моллюсков оксид азота играет роль межклеточного мессенджера и сигнальной молекулы (Huang Е.Р., 1997). Деполяризующее действие на NADPHd-позитивные нейроны оказывают доноры оксида азота (Zsombok A. et al., 2000; Kerschbaum Н.Н., 2000). Они снижают пороги возбуждения, усиливают ответы на стимуляцию и потенцируют возбуждающее действие глутамата. Показано, что серотонин и доноры N0 взаимно усиливают эффекты друг друга (Дьяконова Т.Л., 2000). Оксид азота контролирует также пластические свойства этих нейронов: блокатор NO-синтазы способствует развитию привыкания, а доноры оксида азота дают эффект сенситизации (Дьяконова Т.Л., 1998). Найдено, что он также участвует в некоторых поведенческих программах (Мороз Л.Л. и др., 1992; Elphick M.R. et al., 1995). Участие оксида азота в пластических изменениях синаптической передачи было описано в различных системах (Williams J.H., 1996; Mothet J.P. et al., 1996; Malyshev A.Y., Balaban P.M., 1999), в том числе для нервной системы Helix (Huang S. et al., 1997). Кроме того, большой интерес вызывает работа по изучению роли N0 в обучении Helix (Teyke Т., 1996).
Известно, что в долговременных формах пластичности важную роль играет кальций (Hawkins R.D. et al., 1993). Ионы кальция участвуют в регуляции разнообразных нейрональных процессов, что обусловлено их специфическими физико-химическими характеристиками, благодаря которым они являются наиболее универсальными внутриклеточными посредниками (Brini М., Carafoli Е., 2000; Никольский Е.Е. и др., 2001; Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф., 2002; Rizzuto R. et al., 2002; Kostyuk P.G., 2003; Berridge M.J., 2003). Ионы кальция, поступающие внутрь клетки во время ее возбуждения, с одной стороны приводят к изменению свойств ионных каналов мембраны, а с другой стороны служат сигналами для активации различных биохимических реакций. Таким образом, ионы кальция, осуществляя связь между электрическими явлениями, происходящими в поверхностной мембране клетки, и реакциями, протекающими внутри нее, принимают непосредственное участие в интегративной деятельности нервной клетки (Костюк П.Г., 1986; Berridge M.J., 1998; Blackwell К.Т., Alkon D.L., 1999; Северин Е.С. и др., 2001).
Недавно были проведены исследования роли кальциевой системы в механизмах обучения и сенситизации у виноградной улитки на уровне параметров нейрональной мембраны и ионных каналов (Никитин В.П., Козырев С.А., 2002; Силантьева Д.И. и др., 2004; Силантьева Д.И., 2005). В противоположность увеличению значения порогового потенциала и смещению величины критического уровня деполяризации в сторону положительных значений в командных нейронах оборонительного поведения интактных улиток при повышении внеклеточной концентрации ионов Са2+, было обнаружено, что эффект стабилизации мембраны ионами кальция в командных нейронах обученных улиток отменяется. Было также показано, что повышение внутриклеточного Са2+ в командных нейронах обученных улиток приводило к увеличению возбудимости, а при блокаде Са- и Са-зависимых К-каналов наблюдалась селективность по отношению к обученным улиткам (Силантьева Д.И. и др., 2005). Ранее уже высказывалось предположение, что плазматическая мембрана командных нейронов содержит ионные каналы, избирательно пропускающие Са2+. Эти ионы вовлечены в механизмы регуляции возбудимости плазматической мембраны. Глубокая гиперполяризация мембраны подавляет вход ионов кальция в клетки, инициируемый сенситизирующим воздействием, и угнетает кальцийзависимый механизм регуляции возбудимости мембраны. Вероятно, для механизмов регуляции возбудимости мембраны имеет не одинаковое значение, уменьшается ли уровень кальция внутри клеток за счет уменьшения тока входящего в клетку кальция вследствие гиперполяризации плазматической мембраны или за счет связывания его хелаторами (Никитин В.П., Козырев С.А., 2002).
Для исследования механизмов пластичности часто используется кофеин, который является алкалоидом, стимулирующим выход ионов Са2+ из эндоплазматического ретикулума (Howell et al, 1997; Машковский М.Д., 2002). В последнее время появились работы, свидетельствующие о том что, кофеин влияет на процессы обучения и памяти, найдено, что проявление этих эффектов зависит от стадии консолидации памяти. Было показано, что введение кофеина после сеансов обучения у крыс улучшали процесс консолидации памяти, однако не оказывали никакого эффекта на привыкание (Angelucci М.Е. et al., 1999). В экспериментах на виноградной улитке было показано, что кофеин увеличивает скорость обучения при его инъекциях после сеансов тренировки (Силантьева Д.И., 2005).
Таким образом, анализ литературы показывает, что исследования роли кальциевой системы и оксида азота в проявлении долговременных эффектов сенситизации на уровне характеристик нейрональной мембраны являются актуальными.
Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось исследование роли оксида азота и ионов кальция в механизмах долговременной сенситизации у виноградной улитки. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать действие экзогенного донора N0 (нитроглицерина) и блокатора NO-синтазы (L-NAME) на формирование долговременной сенситизации.
2. Определить методом ЭПР спектроскопии содержание N0 в органах виноградной улитки после долговременной сенситизации.
3. Исследовать влияние изменения концентрации внеклеточного и внутриклеточного кальция на электрические характеристики командных нейронов виноградных улиток после долговременной сенситизации.
4. Исследовать влияние хронического введения кофеина на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки.
Положения, выносимые на защиту:
1. Формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки сопровождается значительным снижением продукции оксида азота.
2. Ежедневное введение кофеина в течение 4-х дней сразу после ежедневного сеанса сенситизации полностью предотвращает деполяризационный сдвиг мембранного потенциала и снижение порогового потенциала, индуцированные долговременной сенситизацией, и приводит к снижению выраженности долговременной сенситизации.
Научная новизна. Впервые экспериментально методом ЭПР спектроскопии показано, что после формирования долговременной сенситизации в нервной системе виноградной улитки происходит значительное снижение продукции оксида азота. Обнаружено, что снижение продукции оксида азота при блокаде NO-синтазы инъекцией L-NAME приводит к снижению порогового потенциала у сенситизированных улиток, что демонстрирует повышение возбудимости этих нейронов. Найдено, что блокатор NO-синтазы L-NAME и донор N0 нитроглицерин не влияют на величину мембранного потенциала командных нейронов у сенситизированных улиток. Показано, что предварительная инъекция блокатора NO-синтазы L-NAME и донора N0 нитроглицерина не предотвращает формирования долговременной сенситизации, а уменьшает ее выраженность.
Впервые найдено, что хроническое (ежедневное в течение 4-х дней) введение кофеина снижает выраженность долговременной сенситизации при его инъекции сразу после ежедневного сеанса сенситизации. Впервые в электрофизиологических исследованиях эффектов хронического введения кофеина найдено, что на уровне электрических характеристик командных нейронов применение кофеина после ежедневного сеанса сенситизации полностью предотвращает деполяризационный сдвиг мембранного потенциала и снижение порогового потенциала.
Показано, что, в отличие от ассоциативного обучения, после долговременной сенситизации отмены стабилизирующего эффекта повышением концентрации внеклеточных ионов Са2+ на нейрональную мембрану не наблюдается. Повышение внутриклеточной концентрации ионов Са2+ кофеином снижает порог генерации потенциалов действия у интактных, но не у сенситизированных улиток, и, наоборот, снижает мембранный потенциал командных нейронов у сенситизированных улиток, но не у интактных. Снижение концентрации внеклеточных ионов Са2+ не оказывает влияния на электрические характеристики командных нейронов.
Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли ионов кальция и оксида азота в механизмах долговременной сенситизации. Показано, что формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки сопровождается значительным снижением продукции оксида азота, что подтверждается прямыми измерениями N0 методом ЭПР спектроскопии. Данный результат может помочь в выборе стратегии применения фармакологических веществ при нарушениях поведения и деятельности нервной системы. Установление факта стабилизации мембраны кальцием после формирования долговременной сенситизации, в отличие от обучения, позволяет сделать вывод о том, что механизмы этих двух моделей пластичности сильно отличаются друг от друга. Снижение мембранного потенциала у сенситизированных улиток при внутриклеточной инъекции кальциевого хелатора ЭГТА и отсутствие этого эффекта у интактных улиток позволяет уточнить роль уровня внутриклеточного кальция в сохранении следов памяти. Результаты, свидетельствующие о снижении скорости формирования долговременной сенситизации при хроническом введении кофеина сразу после процедуры сенситизации, а также то, что хроническая инъекция кофеина полностью предотвращает деполяризационный сдвиг мембранного потенциала и снижение порогового потенциала позволяет объяснить механизм действия кальциевых препаратов. Изучение влияния ионов кальция и оксида азота на формирование долговременной сенситизации позволяет приблизиться к пониманию механизмов, лежащих в основе этого процесса. Отработан метод количественного определения продукции оксида азота в биологических тканях с использованием спектроскопии электронного парамагнитного резонанса. Данный метод может позволить решение вопроса о роли оксида азота и его метаболитов при различных патологиях. Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в КГУ и ТГГПУ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на:
• VI Всероссийском симпозиуме "Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке" (Казань, 2002 г),
• итоговых конференциях Казанского научного центра РАН (Казань, 2003, 2005 гг),
• 7-ой и 9-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино 2003, 2005 гг),
• Jerzy Konorski Memorial: Integrative Activity of the Brain (Варшава, 2003 г), • Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology
(Kaliningrad, 2003 r),
• VII Всероссийском симпозиуме "Растущий организм" (Набережные Челны, 2004 г.),
• III съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004 г),
• The International conference "Modern development of magnetic resonance" (Kazan, 2004),
• XIX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова, (Екатеринбург 2004 г),
• Всероссийской конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и
прикладные аспекты» (Москва, 2005 г),
• Всероссийской конференции молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2005г.),
• Fundamental problems of physics, III International conference (Kazan, 2005),
• Международном симпозиуме «Mechanisms of adaptive behavior» (Санкт-Петербург, 2005г).
Реализация результатов исследования. Материалы исследования отражены в 4 статьях, из них 3, опубликованных в рецензируемых журналах, и в 16 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 139 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, главы результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 272 источника, из них 164 - иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 25 рисунками и содержит 2 таблицы.
Ассоциативные и неассоциативные модификации поведения
В основе различных видов обучения и памяти лежит пластичность нервных клеток и синаптической передачи, которую определяют как длительные модификации клеточной и синаптической функций, позволяющие объяснить простые видоизменения поведенческих реакций, способность к изменению реактивности под влиянием последовательных стимулов или при ассоциировании с другими факторами (Котляр Б.И., 1986; Скребицкий В.Г., Чепкова А.Н., 1999). Процесс формирования пластических перестроек нейронов при обучении может быть подразделен на две стадии: кратковременную и долговременную. Кратковременная стадия связана с активацией систем вторичных посредников и модификацией свойств уже синтезированных белков (Schwartz J.H., Greenberg S.M., 1987; Никитин В.П., Козырев С.А. 1995; Пивоваров А.С., 1995; Sossin W.S., 1997). Долговременные пластические перестройки нейронов сопряжены с синтезом белковых молекул и мРНК (Goelet P. et al., 1986; Nelson T.J., Alkon D.L., 1989; Castellucci V.F. et al., 1989; Гринкевич Л.Н. и др., 1995; Bailey C.H. et al., 1996; Hegde A.N. et al, 1997; Самойлов M.O., 1999). Предложена следующая схема формирования и сохранения долговременных пластических перестроек в командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки при обучении. Подкрепляющее и условно-рефлекторное возбуждения конвергируют на молекулярных субстратах в постсинапсе, в результате чего происходит активация протеаз или локального синтеза белков с последующим образованием специфических "белков-маркеров". Эти белки образуют со специфическими белками-регуляторами процессов транскрипции комплексы, которые поступают в ядро клетки и взаимодействуют с последовательностями генов, на которые "проецируются" "условнорефлекторные" синаптические входы (Никитин В.П., Козырев С.А. 1995; Никитин В.П., Судаков К.В., 1997). Таким образом, описанная схема может обеспечить, с одной стороны, высокую устойчивость молекулярных процессов, лежащих в основе долговременной ассоциативной памяти, а с другой - достаточную чувствительность этих процессов к действию возбуждений, приходящих на клетку.
Простые типы модификации поведения - привыкание (габитуация) или гомосинаптическая депрессия и дегабитуация, а также сенситизация или пресинаптическое облегчение наиболее успешно изучались на клеточном уровЕїе (Кэндел Э.Р., 1980; Соколов Е.Н., 1981; Byrne J.H., 1987). Сравнительный анализ динамики ответов нейронов 4-х функциональных классов, участвующих в организации оборонительной реакции, - сенсорных, командных, модуляторных и моторных - показал, что привыкание определяется уменьшением ответов сенсорных и командных нейронов (Балабан П.М., Захаров И.С, 1992) и угашением чувствительности хеморецепторов при их ритмической стимуляции (Пивоваров А.С., 1995).
Т.Л. Дьяконовой было предпринято изучение пластических перестроек электровозбудимой мембраны изолированных командных нейронов оборонительного поведения ЛПаЗ и ППаЗ виноградной улитки. Ритмическое внутриклеточное раздражение этих нейронов импульсами тока приводило к привыканию, которое исчезало при применении блокаторов Са-каналов Cd2+, Мп2+ и Со2+ (Дьяконова Т.Л., 1984; 1985). Кальциевый ионофор А23187, повышающий вхождение Са в клетку, наоборот, приводил к быстрому развитию этого процесса. Такие результаты демонстрируют, что эффект привыкания на уровне электровозбудимой мембраны обусловлен увеличением кальциевой проводимости и повышением внутриклеточного содержания Са2+. Действие блокатора Са-зависимых К-каналов хинина сопровождалось увеличением входного сопротивления нейронов, снижением порога ответов и деполяризацией мембраны до 10-15 мВ в течение первых двух минут, увеличением амплитуды потенциала действия (ПД) и их длительности. Введение хинина во внеклеточную среду на фоне развившегося привыкания давало эффект облегчения: ответы на пороговый стимулирующий импульс восстанавливались, а число ПД увеличивалось (Дьяконова Т.Л., 1984; 1987). Результаты этих работ позволили высказать предположение, что в основе многих феноменов пластичности привыкания на уровне электровозбудимой мембраны лежат сдвиги проводимости Са- зависимых К-каналов. На такой механизм указывает также отсутствие Са-зависимых К-каналов в не привыкающих клетках виноградной улитки (Дьяконова Т.Л., 1985).
Втягивание жабры у аплизии, подобно большинству защитных рефлексов, подвержено габитуации и дегабитуации (Кэндел Э.Р., 1980). Привыкание ведет к гомосинаптической депрессии синаптической связи сенсорного нейрона с мотонейроном и во время гомосинаптической депрессии у аплизии изменения трансмембранного ионного тока проявляются только при блокировании Na- и К-каналов тетродотоксином, тетраэтиламмонием и 4-аминопиридином (Klein М. et al., 1980; Montarollo P.G. et al., 1986; Lin X.Y., Glanzman D.L., 1994). В этом случае одновременно при повторной стимуляции сокращается продолжительность кальциевого ПД и уменьшается оставшийся Са-ток. Депрессия коррелирует здесь с продолжительной инактивацией входящего тока Са2+, наступающей в результате повторяющейся стимуляции (Hawkins R.D. et al., 1993; Eliot L.S. et al., 1993). Таким образом, анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что привыкание у аплизии и виноградной улитки развивается как за счет пресинаптических мехаЕшзмов освобождения медиатора, так и вследствие модификации эндогенных свойств постсинаптического нейрона и пластичности электровозбудимой мембраны - прежде всего Са- и Са-зависимых К-каналов (Kandel Е., Schwartz J.H., 1982; Дьяконова Т.Л., 1985; Fischer Т.М. et al, 1997).
Мембранные и кальций-зависимые метаболические механизмы долговременной сенситизации
Значительное число исследований посвящено исследованию мембранных механизмов ДС. Так, например, были изучены механизмы выработки сенситизации у виноградной улитки в полуинтактном препарате. Сенситизацию вырабатывали нанесением 3 капель 50%-ного раствора хинина на кожу передней части головы. Воздействие хинином вызывало уменьшение мембранного потенциала командных нейронов оборонительного поведения ЛПл1 и ППл1 на 14 мВ, высокочастотную генерацию ПД в течение 2-5 мин, учащение генерации спонтанных ВПСП и увеличение возбудимости плазматической мембраны на 110%. Через 1 час после сенситизирующего воздействия реакции на сенсорные воздействия усиливались: число ПД в ответах нейронов в 2-4 раза превосходили исходное значение, а площадь медленных ВПСП увеличивалась на 50-70% (Никитин В.П. и др., 1992а). Экспериментальные факты позволяют предположить, что важная роль в выработке сенситизации командных нейронах оборонительного поведения принадлежит Са-зависимым метаболическим процессам и, в частности, Са/кальмодулиновой системе. Удаление ионов Са2+ из раствора, омывающего ганглий, или ингибирование кальмодулииа в момент сепситизирующего воздействия приводило к блокаде кратковременных и долговременных эффектов сенситизации. В то же время ингибирование действия кальмодулииа и ионов Са2+ после нанесения сепситизирующего раздражения не препятствовало возникновению долговременных эффектов (Никитин В.П. и др., 19926; Самойлов М.О. и др., 1993).
В продолжение этих исследований авторы рассмотрели мембранные механизмы ноцицептивной сенситизации на препаратах сенситизированных животных (Никитин В.П., Козырев С.А., 1995). Через 24 ч после трехдневной выработки сенситизации площади медленных ВПСП в ответах на тактильное раздражение головы и аппликацию 0,5%-ного хинина возрастали в 2 и 4 раза соответственно, а возбудимость мембраны увеличилась на 116% и наблюдалась деполяризация мембранного потенциала примерно на 5 мВ. При подведении серотонина в концентрации 10 или 100 мкМ через 1 час в командных нейронах развивалось синаптическое облегчение, которое сохранялось 1 ч в ответах на тактильное раздражение головы и 2-3 ч в ответах на предъявление хинина. Серотонин вызывал уменьшение интенсивности флуоресцентного сигнала на Са2+ и приводил к увеличению возбудимости в командных нейронах, вызывая эффекты, сходные с эффектами ДС и блокаторов синтеза белка (Щевелкин А.В. и др., 1997). Проведенные исследования показали, что при выработке ДС в командных нейронах оборонительного поведения возникают нейрофизиологические изменения, которые могут лежать в основе как сигнал-специфической, так и генерализованной сенситизации (Никитин В.П., Козырев С.А., 1995).
Многими исследователями доказано, что командные нейроны оборонительного поведения виноградной улитки играют важную роль в реализации оборонительных реакций и их изменении при выработке различных навыков (Соколов Е.Н., 1981; Максимова О.А., Балабан П.М., 1983; Балабан П.М., Захаров И.С, 1992). Нейроны характеризуются полимодальным рецептивным полем: отвечают на тактильные, химические, световые, вестибулярные и тепловые раздражения. Размеры рецептивных полей командных нейронов одинаковы и включают всю кожную поверхность тела улитки. Однако структуры рецептивных полей отдельных нейронов различаются. Для каждого командного нейрона существует специфическая зона, тестирующее раздражение которой вызывает максимальный ответ клетки с наименьшим латентным периодом. Специфические зоны рецептивных полей командных нейронов совпадают с жизненно важными областями тела животного - зона головы и отверстия легочной полости (Никитин В.П., Козырев С.А., 2002). Ранее уже высказывалось предположение, что плазматическая мембрана командных нейронов содержит ионные каналы, избирательно пропускающие Са . Эти ионы вовлечены в механизмы регуляции возбудимости плазматической мембраны. Глубокая гиперполяризация мембраны подавляет вход ионов кальция в клетки, инициируемый сенситизирующим воздействием, и угнетает кальцийзависимый механизм регуляции возбудимости мембраны. Вероятно, для механизмов регуляции возбудимости мембраны имеет не одинаковое значение, уменьшается ли уровень кальция внутри клеток за счет уменьшения тока- входящего в клетку кальция вследствие гиперполяризации плазматической мембраны или за счет связывания его хелаторами (Никитин В.П., Козырев С.А., 2002).
В другой модели ДС, формируемой применением электрошоков, анализ электрических характеристик командных нейронов оборонительного рефлекса ЛПаЗ, ППаЗ, ЛПа2 и ППа2 и мотонейронов висцерального ганглия проводился через один день после выработки ДС. Параметры ПД в двух группах мотонейронов открытия и закрытия пневмостома не отличаются значительно между клетками, а измерения показывают отсутствие достоверных изменений этих характеристик при сенситизации (Гайнутдинов Х.Л. и др., 1989). Типичный ответ командных нейронов на тактильное раздражение ноги улитки обычно представлен ВПСП или деполяризационной волной, способной переходить в потенциал действия. Было найдено, что у сенситизированных улиток вероятность генерации ПД значительно выше, чем у контрольных животных (Береговой Н.А., Гайнутдинов Х.Л., 1988; Береговой Н.А., 1996). Измерения показывают, что исходный потенциал покоя командных нейронов оборонительного рефлекса и их пороговый потенциал у сенситизированных улиток на 5-9 мВ меньше, чем у интактных животных (Гайнутдинов Х.Л., Береговой Н.А., 1994; Гайнутдинов Х.Л. и др., 1998). В ходе эксперимента в рамках полуинтактного препарата на ногу наносилась серия последовательных тактильных стимулов с интервалом 2-15 мин. При этом мембранный потенциал этих нейронов у сенситизированных улиток в части ответов не возвращался к исходному уровню и к концу эксперимента потенциал покоя выходил на стационарный уровень и при этом деполяризация достигала 10 мВ. Изменений в форме потенциала действия, включая амплитуду, продолжительность и овершут, отмечено не было (Береговой Н.А., 1996).
Растворы, используемые в исследовании. Экспериментальные группы животных
Долговременную сенситизацию (ДС) оборонительного рефлекса вырабатывали по ранее отработанной схеме (Гайнутдинов Х.Л., Береговой Н.А., 1994). На животных воздействовали пакетом электрических импульсов в область головы 4 раза в день в течение 4-х дней с интервалом в 1,5-2 часа. Длительность каждого пакета составляла 0,5 с. Амплитуда прямоугольных импульсов тока в пакете составляла 6-8 мА, длительность 10 мс, частота следования импульсов была 50 Гц (Греченко Т.Н., 1977). В работе использовался стимулятор ЭСЛ-1. Реальная амплитуда тока при стимуляции контролировалась по экрану осциллографа. Животные во время нанесения электрического раздражения находились на медной пластине-электроде, покрытой слоем смоченной водой бумаги. Второй электрод представлял собой металлический стержень, который прикладывался в область головы улитки. Критерием выработки ДС служило значительное увеличение времени закрытия пневмостома в ответ на предъявление тестирующего раздражения по сравнению с исходной реакцией. Только полное закрытие пневмостома определялось как положительная реакция на стимул.
Пневмостом находится в районе мантии, между анальной и правой лопостями мантийного валика. В нормальном состоянии, при отсутствии угрозы, его отверстие находится преимущественно в открытом состоянии, однако при действии слабых раздражителей лопасти мантийного валика, сдвигаясь, прикрывают пневмостом, который, кроме того, снабжен кольцевыми мускулами, закрывающими его в этот момент. Критерием изменения оборонительной реакции и выработки ДС служило значительное увеличение времени закрытого состояния дыхательного отверстия (Тс) после его закрытия в ответ на предъявление тестирующего тактильного раздражения мантии по сравнению с исходной реакцией. Этот критерий использовался во многих работах по исследованию ДС (Frost W.N. et al., 1985; Castelluci V.F. et al., 1986; Береговой H.A., Гайнутдинов Х.Л., 1988). Тестовое раздражение наносилось вручную эластичным одиночным тонким волоском от кисточки, диагональным движением поперек дыхательного отверстия с захватом постоянной области мантии. Для оценки оборонительной реакции проводили сеанс тестирования для каждого животного, который включал несколько (обычно 4) тестирующих тактильных стимулов одинаковой силы. Процедуру проводили стандартным образом, помещая животных на плавающий шар (Максимова О.А., Балабан П.М., 1983). Тесты проводились на протяжении всего эксперимента. Во время четырехдневной процедуры выработки ДС тесты снимались до ежедневной серии электрических стимулов.
Наблюдение за поведением животных при формировании ДС показывают, что первые два дня улитки становятся беспокойными, больше передвигаются, меньше едят, а последующие два дня их двигательная активность резко снижается (Гайнутдинов Х.Л. и др., 2002). В экспериментах с хроническим введением кофеина тестировалась скорость локомоции - фиксировалось расстояние, которое улитка проползает за 1 минуту.
Для того чтобы изучить влияние доноров и блокаторов оксида азота на формирование ДС у виноградной улитки мы использовали раствор нитроглицерина (1% водный раствор отечественного производства) в дозе 0,1 мл каждой улитке и L-NAME (L-N -nitro L-arginine methyl ester, Sigma, USA) в дозе 100 мг/кг, в течение 4-х дней.
При изучении влияния NO на поведение улиток при выработке долговременной сенситизации и электрофизиологические характеристики животные были разделены на 4 группы: 1. Группа интактных животных. 2. Группа животных, получавших инъекции физиологического раствора за 30 мин. перед сеансом сенситизации (начало предъявления электрических импульсов). 3. Группа животных, которым вводили нитроглицерин за 30 мин. перед сеансом сенситизации (начало предъявления электрических импульсов). 4. Группа животных, которым ежедневно в течение 4-х дней вводили L-NAME с последующей 4-х дневной сенситизацией (формирование ДС).
Эксперимент длился 4 дня, после чего были измерены электрофизиологические характеристики клеток нервной системы.
Для того чтобы проследить изменение количества оксида азота при формировании ДС, мы применили методику введения спиновой ловушки, предложенную коллективом под руководством профессора А.Ф. Ванина для последующего ЭПР измерения (Микоян В.Д. и др., 1994). Двум группам улиток: интактные и улитки с выработанной ДС для формирования мононитрозильного комплекса железа кроме спиновой ловушки - диэтилдитиокарбомата натрия в дозе 500 мг/кг (Na-ДЭТК, хч) вводили цитрат натрия 187,5 мг/кг и сульфат железа 37,5 мг/кг (FeS04 7 Н20, Sigma, USA). Для приготовления образцов были использованы нервная система, сердце и печень улиток. Из-за небольших размеров органов на приготовление каждого образца брали двух улиток. Извлеченные органы измельчали, помещали в специально приготовленные шприцы и замораживали в жидком азоте для последующей регистрации сигнала ЭПР. Измерения ЭПР проводились в Х-диапазоне на спектрометре ЭПР ER-200 фирмы Брукер при температуре 77 К.
Для хронического повышения внутриклеточной концентрации кальция, мы использовали кофеин, который активирует рианодиновые рецепторы, что приводит к высвобождению кальция из эндоплазматического ретикулума (Berridge M.J., 1998; Ткачук В.А., 2001). Кофеин вводили в дозе 30 мг/кг веса животных, предварительно растворяя в 0,1 мл физиологического раствора для виноградной улитки. Исследовалось 4 группы животных: 1. Группа интактных улиток. 2. Группа улиток, ежедневно в течение 4-х дней получавших инъекции физиологического раствора за 30 мин. до выработки ДС. 3. Группа улиток, которым ежедневно в течение 4-х дней вводился кофеин за 30 минут до сеанса ДС.
Поведенческие и электрофизиологические исследования действия экзогенного донора N0 и блокатора N0 синтазы на формирование долговременной сенситизации
При изучении поведения у интактных животных (п=15), наблюдавшихся одновременно, но не получавших электрические стимулы, обнаружено, что изменений в реакции пневмостома не происходило. При введении L-NAME с последующей сенситизацией (п=15) параметр Тс увеличивался с 13,0±0,6с до 68,1±0,9с, т.е. несколько слабее, чем в контрольной группе, но тоже происходило достоверное (р 0,01) изменение реакций пневмостома (рис. 9, табл. 1). Введение нитроглицерина (п=15) уменьшало выраженность ДС с 15,5±0,6с до 57,2+1,1с, но изменения реакций пневмостома (рис. 9, табл. 1) были также достоверными (р 0,01).
Формирование ДС сопровождалось изменениями на нейроналыюм уровне. Потенциал покоя командных нейронов улиток после формирования ДС (п=15) стал равен -56,3±0,7мВ, тогда как у интактных (п=19) он был -59,8±0,7мВ (рис. 10а), достоверность отличия (р 0.01). Значение мембранного потенциала у животных с выработкой сенситизации после инъекции блокатора NO-синтазы L-NAME (п=31) составило -58,1+0,7мВ, а после введения донора оксида азота нитроглицерина (п=9) -58,4+1,8мВ (рис. 11).
В группе интактных улиток величина порогового потенциала составила 19,7±0,5мВ (п=19); в группе улиток, инъецированных физиологическим раствором за 30 мин. до ДС (п=15), порог генерации ПД снизился до 17,8±0,8мВ (рис. 106), достоверность отличия от контроля (р 0,01). Порог генерации ПД в группе улиток после инъекции L-NAME (п=31) достоверно по сравнению с группой «ДС» (р 0,05) снизился до 15,0±0,6мВ, а в группе животных после инъекции нитроглицерина (п=9) снижение величины порогового потенциала было не достоверным 16,3+1,4мВ (рис. 12).
Известно, что в нервной системе N0 не только играет роль вторичного посредника в процессах внутриклеточной сигнализации, но является также нейромедиатором, функционально соединяя пресинаптический и постсинаптический нейроны (Bredt D.S., Snyder S.H., 1992). Получены данные о том, что в мозгу улитки серотоиин и оксид азота однопаправлено регулируют функцию серотонинергической системы. Они не только возбуждают серотониновые нейроны, но и координируют их работу за счет активации общих синаптических входов. Доноры N0, как и серотонин, блокируют привыкание на уровне электровозбудимой мембраны и снижают пороги возбуждения нейронов (Дьяконова Т.Л., 1985; 1998; Дьяконова Т.Л., Реутов В.П., 1994; 1998). Было выдвинуто предположение, что оксид азота тонически участвует в формировании фоновой активности серотониновых нейронов (блокирование синтеза N0 снижает уровень фоновой активности). N0 опосредует или усиливает возбуждающее действие серотонина на серотониновых нейронах (блокирование синтеза N0 уменьшает это действие серотонина). И, наконец, N0 участвует, по-видимому, в механизме синаптической передачи от общего пачечного входа или причастен к генерации эндогенной пачечной активности пресинаптическим нейроном (блокирование синтеза N0 включает синхронную пачечную активность и подавляет ее активацию серотонином, а добавление экзогенного оксида азота восстанавливает эту активность). Возможно, N0 является вторичным посредником при возбуждающем действии серотонина (Дьяконова Т.Л., 2000).
Подобное предположение подтверждается экспериментами, показывающими, что блокирование NO-синтазы перед выработкой пищевого рефлекса сильно ухудшает обучение виноградной улитки. Улитки с выработанным условным рефлексом после иигибирования NOS остаются способными обнаружить пищу. Эти результаты указывают на то, что N0 участвует в процессе приобретения памяти (Теуке Т., 1996). Кроме того, найдено, что аппликация доноров N0 способствует торможению ВПСП в нейронах RPD1 and LP1 прудовика (Kazakevich V.B. et al., 2000) и ведет к торможению осцилляции в лобных долях моллюска Umax maximiis (Gelperin А. et al., 2000).
Для Lymnaea было показано продуцирование L-цитруллина из L-аргинина благодаря активности NOS (Eloffson R. et al. 1993), но не были исследованы эффекты NADPH, Са2+ и кальмодулина. Результаты экспериментов на Plenrobranchaea и Aplysia свидетельствуют о том, что NO-синтаза представлена в ЦНС моллюсков. NADPH-зависимые трансформации L-аргинина в L-цитруллин в нервной системе ингибирует L-NAME. Отсутствие кальциевой зависимости в NOS моллюсков, контрастирует с сильной зависимостью NOS от
системы Са2+/кальмодулин, наблюдаемое в ЦНС артропод (Johansson K.U., Carlberg М., 1994; Muller U., Biker G., 1994; Elphick M.R. et al 1995) и эндотелиалыюй формой NOS млекопитающих (Knowles R.G., Moncada S., 1994). Однако, восприимчивость активности энзимов к ингибитору кальмодулина трифлуоперазину (ТФП) предполагает, что NOS моллюсков подобна индуцибелыюй форме NOS млекопитающих и как кофактор может связывать кальмодулин без Са (Moroz L.L. et. al., 1996). Было показано, что активность индуцибелыюй NOS вызывается обработкой бактериальными эндоксинами, цитокинезом и другими межклеточными сигнальными факторами не зависящими от системы Са2+/кальмодулин (Knowles R.G., Moncada S., 1994). У млекопитающих также существуют индуцибельные изоформы нейронов, которые не зависят от Са2+, это церебральные ганглии, микроглия и гепатоциты (Evans T.et al., 1992; Wood P. et al., 1994; Sato I. et al., 1995).
Обнаружено, что снижение продукции оксида азота при блокаде N0-синтазы инъекцией L-NAME приводит к снижению порогового потенциала у сенситизироваппых улиток, что демонстрирует повышение возбудимости этих нейронов. Найдено, что блокатор NO-синтазы L-NAME и донор N0 нитроглицерин не влияют на величину мембранного потенциала командных нейронов у сенситизироваппых улиток. Показано, что предварительная инъекция блокатора NO-синтазы L-NAME и донора N0 нитроглицерина не предотвращает формирования долговременной сенситизации, а уменьшает ее выраженность.
