Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Исследование зависимости реконсолидации долговременной контекстуальной памяти у виноградной улитки от белкового синтеза 16
1.1. Процессы обучения и памяти у моллюсков 16
1.1.1. Общие представления о пластичности нервной системы 16
1.1.2. Поведение и обучение как основа адаптации 18
1.1.3. Ассоциативное обучение у животных с простой нервной системой 20
1.2. Напоминание и реконсолидация долговременной памяти 26
1.2.1. Консолидация следов памяти 26
1.2.2. Долговременная память и биосинтез 29
1.2.3. Реконсолидация памяти 21
1.3. объект и методы исследования 38
1.3.1. Объект исследования 38
1.3.2 Выработка условного рефлекса на постукивание по раковине 39
1.3.3. Идентифицированные нейроны виноградной улитки 40
1.3.4. Регистрация электрических характеристик нейронов 43
1.3.4.1. Микроэлектроды 43
1.3.4.2. Установка для регистрации электрических характеристик клеточных мембран 44
1.3.4.3. Измерение электрических характеристик 46
1.3.5. Формирование обстановочного условного рефлекса,
тестирование оборонительных реакций омматофоров и пневмостома 48
1.3.6. Применение блокатора белкового синтеза анизомицина 53
1.3.7. Протоколы эксперимента 53
1.3.8. Реконсолидация условного оборонительного рефлекса 56
1.4. Результаты исследования 57
1.4.1. Контекстуальная память у улиток 57
1.4.2. Эффекты инъекции анизомицина на контекстуальную память 58
1.4.3. Специфичность эффектов анизомицина на реконсолидацию 68
1.4.4. Электрические характеристики командных нейронов оборонительного поведения после выработки условного обстановочного рефлекса 72
1.4.5. Исследование влияния блокады синтеза белка анизомицином при реактивации условного оборонительного рефлекса на постукивание
по раковине (УОР) у виноградной улитки з
ГЛАВА 2. Исследование мембранных механизмов формирования и сохранения условного оборонительного рефлекса и роли СА2+- и СА2+- зависимых К+- каналов в сохранении изменений электрических характеристик командных нейронов после обучения 78
2.1. мембранные механизмы обучения и памяти 78
2.1.1. Электрическая возбудимость нейрона- основа клеточного ответа на внешние воздействия 78
2.1.2. Роль ионов кальция в генерации потенциалов действия в соме и в аксоне нейрона. Кальциевые и кальций зависимые калиевые каналы 80
2.1.3. Нейронные (мембранные) механизмы ассоциативного обучения у моллюсков (аплизия, виноградная улитка, прудовик) 83
2.1.4. Роль мембранных характеристик в обучении у моллюсков плевробранха и гермиссенды 88
2.1.5. Ионные и мембранные механизмы гетеросинаптического (пресинаптического) облегчения 92
2.2. Методы исследования 94
2.2.1. Выработка условного рефлекса аверзии на пищу 95
2.3. Мембранные процессы, лежащие в основе длительных модификаций поведения 96
2.3.1.Условный оборонительный рефлекс на постукивание по раковине 96
2.3.2. Влияние блокатора потенциалзависимых К -каналов - тетраэтиламмония, блокатора быстрых К+-каналов - 4-аминопиридина, блокатора потенциал зависимых Са +-каналов верапамила и блокаторов Са2+-зависимых К+-каналов хинина и ибериотоксина на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток 101
2.3.3. Длительность сохранения электрических характеристик командных нейронов после выработки условного рефлекса ПО
2.3.4. Условный рефлекс аверзии на пищу. : 114
ГЛАВА 3. Исследование роли ионов СА2+ и СА2+-связывающего белка s100 в сохранении изменений электрических характеристик командных нейронов после обучения 120
3.1. Функциональная роль ионов кальция в нервных клетках...
3.1.1. Содержание ионов кальция в клетках 120
3.1.2. Роль внеклеточных ионов кальция 120
3.1.3. Внутриклеточные депо ионов кальция в нервной клетке 122
3.1.4. Участие ионов кальция в интегративной деятельности нервной клетки 124
3.1.5. Ионы Са2+ и пластичность нейронной сети 127
3.1.6. Роль ионов Са в механизмах обучения 130
3.2. Методы исследования 134
3.2.1. Формирование долговременной сенситизации 134
3.2.2. Растворы, использованные в работе 135
3.2.3. Аппликация антител к белку S100 137
3.3. Ионы кальция в механизмах обучения 138
3.3.1. Исследование эффектов изменения концентрации внеклеточного кальция на электрические характеристики командных нейронов интактных улиток, улиток после выработки условного оборонительного рефлекса и улиток после формирования долговременной сенситизации 138
3.3.1.1. Влияние различных концентраций ионов Са2+ на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток 138
3.3.1.2. Влияние изменений концентрации ионов Са2+ на электрические характеристики командных нейронов у сенситизированных улиток 143
3.3.2. Исследование эффектов изменения содержания внутриклеточного кальция на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток 147
3.3.2.1. Влияние кофеина на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток 147
3.3.2.2. Влияние кофеина на электрические характеристики командных нейронов интактных и обученных улиток в условиях блокады потенциал зависимых Са2+-каналов верапамилом и блокады Са -зависимых К -каналов хинином 151
3.3.2.3. Влияние внутриклеточной инъекции ЭГТА на электрические характеристики командных нейронов интактных, обученных и сенситизированных улиток 155
3.3.2.4. Влияние быстрого кальциевого хелатора ВАРТА-AM на электрические характеристики командных нейронов интактных, обученных и сенситизированных улиток в условиях блокады Са2+-зависимых К+-каналов хинином и блокады Са2+-активируемых калиевых каналов высокой проводимости ибериотоксином 157
3.3.3. Исследование влияния антител к Са2+- связывающему белку S100 на
электрические характеристики командных нейронов после обучения и при
изменениях содержания внутриклеточного кальция 165
ГЛАВА 4. Электрофизиологическое исследование эффектов хронического введения кофеина, ингибитора фосфодиэстеразы ibmx, предшественника и нейротоксического аналога серотонина на обучение 182
4.1. Роль фосфодиэстеразы цамф и аденилатциклазной системы в функциях нейрона 182
4.1.1. Нейрон и внутриклеточные сигнальные системы 182
4.1.2. Аденилатциклазная система нейрона 183
4.2. Роль медиаторов в функциях ріервной системы беспозвоночных 189
4.2.1. Медиаторы беспозвоночных 189
4.2.2. Серотонин в нервной системе 191
4.2.3. Медиатор зависимое поведение моллюсков 193
4.2.4. Серотонинергическая система и ассоциативное обучение у моллюсков 195
4.3. Роль кофеина в исследованиях функционирования нервной системы 198
4.3.1. Характеристика кофеина 198
4.3.2. Основные характеристики рианодинового рецептора 200
4.3.3. Кальций связывающий белок - кальмодулин и его антагонисты 201
4.3.4. Активация и ингибирование аденилатциклазы фосфодиэстеразами 204
4.4. Методы исследования 206
4.4.1. Серотонин 206
4.4.2. Кофеин 207
4.4.3. Хлорпромазин 207
4.4.4. Активаторы цАМФ и ингибитор фосфодиэстеразы IBMX 208
4.5. Результаты исследования и их обсуждение 208
4.5.1. Исследование роли серотонина в обучении 208
4.5.1.1. Влияние 5, 6-дигидрокситриптамина на выработку условного оборонительного рефлекса на постукивание по раковине 208
4.5.1.2. Влияние 5-гидрокситриптофана на выработку условного оборонительного рефлекса на постукивание по раковине 210
4.5.1.3. Влияние 5,6-дигидрокситриптамина на электрические характеристики командных нейронов оборонительного поведения 211
4.5.1.4. Длительность сохранения электрических характеристик командных нейронов после инъекции нейротоксина 5,6 -дигидрокситриптамина 213
4.5.1.5. Влияние инъекции 5-НТР на электрофизиологические параметры командных нейронов виноградной улитки 214
4.5.1.6. Механизмы действия серотонина на поведенческие реакции моллюсков и на уровне командных нейронов виноградной улитки 216
4.5.2. Исследование роли аденилатциклазной системы в обучении 225
4.5.2.1. Влияние увеличения содержания цАМФ в изолированном препарате на изменение параметров электрической активности командных нейронов интактных и обученных улиток 225
4.5.2.2. Анализ изменений электрических характеристик командных нейронов интактных и обученных улиток при добавлении 8-Вг-сАМР
в омывающий раствор 226
4.5.2.3. Анализ изменений электрических характеристик командных нейронов интактных и обученных улиток при добавлении форсколина в омывающий раствор 226
4.5.2.4. Анализ изменений электрических характеристик командных нейронов интактных и обученных улиток при добавлении IB MX
в омывающий раствор 227
4.5.3. Исследование эффектов действия антагониста кальмодулина и нейролептика хлорпромазина 231
4.5.3.1. Влияние хлорпромазина на оборонительные реакции и локомоцию виноградной улитки 231
4.5.3.2. Влияние хлорпромазина на электрические характеристики идентифицируемых нейронов 232
4.5.4. Исследование эффектов кофеина на процессы обучения 235
4.5.4.1. Поведенческий и электрофизиологический анализ эффектов хронического ведения кофеина на формирование условного оборонительного рефлекса 235
4.5.4.2. Электрофизиологический анализ эффектов аппликации кофеина в изолированном препарате интактных и обученных улиток 238
4.5.5. Исследование эффектов ингибитора фосфодиэстеразы IB MX на процессы обучения 239
4.5.5.1. Поведенческие исследования действия хронического введения ингибитора фосфодиэстеразы IB MX 239
4.5.5.2. Электрофизиологические исследования действия хронического введения ингибитора фосфодиэстеразы IBMX 240
Заключение 248
Выводы 262
Список литературы
- Ассоциативное обучение у животных с простой нервной системой
- Роль ионов кальция в генерации потенциалов действия в соме и в аксоне нейрона. Кальциевые и кальций зависимые калиевые каналы
- Участие ионов кальция в интегративной деятельности нервной клетки
- Влияние 5, 6-дигидрокситриптамина на выработку условного оборонительного рефлекса на постукивание по раковине
Введение к работе
Актуальность исследования. Известно, что консолидация памяти проходит через несколько фаз (Milner B. et al., 1998; McGaugh J.L., 2000). Если в кратковременную и промежуточную (по предложению некоторых авторов) фазы она является лабильной и в это время может наступить амнезия в результате воздействия целого ряда агентов, то фаза долговременной памяти является устойчивой, прежде всего к блокаде биосинтеза белка (Davis H.P., Squire L.R., 1984; Роуз С., 1995; Анохин К.В., 1997; Lechner H.A. et al., 1999). Еще в 60-х годах было предположено, что долговременная память не только неустойчива (лабильна) сразу после обучения, но становится снова таковой после реактивации, а именно после вспоминания (Misanin J.R. et al., 1968; Sara S.J., 2000). Недавно была показана возможность амнезии памяти при реактивации у крыс (Nader K. et al., 2000). Результаты привели авторов к заключению, что, когда долговременная память реконсолидируется, то для стабилизации требуется новый синтез белка, как и после начального обучения. Контекстуально специфическое обучение и память о нем найдена также у некоторых беспозвоночных животных (Colwill R.M. et al., 1988; Haney J., Lukowiak K., 2001; Child et al., 2003; Lukowiak K. et al., 2003; Солнцева С.В. и др., 2006). Имеющиеся данные позволяют предположить, что после реактивации долговременная память или способность к воспроизведению памяти становятся чувствительными к ингибиторам белкового синтеза после начального обучения (Anokhin K.V. et al., 2002; Arshavsky Yu.I., 2003). Однако есть исследования, в которых не нашли этого феномена (Cammarota M. et al., 2004), ряд авторов демонстрируют трудность экспериментального разделения животных разных протоколов (Garelick M.G., Strom D.R., 2005). Также показано, что важную роль в процессе реконсолидации может играть активация МАР киназы (Kelly A. et al., 2003) и протеинкиназы А (Kemenes G. et al., 2006).
Изучение роли мембранных характеристик нейронов и параметров синаптической передачи в механизмах обучения, представляет большой интерес (Byrne J.H., 1987; Benjamin P.R. et al., 2000; Kandel E.R., 2001; Balaban P.M., 2002; Crow T.J., 2004; Нистратова В.Л., Пивоваров А.С., 2004; Crisp K.M., Muller K.J., 2006; Соколов Е.Н., Незлина Н.И., 2007; Mozzachiodi R. et al., 2008). Речь идет о мембранных системах клетки, что определяется, во-первых, ключевой ролью нейрона в интегративной деятельности мозга, а во-вторых, тем, что в основе клеточных механизмов обучения и памяти лежат биофизические и биохимические характеристики нервных клеток, которые дают важное звено для перехода кратковременных пластических изменений в долговременные. К настоящему времени нет недостатка в доказательствах решающей роли ионов Са2+ в индукции ассоциативных и неассоциативных форм обучения (Hawkins R.D. et al., 1993; Schaffhausen J.H. et al., 2001; Никитин В.П., Козырев С.А., 2002). Ионы кальция играют чрезвычайно важную роль в регуляции большого разнообразия нейрональных процессов, что обусловлено их специфическими физико-химическими характеристиками, благодаря которым они являются наиболее универсальным внутриклеточным посредником (Костюк П.Г., 1986; Brini M., Carafoli E., 2000; Rizzuto R. et al., 2002; Волков Е.М. и др., 2002; Rusakov D.A., 2006).
Все клетки должны иметь механизмы, позволяющие им контролировать состояние окружающей среды и отвечать на происходящие в ней изменения. Медиатор оказывает свое влияние на рецептор через образование комплекса «лиганд-рецептор», затем информация должна быть передана внутрь клетки, чтобы возник клеточный ответ (Геннис Р., 1997; Smith C.U.M., ed., 2002). Серотонин является одним из широко распространенных и хорошо изученных медиаторов нервной системы (Kandel E.R., Schwartz J.H., 1982; Сахаров Д.А., 1990; Burrell B.D., Sahley C.L., 1999; 2005; Захаров И.С., 2001; Пивоваров А.С., Нистратова В.Л., 2003; Gillette R., 2006). Особенно важным является иннервация серотонином центральных генераторов и других возбуждающих цепей, а также поддержка общей поведенческой активности (Zakharov I.S. et al., 1995; Whitaker-Azmitia P.M., 1999; Дьяконова В.Е., 2007). Воздействия присоединившихся к рецепторам на поверхности клетки медиаторов и гормонов на внутриклеточные процессы обмена опосредуются промежуточными соединениями, называемыми вторичными посредниками. Среди них существенную роль играет аденилатциклазная система, которая модулируется серотонином (Yanow S.K. et al., 1998; Гринкевич Л.Н., 2000; Dyer J.L. et al., 2003). Факторы, влияющие на образование и распад цАМФ, достаточно хорошо изучены. Внутриклеточная концентрация цАМФ находится под контролем двух противоположно направленных процессов и опосредуется относительной активностью аденилатциклазы, образующей цАМФ из АТФ, с одной стороны, и фосфодиэстеразы, разрушающей циклический нуклеотид с образованием 5`АМФ - с другой (Кольман Я., Рем К.-Г., 2000; Tasken K., Aandahl E.M., 2004). Имеющиеся данные свидетельствуют о функциональной зависимости между двумя вторичными посредниками - цАМФ и Са2+, а также между двумя системами - аденилатциклазной и системой мобилизации ионов Са2+ (Пивоваров А.С. и др., 1989; Martin K.C. et al., 1997; Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф., 2002; Никитин В.П., 2006).
Одним из агентов, вызывающих увеличение внутриклеточной концентрации ионов Ca2+, является кофеин (Orkand R.K., Thomas R.C., 1995; Berridge M.J., 1998; Rusakov D.A., 2006). Установлено, что кофеин вызывает высвобождение ионов Ca2+ из эндоплазматического ретикулума, ингибирует также фермент фосфодиэстеразу, что в результате приводит к повышению в клетках уровня цАМФ (Howell L.L. et al, 1997; Brini M., Carafoli E., 2000; Celenza K.M. et al., 2007). В последнее время появились работы, свидетельствующие о том, что кофеин может оказывать противоположные эффекты на разных стадиях консолидации памяти и что его воздействие зависит от формы обучения (Angelucci M.E.M. et al., 1999).
Для решения этих вопросов широко используются моллюски, обладающие относительно простой нервной системой с идентифицируемыми клеточными элементами и достаточно сложным поведенческим репертуаром. Результативными оказались эксперименты на брюхоногих моллюсках и упрощенных моделях, направленные на изучение клеточных основ ассоциативного обучения (Сахаров Д.А., 1974; Кэндел Е., 1980; Соколов Е.Н., 1981; Максимова О.А., Балабан П.М., 1983; Alkon D.L., 1984; Carew T.J., Sahley C.L., 1986; Балабан П.М., Захаров И.С., 1992; Никитин В.П., Козырев С.А., 1995; Byrne J.H., Kandel E.R., 1996; Benjamin P.R. et al., 2000; Палихова Т.А., 2000; Пивоваров А.С., Богуславский Д.В., 2000; Lukowiak K. et al., 2003; Гринкевич Л.Н. и др., 2006; Балабан П.М., 2007).
Таким образом, исследование мембранных механизмов, а также изменений активности внутриклеточной сигнальной системы, сопутствующих сохранению условного оборонительного рефлекса и изучение реконсолидации долговременной памяти представляется актуальной задачей в рамках проблемы нейробиологии обучения и памяти.
Цель и основные задачи исследования. Цель данной работы – исследование долговременной памяти у виноградной улитки, включая анализ мембранных коррелятов, роли ионов кальция, серотонина и аденилатциклазной системы в сохранении условного оборонительного рефлекса, а также особенностей зависимости формирования условного обстановочного рефлекса от белкового синтеза.
Исходя из поставленной цели, были намечены следующие основные задачи исследования:
1) исследовать возможность существования у виноградной улитки фазы реконсолидации памяти, чувствительной к блокаде синтеза белка, при напоминании (реактивации) после выработки обстановочного условного рефлекса;
2) проанализировать роль подкрепления в реконсолидации обстановочного условного рефлекса у виноградной улитки;
3) исследовать мембранные механизмы формирования условного оборонительного рефлекса и длительность сохранения изменений электрических характеристик командных нейронов виноградной улитки после его выработки;
4) проанализировать роль ионов Са2+ в изменениях электрических характеристик командных нейронов улиток после выработки условного оборонительного рефлекса;
5) исследовать роль Са2+- и Са2+- зависимых К+- каналов в изменениях электрических характеристик командных нейронов улиток после выработки условного оборонительного рефлекса;
6) изучить эффекты антител к Са2+- связывающему белку S100B на электрические характеристики командных нейронов виноградной улитки после обучения;
7) провести исследования эффектов действия нейротоксических аналогов серотонина 5,6- и 5,7-дигидрокситриптамина и нейролептика хлорпромазина на поведенческие реакции виноградной улитки и электрические характеристики командных нейронов;
8) изучить изменения возбудимости командных нейронов виноградной улитки в ответ на действие серотонина при обучении;
9) исследовать эффекты хронического введения кофеина и ингибитора фосфодиэстеразы IBMX на выработку условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки.
10) изучить электрофизиологические эффекты хронического введения кофеина и ингибитора фосфодиэстеразы IBMX на выработку условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки.
Положения, выносимые на защиту:
-
Долговременная обстановочная память у улиток при напоминании обстановки проходит стадию реконсолидации, для которой необходим синтез белка. В случае предъявления напоминания контекста одновременно с подкреплением нарушения реконсолидации памяти при блокаде белкового синтеза не происходит.
-
В механизмы обучения у виноградной улитки вовлечены изменения мембранного потенциала, а также серотонинергической и аденилатциклазной систем: долговременным эффектом обучения является снижение возбудимости командных нейронов оборонительного поведения в ответ на внеклеточный серотонин, долговременное снижение их мембранного и порогового потенциалов, повышение активности фосфодиэстеразы цАМФ в командных нейронах. Скорость формирования условного оборонительного рефлекса увеличивается при хроническом введении кофеина и ингибитора фосфодиэстеразы цАМФ.
Научная новизна. Впервые на моллюсках обнаружено явление зависимого от белкового синтеза процесса реконсолидации долговременной памяти, когда может быть нарушено воспроизведение обстановочного условного рефлекса после блокады биосинтеза во время напоминания. Впервые показана связь процесса реконсолидации долговременной памяти с подкрепляющим стимулом - инъекция анизомицина после напоминания в сочетании с подкрепляющим стимулом не оказывала влияния на контекстуальную память.
Найдено, что введение в омывающий раствор серотонина вызывает деполяризационный сдвиг мембранного потенциала командных нейронов как интактных, так и обученных улиток, а у улиток после формирования условного рефлекса снижается возбудимость командных нейронов (повышение порогового потенциала) при действии внеклеточного серотонина. Показано, что хроническое воздействие хлорпромазина приводит к деполяризационному сдвигу мембранного потенциала и снижению порога генерации потенциала действия командных нейронов виноградной улитки и мотонейронов закрытия пневмостома, как и введение 5,6- DHT. Впервые обнаружено, что в результате выработки условного оборонительного рефлекса и условного рефлекса (УР) аверзии к пище происходит снижение мембранного и порогового потенциалов в командных нейронах оборонительного поведения, что может происходить за счет потенциал-зависимых К+-каналов, Са2+-зависимых К+-каналов, быстрых К+-каналов, Са2+-зависимых К+-каналов высокой проводимости, Са2+-каналов L-типа. Найдено, что эти изменения электрических характеристик командных нейронов сохраняются в течение времени сохранения поведенческих реакций.
Среди спонтанно активных идентифицированных нейронов виноградной улитки обнаружены клетки, отвечающие на аппликацию антител к Са2+- связывающему белку S100 (АS100) увеличением частоты генерации ПД, а также нейроны, отвечающие уменьшением частоты генерации ПД. Впервые обнаружено, что снижение внутриклеточной концентрации Са2+ применением мембранопроникающего хелатора BAPTA-AM, не вызывающего изменений мембранного и порогового потенциалов командных нейронов интактных и обученных улиток, не только снимает деполяризационный эффект антител к Са2+-связывающему белку S100 у интактных улиток, но и приводит у них к гиперполяризации командных нейронов, в то время как у обученных улиток наблюдается только уменьшение деполяризационного эффекта. Эти результаты свидетельствуют о том, что антитела к Са2+-связывающему белку S100 действуют на систему внутриклеточного кальция. Обнаружено разнонаправленное действие кофеина в концентрациях 2 и 15 мМ/л на электрические характеристики командных нейронов виноградной улитки: снижение порогового потенциала при неизменном мембранном потенциале для концентрации 2 мМ/л и снижение мембранного потенциала при неизменном пороговом потенциале для концентрации 15 мМ/л как у интактных, так и у обученных улиток.
Впервые найдено, что хроническое введение, как кофеина, так и ингибитора фосфодиэстеразы IBMX сразу после процедуры обучения увеличивает скорость формирования условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки по сравнению с улитками активного контроля и показан деполяризационный сдвиг мембранного потенциала командных нейронов после этих воздействий. Отсутствие суммирования изменений мембранного потенциала командных нейронов при обучении и применении кофеина и IBMX указывает на повышение активности аденилатциклазы при формировании условного оборонительного рефлекса у виноградной улитки. Показано, что аппликация водорастворимого аналога цАМФ - 8Br-cAMP и активатора аденилатциклазы форсколина вызывает деполяризацию командных нейронов как у интактных, так и у обученных улиток. Однако неспецифический ингибитор фосфодиэстеразы – IBMX вызывает деполяризационный сдвиг мембранного потенциала только у обученных улиток. Эти результаты свидетельствуют, что у обученных улиток происходит долговременное увеличение активности фосфодиэстераз, по сравнению с интактными животными.
Научно-практическая ценность. Впервые у виноградной улитки показано, что напоминание условий выработки обстановочного УР приводит к возникновению процесса реконсолидации, чувствительного к блокаде синтеза белка. Чувствительность реконсолидированной памяти к белковому синтезу в настоящее время резко меняет отношение исследователей и практиков к вопросам долговременной памяти. Демонстрация того, что подкрепляющий стимул взаимодействует со стимулом напоминания, создает условия для применения воздействий, приводящих к реконсолидации долговременной памяти.
Установление факта деполяризационного сдвига мембранного потенциала и снижение порогового потенциала при формировании условных рефлексов, а также сохранение изменений этих характеристик в течение длительного времени расширяет представления физиологии о механизмах ассоциативного обучения на клеточном уровне в центральной нервной системе животных. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли серотонина в процессах обучения и памяти. Они позволяют оценить вклад серотонинергической системы не только в синаптическую передачу, но и в формирование мембранных характеристик нейронов, а также предположить один из возможных механизмов интегративной функции серотонина, когда пороговый потенциал командных нейронов в ответ на серотонин меняется в результате обучения. Из полученных результатов следует, что эффекты хлорпромазина на локомоцию и оборонительные реакции виноградной улитки можно объяснить, исходя из его серотонин истощающего действия. Результаты, свидетельствующие об увеличении скорости формирования условного оборонительного рефлекса при хроническом введении кофеина и ингибитора фосфодиэстеразы IBMX сразу после процедуры обучения, а также их электрофизиологические эффекты позволяют составить более полное представление о роли ионов кальция и системы фосфодиэстераз в механизмах обучения и сохранения долговременной памяти.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговых конференциях Казанского научного центра РАН (Казань, 2001-2006 г.г.); 8 Всероссийской школе молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии» (2001 г.); Central European Conference of Neurobiology (Krakw, Poland, 2001 г.); IBRO Summer School 2001 “Neuronal transmission: microphysiology of synaptic currents and receptor function” (Tihany, Hungary, 2001); XVIII съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань 2001 г.); 6, 9, 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино 2002, 2005, 2006 г.г.); VI и VII Всероссийских симпозиумах “Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке” (Казань, 2002 г. и Набережные Челны, 2004 г.); IV съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002 г.); 3-rd Forum of Federation of European Neuroscience Societies (Paris, 2002 г.); IBRO Summer School 2002: “Contemporaty approaches to the study of CNS function using electrophysiological, behavioral and imaging techniques” (Prague, 2002 г.); Международном симпозиуме “Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals” (Moscow, Russia, 2003); XIX съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Екатеринбург 2004 г.); III Съезде Биофизиков России (Воронеж, 2004 г.); Всероссийской конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005 г.); Международном симпозиуме «Mechanisms of adaptive behavior». (Санкт-Петербург, 2005 г.); I съезде физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 2005 г); Всероссийских конференциях молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2005; 2007; 2008; 2009 г.г); V и VI Сибирских физиологических съездах (Томск, 2005 г.; Барнаул, 2008 г.); 7-th, 8-th, 9-th East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology “Simpler Nervous Systems” (Kaliningrad, 2003 г.; Kazan, 2006 г.; S-Peterburg, 2009 г.); XX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва. 2007 г); IX Всероссийской научно-теоретической конференции "Физиологические механизмы адаптации растущего организма" (Казань, 2008 г.); конференции с международным участием "Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций" (Москва, 2008 г.).
Реализация результатов исследования. Материалы исследования отражены в 19 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, в 2 учебных пособиях, 1 монографии и в 52 тезисах докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 381 страниц состоит из введения, четырех глав (каждая из которых включает в себя обзор литературы, описание объекта и методов исследования, результаты исследования и их обсуждение), общего заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 588 источников, из них – 408 иностранных авторов. Диссертация иллюстрирована 92 рисунками и содержит 6 таблиц.
Ассоциативное обучение у животных с простой нервной системой
При развитии современных методов клеточной и молекулярной биологии обучение и память становятся более доступными для изучения у позвоночных и беспозвоночных животных (Carew Т.J., Sahley C.L., 1986; Воронин Л.Л., 1987; Byrne J.H, 1987; Balaban P.M., 1993; Hawkins R.D. et al., 1993; Frysztak R.D., Crow Т., 1994; Пивоваров A.C., 1995; Matzel L.D. et al., 1998; Захаров И.С. и др., 2001; Balaban P.M., 2002b; Crow Т., Tian L.M., 2003; Lukowiak K. et al., 2003; Никитин В.П., 2006; Nikitin E.S. et al., 2006; Hawkins R.D. et al., 2006). Поэтому у исследователей теперь есть возможность установить основные принципы и механизмы обучения и определить чем они различаются и что у них общего.
Несмотря на большое разнообразие форм условнорефлекторных реакций, существование различных классификаций, на особенности условнорефлекторных реакций у разных видов животных, их принципиальное единство не вызывает сомнений. И.П.Павловым и его учениками было установлено, что условные реакции вырабатываются на основе использования обычного аппарата безусловных рефлексов (Асратян Э.А., 1983). Показано, что сочетание двух раздражений представляет собой ассоциацию совпадающих во времени воздействий, в результате которой происходят перестройки в центральной нервной системе (ЦНС), сопровождающиеся появлением нового, временного эффекта на структурно не связанное с ним внешнее раздражение. При этом раздражение (подкрепление) должно иметь биологическое значение для организма (Woody CD., 1986; Thompson R.F., 1987; Соколов E.H., 1987; Балабан П.М., 1997). Э.А.Асратян (1983) предложил несколько критериев отличия условных рефлексов от родственных им явлений. В число критериев входит хроничность или длительность сохранения рефлекса, способность самостоятельно восстанавливаться после активного угашения, специфичность к условному раздражителю, возможность сформировать дифференцировку раздражителей, а также специфичность к сочетанному предъявлению либо индифферентного и биологически важного, либо двух биологически существенных раздражителей.
В настоящее время большинство исследователей не сомневаются в возможности выработки ассоциативных модификаций поведения у брюхоногих моллюсков. Первая работа, в которой была доказана ассоциативность наблюдаемых в ходе обучения изменений поведения, была проведена на хищном моллюске Plenrobranchaea californica (Mpitsos G.G., Davis W.L., 1973). Тактильное раздражение оральной области необученного плевробранха вызывало рефлекс отдергивания головы. Сочетание тактильного стимула с пищевым стимулом (подачей гомогената кальмара) вело к уменьшению величины этого рефлекса, а затем к классическому обусловливанию - пищевой реакции в ответ на тактильное раздражение. Таким образом, сначала у животных формировали условный пищевой рефлекс, а затем вырабатывали условную реакцию отказа от пищи, наказывая экспериментальных животных электрическим током. При этом второй рефлекс появлялся намного быстрее первого. Позднее авторы упростили форму выработки условного рефлекса, сразу прибегнув к аверзивному рефлексу на пищу (Mpitsos G.G. et al., 1978; Kovac M.P. et al., 1986). Контрольные моллюски, получавшие изолированные тактильные раздражения без подкрепления пищи или несочетанные предъявления пищи и электрического раздражения, сохраняли пищевые реакции в ответ на условный стимул. Выработанный рефлекс сохранялся в течение четырех недель, полученные в процессе обучения модификации, были избирательны по отношению к кондиционирующему стимулу и поддавались дифференцировке. Аверзивное обусловливание на пищу вырабатывали также у аплизии. Условным стимулом (УС) служил экстракт креветок, пищи подкреплялась электрическим током, наносимым в область головы. Применение сочетаний пищи с электрическим раздражением (по 3 сочетания в течение 3 дней) приводило к угнетению пищевых реакций (Walters Е.Т. et al., 1982), но полный рефлекс не вырабатывался.
Детальное исследование возможности выработки условного рефлекса были проведены на слизне Ытах (Gelperin А., 1975). Вырабатывалась аверзия к пище путем сочетания предъявления одного вида пищи (грибов) с экспозицией углекислого газа, применяя одно сочетание в день. У слизней вырабатывался устойчивый УР, который имел дифференцировку на другой вид пищи (картофель) и сохранялся в течение трех недель. Вырабатывается таюке стойкий УР отказа от пищи после сочетания ее с веществом горького вкуса - гуанидинсульфатом у слизня, который подвергался дифференцировке, и сохранялся длительное время (Sahley C.L. et al., 1981). У виноградной улитки таюке вырабатывали рефлекс аверзии к пище при сочетании пищи с веществом горького вкуса - хинином (Никитин В.П., Козырев С.А. 1993). При выработке обучения на губу улитки в течение 30 с апплицировали морковный сок (условный стимул). Сразу после окончания его аппликации на голову наносили 5-10%-ный раствор хинина. В результате предъявления 1-5 сочетаний с интервалом 15 минут оборонительная реакция на УС появлялась и усиливалась с 90 по 120 мин от момента первого сочетания стимулов.
Формирование пищедобывательной реакции служит одним из доказательств истинного условного рефлекса у моллюсков. Была показана возможность выработки пищедобывательного рефлекса (поворот головы в нужную сторону) в ответ на тактильное раздражение, подкреплявшегося кусочком морковки (Максимова О.А., 1979). Пищедобывательная реакция вырабатывалась на все раздражители, которые применялись в качестве условных, для упрочения УР требовалось до 400 сочетаний, рефлекс сохранялся до 6 недель. Очень интересное исследование по формированию условного оборонительного рефлекса на пищу у виноградной улитки было проведено О.А.Максимовой (Максимова О.А., Балабан П.М., 1983). При сочетании условного стимула (кусочек моркови) с электрическим раздражением условный оборонительный рефлекс вырабатывался и становился прочным в среднем после 10 сочетаний, который мог быть угашен после 40-60 предъявлений условного стимула без подкрепления и спонтанно восстанавливался. УР на определенный вид пищи был достаточно прочен, т.к. сохранялся в течение 3 недель. Существенным было, что у виноградной улитки легко формировалась дифференцировка к другим видам пищи
Роль ионов кальция в генерации потенциалов действия в соме и в аксоне нейрона. Кальциевые и кальций зависимые калиевые каналы
Уже существуют доказательства, что высвобождение кальция из шипикового аппарата, вероятно, обеспечивает высоко-локализованные и вход-специфические кальциевые сигналы для индукции синаптической пластичности (Korkotian Е., Segal М., 1998). Во-вторых, небольшое повышение количества инозитол-3-фосфата, которое не способно напрямую стимулировать высвобождение, может увеличивать чувствительность к кальцию инозитол-3-фосфатных рецепторов, таким образом, превращая цитоплазму в возбуждающую среду, способную генерировать Са -волны. Еще одним фактором, регулирующим возбудимость, является степень заполнения кальцием пространства эндоплазматического ретикулума, однако механизм такого воздействия еще не выяснен (Berridge M.J., 1998). Эндогенным лигандом, активирующим инозитол-3-фосфатный рецептор, является инозитол-три-фосфат в концентрации 1-5 нМ. Для инозитол-3-фосфатных рецепторов описаны три изоформы молекул, основным критерием различия которых является разная чувствительность к основному агонисту - инозитол-3-фосфату. Все три формы в разной степени представлены в ЦНС.
Другим путем Са - обмена в эндоплазматическом ретикулуме являются рианодиновые рецепторы. Рианодиновый рецептор также является тетрамером, формирующим неселективную ионную пору, при взаимодействии с ионами кальция или Mg2+-ATO он способен образовывать Са2+-канал, по которому Са2+ поступает из полости ретикулума в цитоплазму (Rubtsov A.M., Batrukova М.А., 1997). Рецептор содержит несколько связывающих сайтов: сайт связывания двухвалентных катионов, связывающих Са2+ и Mg2+, метилксантин связывающий сайт, обладающий высоким сродством к кофеину, и аденозин связывающий сайт (Holden СР. et al., 1996).
Локальное повышение концентрации С а , вызванное его входом извне, способно активировать рианодиновый кальциевый канал (Berridge M.J., 1998; Rizzuto R., Pozzan Т., 2006).
Участие ионов кальция в интегративной деятельности нервной клетки Ионы кальция, поступающие внутрь клетки во время ее возбуждения, с одной стороны приводят к изменению свойств ионных каналов мембраны, а с другой стороны служат сигналами для активации различных биохимических реакций. Таким образом, ионы кальция, осуществляя связь между электрическими явлениями, происходящими в поверхностной мембране клетки, и реакциями, протекающими внутри нее, принимают непосредственное участие в интегративной деятельности нервной клетки (Костюк П.Г., 1986; Berridge M.J., 1998; Blackwell К.Т., Alkon D.L., 1999; Зефиров А.Л., Ситдикова Г.Ф., 2002; Verkliratsky А., 2005). Ионы Са2+ играют огромную роль в запуске различных клеточных реакций. Биохимический механизм такого запуска состоит из двух основных звеньев: во-первых, поступающие в клетку во время ее возбуждения ионы Са взаимодействуют со специфическими нейронными белками, кальмодулином и тропонином С; во-вторых, комплексы Са"+-белок взаимодействуют со специфическими энзиматическими системами, обеспечивающими фосфорилирование других белков, непосредственно участвующих в выполнении соответствующей клеточной функции (Костюк П.Г., 1986; Brini М., Carafoli Е., 2000; Rizzuto R. et al., 2002).
Внутриклеточным рецептором ионов Са является кальмодулин -термостабильный Са -связывающий белок, который, присоединяя ионы Са , становится активным для взаимодействия с белками (Кольман Я., Рем К. Г., 2000). Комплекс Са -кальмодулин может модифицировать биологически-активные макромолекулы, как непосредственно соединяясь с ними, так и фосфорилируя их через предварительную активацию протеинкиназ. Комплекс Са -кальмодулин также активирует регуляторные ферменты - цАМФ-зависимую фосфодиэстеразу, гидролизующую цАМФ до АМФ, аденилатциклазу, фосфолипазу А и целый ряд киназ (Yanow S.K. et al., 1998; Крутецкая З.И. и др., 2003). Са2+-кальмодулиновый комплекс модулирует активность потенциал зависимых К+-каналов (Onozuka М. et al., 1987). Активность кальмодулина регулирует кальмодулин связывающий белок кальцийнейрин, он ингибирует комплекс Са"+-кальмодулин, связывая его (Пивоваров А.С. и др., 1989). Очень интересно, что в запуске биохимических процессов непременно принимают участие ионы Са2+, запускающие каскад вторичных посредников, набор которых одинаков в пре- и постсинаптических нейронах, но изменения могут идти разными путями (Smith С. et al., 1998; Brini М., Carafoli Е., 2000; Rizzuto R., Pozzan Т., 2006). Внутриклеточные ионы Са2+ и циклические нуклеотиды, которые часто объединяются в систему вторичных посредников -мессеиджеров, тесно взаимодействуют в запуске или регуляции различных сторон клеточной деятельности; вместе с тем их роль далеко не идентична, а конечный результат зависит от функциональной роли тех белковых структур, которые подвергаются фосфорилированию (Пивоваров А.С. и др., 1989; Manseau F. et al., 1998; Гринкевич Л.Н., 2001; Балабан П.М., 2007).
Са является единственным вторичным посредником, функционирующим во всех типах живых клеток: от бактерий и растений - до различного рода высокоспециализированных клеток млекопитающих (Глебов Р.Н., Крыжановский Г.Н., 1984). В отличие от большинства других вторичных посредников, например циклических нуклеотидов, диацилглицерина, фософоинозитидов и др., представляющих собой быстро метаболизирующие эффекторные молекулы, Са является неметаболизирующим (стабильным) соединением. Следовательно, его внутриклеточный уровень регулируется иным способом, а именно посредством изменения концентрации, доступной Са2+-связывающим белкам-мишеням (Brini М., Carafoli Е., 2000; Крутецкая З.И. и др., 2003). К последним относятся: интегральные мембранные белки (Са -каналы, Са -насосы, Na /Са -ионообменик), ответственные за активное связывание ионов Са +, внутриклеточные Са2+-депонирующие белки, осуществляющие пассивное связывание ионов Са2+ в цитозоле и растворимые, так называемые «триггерные», Са -связывающие белки, которые непосредственно модулируют активность различного рода эффекторных молекул. Согласованная работа всех перечисленных механизмов приводит к тому, что выполняется главное условие, определяющее возможность выполнения кальцием функции вторичного посредника - наличие высокого концентрационного градиента. В покоящихся клетках, в отсутствие специфического внешнего стимула, концентрация ионизированного кальция примерно в 20 000 раз ниже его концентрации во внеклеточной среде. При воздействии внешнего сигнала активируются определенные Са -каналы, в результате чего уровень кальция в цитозоле резко (на 1-2 порядка)
Участие ионов кальция в интегративной деятельности нервной клетки
Животным предъявляли электрические стимулы в область головы 4 раза в день в течение 4-х дней с интервалом в 1,5-2 часа. Длительность каждого стимула составляла 1/2 с. Ток имел следующие характеристики: прямоугольные импульсы тока амплитудой 6-8 мА, длительностью 10 мс, частотой 50 Гц. Действительная амплитуда тока при стимуляции контролировалась по экрану осциллографа. Животные во время нанесения электрического раздражения находились на медной пластине-электроде, покрытой слоем смоченной в воде бумаги. Второй электрод представлял собой металлический стержень, который прикладывался в область головы улитки. Животные контрольных групп проходили те же процедуры, что и опытные, но без предъявления им электрошоковой стимуляции. Критерием выработки ДС служило значительное увеличение времени закрытого состояния пневмостома в ответ на предъявление тестирующего раздражения по сравнению с исходной реакцией. Только полное закрытие пневмостома определялось как положительная реакция на стимул.
Контролем во всех экспериментах служила регистрация электрических характеристик нейронов нервной системы моллюска, которая находилась в нормальном солевом растворе для виноградных улиток - NaCl-80 mM/л, КС1-4 тМ/л, СаС12-10 тМ/л, MgCl2-5 тМ/л, NaHC03-5 тМ/л.
Одним из агентов, вызывающих увеличение внутриклеточной концентрации ионов Са2+, является кофеин (Berridge M.J., 1998; Ткачук В.А., 2001). Однако кофеин оказывает различное влияние на нервную систему, которое зависит от его концентрации (Howell L.L. et al, 1997; Celenza K.M. et al., 2007). Это - действие на аденозиновые рецепторы, на рецепторы ГАМК, но, прежде всего кофеин блоїшрует фосфодиэстеразы и увеличивает внутриклеточную концентрацию ионов Са2+. Методом фиксации потенциала на виноградной улитке было показано, что дозы кофеина 0,2-1 мМ/л усиливают амплитуду Са2+-токов, вызванных деполяризующим скачком потенциала (Orkand R.K., Thomas R.C., 1995). В то же время на вкусовых рецепторных клетках и фоторецепторах было показано увеличение концентрации внутриклеточного Са2+ при действии кофеина в концентрациях 10 и 20 мМ/л (Linn C.L., Gafka А.С., 2001; Zhao F.-L. et al., 2002). Поэтому в этой серии наших экспериментов было проведено изучение эффектов разных концентраций кофеина, которые действуют на фосфодиэстеразы (см. следующий раздел) и внутриклеточную концентрацию ионов Са соответственно 2 и 15 мМ/л.
Увеличение внутриклеточной концентрации кальция достигалось с помощью погружения нервной системы моллюска в раствор, содержащий кофеин (агонист рианодиновых рецепторов): NaCl-80 тМ/л, КС1-4 тМ/л, СаС12-10 тМ/л, MgCl2:5 тМ/л, NaHC03-5 тМ/л, Caffeine (1,3,7- Trimethylxanthine) - 15 тМ/л.
Для снижения содержания кальция внутри клетки использовали инъекцию медленного хелатора кальция - ЭГТА (EGTA - ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N , N - tetraacetic acid) (Sigma). Инъекция производилась в течение 5 минут с силой тока 1нА через регистрирующий микроэлектрод, который был заполнен 0,5 М/л раствором ЭГТА, затем каждые 5 минут регистрировались электрические характеристики в течение 30 минут.
Для снижения содержания кальция внутри клетки использовали также аппликацию внутриклеточной буферной системы ВАРТА-AM (1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N ,N etraacetic acid tetrakis(acetoxymethyl ester)). Этот мембранопроникающий буфер для ионов кальция был использован в связи с его высокой аффинностью и скоростью связывания ионов кальция внутри нервной клетки вследствие наличия эфирной группы, прикрывающей полярный конец этой молекулы. Отрицательный заряд при этом нивелируется и это дает способность проникать молекулам кальциевых хелаторов внутрь клетки. В свою очередь ферментные системы - неспецифические эстеразы, находящиеся в цитозоле клетки отстригают эфирные группы и переводят молекулы буферов в активное состояние. После приобретения заряда молекулы ВАРТА-AM остаются в цитозоле и связывают ионы кальция. Для работы была использована концентрация ВАРТА-AM в 10"4 М/л. Сначала был сделан маточный раствор этого хелатора в DMSO, который перед экспериментом разводился в нужном количестве физиологического раствора.
Для изучения роли Са2+-активируемых калиевых каналов высокой проводимости применялся специфический блокатор кальций-активируемых калиевых каналов ибериотоксин в концентрации 10"7М/лт
Увеличение внутриклеточной концентрации кальция в условиях блокады потенциал зависимых Са2+-каналов L-типа происходило в растворе, содержащем кофеин и верапамил: NaCl-80 тМ/л, КС1-4 тМ/л, СаС12-10 тМ/л, MgCl2-5 тМ/л, NaHC03-5 тМ/л, Caffeine (1,3,7- Trimethylxanthine)-2 тМ/л; Verapamil hydrochloride -0,5 тМ/л.
Увеличение внутриклеточной концентрации кальция в условиях блокады Са2+-зависимых К+-каналов происходило в растворе, содержащем кофеин и хинин: NaCl-80 тМ/л, КС1-4 тМ/л, СаС12-10 тМ/л, MgCl2-5 тМ/л, NaHC03-5 тМ/л, Caffeine (1,3,7rimethylxanthine)-2 тМ/л; Qunine hydrochloride 0,2 тМ/л.
Таюке были проведены эксперименты с одновременным воздействием кофеина 15 мМ/л для увеличения внутриклеточной концентрации кальция и вариацией содержания внеклеточного кальция (20, 10 и 2, 5 мМ/л) у интактных и обученных улиток.
Для исследования роли кальций-связывающего белка S100 использовали моноспецифическую иммунную сыворотку к S100 (Институт цитологии и генетики СО РАН), разведенную физиологическим (солевым) раствором для виноградной улитки в соотношении 1:5. Количество лиофилизированного продукта составляло 12 мг на 1 мл раствора.
Влияние 5, 6-дигидрокситриптамина на выработку условного оборонительного рефлекса на постукивание по раковине
С чем же связан такой эффект хлорпромазина у моллюсков? Важным свойством нейролептиков является блокада дофаминовых рецепторов, что снижает патологически повышенный тонус дофаминергической системы мозга (Раевский К.С. и др., 1996). С другой стороны, недавно был обнаружен другой, ранее не известный, способ действия хлорпромазина - способность его существенно снижать содержание серотонина в нервной ткани (Baker M.W. et al., 1995; Croll R.P. et al., 1997). Серотонин, как трансмиттер, играет ключевую роль, как в периферической, так и в центральной нервной системе многих типов (Walker R.G. et al., 1996; Дьяконова В.Е., Сахаров Д.А., 2001). Показано, что серотонин включен в контроль таких важных форм поведения у моллюсков, как оборонительное поведение, пищевое поведение, локомоция, репродукция, циркадные ритмы (Балабан П.М., Захаров И.С, 1992). Инъекция серотонина вызывает увеличение скорости локомоции моллюсков без изменения длины подошвы ноги (Pavlova G.A., 2001). В предыдущем разделе работы нами было показано, что инъекция нейротоксического аналога серотонина 5,6-DHT вызывала в командных нейронах виноградной улитки деполяризационный сдвиг мембранного потенциала и уменьшение порогового потенциала, что было объяснено воздействием на серотониновые входы этих клеток.
Поэтому нам представлялось целесообразным сравнить действие CPZ с этим неиротоксином в связи с тем, что он действует через истощение серотонина в нервной ткани. Поведение моллюсков сразу после инъекции 5,6-DHT сравнимо с поведением виноградных улиток сразу после инъекции серотонина (Pavlova G.A., 2001). В экспериментах было найдено нарушение ассоциативного обучения и длительной сенситизации оборонительного поведения этим нейротоксическим аналогом серотонина (Балабан П.М. и др., 1986; Балабан П.М., Захаров И.С., 1992). При электрофизиологическом исследовании последствий применений нейролептика оказалось, что инъекции CPZ ведут к повышению возбудимости идентифицированных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки, что выражается в деполяризационном сдвиге мембранного потенциала и понижении порога генерации потенциала действия. В.Е. Дьяконовой и Д.А. Сахаровым были найдены изменения в спонтанной активности у некоторых других нейронов улитки - в сторону понижения частоты импульсации (Baker M.W. et al., 1995). Такой же деполяризационный сдвиг мембранного потенциала и снижение порога генерации потенциала действия были обнаружены нами в командных нейронах виноградной улитки и при длительном введении нейротоксина 5,6-DHT. Это, по-видимому, свидетельствует о наличии у командных нейронов оборонительного поведения значительного синаптического притока, опосредуемого серотонинергическими нейронами. Кроме изменений на уровне командных нейронов под. действием нейролептика было обнаружено изменение мембранного потенциала в сторону деполяризации у мотонейронов дуги оборонительного рефлекса, а именно мотонейронов закрытия пневмостома.
Таким образом, хроническое введение нейролептика CPZ вызывает на уровне мембранных механизмов повышение возбудимости командных нейронов виноградной улитки, что выражается в деполяризационном сдвиге мембранного потенциала и снижении порогового потенциала. Кроме того, было обнаружено изменение мембранного потенциала в сторону деполяризации у мотонейронов закрытия пневмостома. Полученные результаты демонстрируют, что эффекты хлорпромазина на электрические характеристики идентифицированных нейронов можно объяснить, исходя из его серотонин истощающего действия.
Существует общее мнение, что кофеин и родственные ему ксантины оказывают положительное влияние на процессы обучения и памяти (Howell L.L. et al, 1997). В последнее время появились работы, свидетельствующие о том что, кофеин может оказывать противоположные эффекты на разных стадиях консолидации памяти и что его воздействие зависит от формы обучении и от того, на какой стадии обучения он применялся (Angelucci М.Е.М. et al., 1999). Этими авторами было показано, что инъекции кофеина перед сеансами обучения не оказывали никакого эффекта на процессы приобретения памяти, а также оказывали отрицательное воздействие на процесс габитуации, однако введение кофеина после сеансов обучения улучшали процесс консолидации памяти, однако ни оказывали никакого эффекта на габитуацию у крыс. В экспериментах на приматах было показано, что кофеин увеличивает скорость ответов при обучении обезьян отказываться от определенных видов пищи (Howell L.L. et al, 1997). Мы провели серию экспериментов по анализу роли этих внутриклеточных систем в механизмах обучения при помощи хронического введения кофеина при формировании условного оборонительного рефлекса.
Анализ динамики формирования УОР показывает, что инъекция кофеина сразу после процедуры обучения ускоряет процесс формирования условного рефлекса (рис. 4.14). Регистрация электрических характеристик командных нейронов оборонительного поведения показало, что хроническое введение кофеина интактным улиткам приводила к снижению мембранного потенциала: -59,6±0,6 мВ у интактных улиток (п=18) и -56,4±1,2 мВ у улиток после инъекции кофеина (п=8) (р 0.01). Инъекция кофеина во время обучения улиток также приводила к деполяризационному сдвигу мембранного потенциала: -56,9+0,6 мВ (п=26) (р 0.01), по сравнению с улитками, обученными без дополнительных инъекций -55,7+0,7 мВ (п=13) (рис. 4.15). Результаты показывают также уменьшение величины порогового потенциала командных нейронов оборонительного поведения во всех группах животных, инъецированных кофеином, независимо от того, обучались они или нет. В группе интактных улиток (п=12) величина порогового потенциала составила 19,8+0,5 мВ, в группе улиток после инъекции кофеина (п=8): 15,2+0,7 мВ (вероятность достоверности отличий от группы интактных улиток р 0,01); в группе обученных улиток (п=18) величина порогового потенциала была равна 16±0,4 мВ, а в группах обученных улиток, инъецированных кофеином, величина порогового потенциала была равна 17,1±0,6 мВ (п=20) (рис. 4.15). Вероятность достоверности отличий от группы обученных улиток (р 0,05).
