Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Na,K-Hacoc в клетке 8
2.1.1. Строение и функционирование Na,K-Hacoca 8
2.1.2. Воздействие Na,K-Hacoca на мембранный потенциал и объем клетки 10
2.1.3. Насос-вызванное изменение внутриклеточного ионного состава 12
2.1.4. Na,K-Hacoc и холиночувствительность нейронов 13
2.1.5. Уабаин как гормон 14
2.2. Роль Na,K-Hacoca в обучении 15
2.3. Привыкание как простая форма обучения 17
2.4. Изучение пластичности нейрона на клеточном аналоге привыкания 19
2.4.1. Снижение холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания 20
2.4.2. Регуляция холинорецепторов нейронов виноградной улитки внутриклеточным Са2+ 22
2.4.3. Роль вторичных посредников и Na,K-Hacoca в изменении холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания 25
2.5. Пути гомеостаза внутриклеточного Са2+ 31
2.5.1. Плазматические электроуправляемые Са2+ -каналы 35
2.5.2. Внутриклеточные депо Са2+ 37
2.5.3. Са2+-связывающие белки 42
2.5.4. Ыа+/Са2+-обмен 43
3. Методика 46
3.1. Поведенческая часть 46
3.2. Электрофизиологическая часть 52
3.3. Статистические методы 57
4. Результаты 58
4.1. Влияние уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции 58
4.2. Изменения амплитуд АХ-тока и тока утечки на клеточном аналоге привыкания 62
4.3. Влияние уабаина на депрессию АХ-тока на клеточном аналоге привыкания 62
4.4. Влияние уабаина на стационарную амплитуду АХ-тока и тока утечки 74
4.5. Корреляция между изменениями стационарных АХ-тока и тока утечки после действия уабаина 82
5. Обсуждение результатов 84
Заключение 92
Выводы 93
Список литературы 94
Список сокращений 106
- Строение и функционирование Na,K-Hacoca
- Регуляция холинорецепторов нейронов виноградной улитки внутриклеточным Са2+
- Влияние уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции
- Влияние уабаина на стационарную амплитуду АХ-тока и тока утечки
Введение к работе
Уабаин, специфический ингибитор Na+,K+-Hacoca, известен благодаря его влиянию на формирование кратковременной памяти и на приспособительное поведение животных (Robertson et al, 1977; Mark, 1979; Xia, 1997; Gibbs, Andrew, 2003; Zhan et al., 2004). Интерес к этому соединению обусловлен еще и тем, что он, являясь эндогенным веществом (Goto et al, 1992), может выступать в качестве паракринного гормона, секретироваться некоторыми нейронами ЦНС (Blaustein, 1993), оказывать влияние на высвобождение нейромедиаторов (Cousin et al., 1995).
В литературе отсутствуют данные о влиянии уабаина на такие простые формы обучения, как привыкание и сенситизация, хотя изучение механизмов самой простой и, вероятно, самой распространенной формы научения у человека и животных, такой как привыкание, является необходимым для понимания тонких механизмов более сложных форм обучения. Привыкание (габитуация) - особый приспособительный процесс (Шмидт, 1996). У этой простейшей формы научения есть клеточный аналог, на котором воспроизводятся все основные особенности поведенческого привыкания (Кэндел, 1980). Использование клеточных аналогов обучения позволяет приблизиться к пониманию молекулярных механизмов научения. При обучении нейрон проявляет пластические свойства - способность к изменению реактивности под влиянием последовательных раздражений (Конорски, 1970) или при ассоциировании с другими факторами (Котляр, 1986).
Одним из механизмов регуляции пластичности электрогеных мембран при обучении является изменение свойств рецепторов с участием систем вторичных посредников (Kotlyar, Pivovarov, 1990). Здесь особенно важную роль играет Са2+ - универсальный вторичный посредник.
Наиболее значительные физиологические эффекты уабаина связаны с его действием на концентрацию внутриклеточного Са (Blaustein, 1993). Показано, что ингибирование Na+,K+-Hacoca уабаином повышает уровень Са2+ в нейронах (Fujino S., Fujino М., 1982; Deitmer et al., 1987; Meyer-Lehnert, 2000). Происходит это благодаря как минимум двум механизмам -активации Na /Са -обмена в обратном режиме работы, а также усилению высвобождения Са2+ из внутриклеточных Са2+-депо (Balduini, Costa, 1990; Condrescu et al., 1995; Saghian et al., 1996; Rakovic et al., 1999). В свою очередь, уровень внутриклеточного Са2+ влияет на чувствительность холинорецепторов нейронов. Повышение концентрации свободного Са в диализированных нейронах прудовика и виноградной улитки снижает амплитуду вызванного ацетилхолином (АХ) входящего тока СГ-природы (Chemeris et al., 1982; Arvanov et al., 1992). Исследование тормозящего влияния уабаина на соматические холинорецепторы нейронов виноградной улитки показало, что оно зависит от концентрации свободного Са (Пивоваров, Богуславский, 2000).
Уабаин модифицирует динамику снижения амплитуды вызванного АХ входящего тока при ритмическом подведении медиатора к соме. Направление эффекта зависит от базальной концентрации внутриклеточного Са2+ (Пивоваров, Богуславский, 2000). Эти данные получены на командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки, на клеточном аналоге привыкания. При участии этих командных нейронов осуществляется оборонительный рефлекс виноградной улитки, включающий втягивание щупалец, закрытие дыхательного отверстия и уход в раковину (Максимова, Балабан, 1983). Это нейроны левого и правого париетальных ганглиев - ЛПаЗ и ППаЗ обладающие обширным рецептивным полем, все точки которого характеризуются только одним знаком реакции - возбуждением, образованным ВПСП (Балабан, Литвинов, 1977).
В связи с этим представляет интерес выяснить эффект уабаина на привыкание улитки к повторяющимся тактильным раздражителям, сравнение характера этого эффекта с влиянием уабаина на снижение холиночувствительности нейронов на клеточном аналоге привыкания и внутриклеточные механизмы таких эффектов.
1.2. Цели и задачи исследования
Целью работы являлось исследование участия Na ,К -насоса в привыкании виноградной улитки к тактильной стимуляции. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Выяснение влияния уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции.
2. Изучение вероятного участия Na+/Ca +-обмена в регуляции Na+,K+-насосом снижения холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.
3. Изучение вероятного участия мобилизованного внутриклеточного кальция в регуляции Ыа+,К+-насосом снижения холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.
4. Исследование участия рецепторов инозитолтрифосфата и рианодиновых рецепторов Са2+-депо в регуляции Na+,K+-HacocoM снижения холиночувствительности командных нейронов оборонительного поведения виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания.
1.3. Научная новизна работы
Впервые показано влияние уабаина, специфического ингибитора Na+,K+-Hacoca, на простейшую форму научения - на привыкание улитки к повторяющимся тактильным раздражителям и исследованы внутринейрональные механизмы такого влияния с участием Na /Са -обмена и мобилизованного Са из внутриклеточных Са2+ -депо.
1.4. Положения, выносимые на защиту
1. Ингибитор Na+,K+-Hacoca уабаин модифицирует привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции и холиночувствительность командных нейронов оборонительного поведения на клеточном аналоге привыкания, увеличивая разброс глубины подавления оборонительной реакции улитки при привыкании и глубины подавления вызванного ацетилхолином тока нейронов на клеточном аналоге привыкания.
2. Уабаин регулирует привыкание виноградной улитки к ритмической тактильной стимуляции посредством влияния на Na /Са -обмен и мобилизацию внутриклеточного депонированного кальция через рецепторы инозитолтрифосфата в командных нейронах оборонительного поведения.
1.5. Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные результаты существенно дополняют современные представления о влиянии Na+,K+-Hacoca на адаптивное поведение животных. Эти сведения могут быть использованы при поиске лекарственных средств, влияющих на обучение.
1.6. Апробация диссертации
Апробация результатов представленного диссертационного исследования успешно прошла на 30-м всерос. совещ. по пробл. высш. нервн. деят. поев. 150-летию со дня рожд. И.П.Павлова (С-Пб, 2000); 6th East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, Simpler Nervous Systems (September, 2000, Moscow-Puschino); 8-й всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика АН Арм. ССР, чл.-корр. АН СССР Х.С.Коштоянца (Москва, 2000); 18-м съезде физиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 2001); 4-м съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); научной конференции молодых ученых (Москва, 2002); международных чтениях, посвященных 100-летию со дня рождения чл.-корр. АН СССР, академика АН АрмССР Э.А.Асратяна (Москва, 2003).
1.7. Публикации
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 2 статьи и 7 тезисов докладов.
1.8. Структура и объем работы
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методики, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и списка использованных сокращений. Работа изложена на 106 страницах, содержит 15 рисунков и 7 таблиц. Список литературы включает 116 источников, из них 35 отечественных.
Строение и функционирование Na,K-Hacoca
Мембранный потенциал (МП) может быть разделен на диффузионный потенциал, определяемый относительными проницаемостями мембраны для Na+ и К+ и дополнительный потенциал, возникающий за счет работы электрогенного Na+-Hacoca (Кононенко, 1976). При нормальной скорости работы Na+,K+-Hacoca создается МП, примерно на 10 мВ более электроотрицательный, чем если бы он образовывался только за счет пассивных потоков ионов (Кононенко, 1976). Томас (Thomas, 1972) в экспериментах на гигантских нейронах Helix aspersa показал, что уабаин снижает МП, достигающий постоянного значения уже через 6 минут. Такое же время необходимо для ингибирования Na+-Hacoca уабаином, скорость работы которого определялась по изменению внутриклеточной активности Na+, измеренной Ыа+-селективным микроэлектродом. Максимальная деполяризация нейронов Helix pomatia, вызванная уабаином, составляла около 7 мВ (Christoffersen, 1972). Электрогенность Na+-Hacoca нейронов моллюсков (Helix) обусловлена высоким удельным сопротивлением их мембраны (около 1 МОм/см ), поэтому Na - насос вносит значительный вклад в мембранный потенциал их нейронов (Кононенко, 1976). Чтобы поддерживать равновесие между насосными и пассивными мембранными токами, необходимо намного больше молекул Na+,K+-Hacoca, примерно в 1000 раз, чем канальных белков для ионов К+ и Na+ (Daut, 1987). Расстояние между молекулами Na+,K+-Hacoca составляет в среднем всего лишь 34 нм. Таким образом, мембрана достаточно плотно насыщена насосными молекулами (Daut, 1987). Тот факт, что поток ионов Na+ внутрь клетки, а ионов К+ из клетки компенсируется работой насоса, имеет и другое следствие, заключающееся в сохранении стабильного осмотического давления и постоянного объема (Daut, 1987).
Na+,K+-ATPa3a играет непосредственную роль в регуляции клеточного объема. Важная роль Ыа+,К+-АТРазы в регуляции клеточного объема подтверждается тем фактом, что при обработке животных клеток уабаином, ингибирующим Na+,K+-ATPa3y, они разбухают и разрываются. Но в нормальных условиях основная роль в предотвращении разрыва клетки из-за осмотического давления принадлежит Ыа+,К+-АТРазе (Альберте и др., 1994). Между активностью Na+,K+-Hacoca и объемом клетки существует обратная связь (Айрапетян, 1990). Активация Na+,K+-насоса приводит к уменьшению объема клетки, а инактивация - к его увеличению. И наоборот, увеличение тоничности, когда клетка сморщивается, вызывает торможение активности Na+,K+-Hacoca, тогда как набухание клетки вызывает стимуляцию активности насоса (Айрапетян, 1990). В основе отрицательно-обратной связи между активностью Na+,K+-насоса и объемом клетки лежит изменение числа функционально-активных насосных молекул в мембране. В процессе увеличения клеточного объема (при ингибировании электрогенного Na+,K+-Hacoca) число функционирующих Ыа+,К+-АТРазных молекул увеличивается за счет незадействованных (ранее экранированных) молекул в мембране (Сулейманян, 1990). По мнению Сулейманяна (Сулейманян, 1990), в условиях покоя функционирует минимально необходимое число функционирующих Na+,K+-ATPa3Hbix молекул. Ингибирование электрогенного Na+,K+-Hacoca вызывает набухание клетки и увеличение числа функционирующих Na+,K+-ATPa3Hbix молекул в мембране. Так компенсируется эффект, вызванный ингибированием насоса. Активация насоса заставляет клетку уменьшаться в своих размерах и закрывать (экранировать) некоторую часть функционирующих Na+,K+-ATPa3Hbix молекул, таким образом, предотвращая ненужный расход энергии (Сулейманян, 1990).
Другим механизмом, с помощью которого Na+-Hacoc может регулировать функциональную активность нейрона, является изменение внутриклеточного ионного состава. При ингибировании Na+-Hacoca уабаином происходит увеличение внутриклеточной концентрации кальция ([Са ,]) в нейронах (Mark et al, 1995; Пивоваров и др., 2001), которое достигается за счет активации реверсированного Na /Са -обмена (Deitmer et al, 1987; Айрапетян, 1990; Shlue, 1991; Calvo et al, 1992; Mulkey, Zucker, 1992; Saghian, 1996). Увеличение внутриклеточной концентрации Са при ингибировании Na+- насоса было обратимым (Schlue, 1991).
Между №+/Са2+-обменом и Na+,K+-HacocoM имеется тесная взаимосвязь. При ингибировании Na+,K+-Hacoca увеличивается внутриклеточное содержание Na+, что активирует реверсированный Na+/Ca2+-o6MeH (и вход Са2+ в клетку)(Saghian, 1996). При ингибировании Na+,K+-Hacoca внутри клетки накапливается АТР, которая влияет на активность Na /Са -обмена. АТР необходим для работы Na+/Ca2+-aHTHnopTepa, и увеличение АТР стимулирует его работу (DiPolo, Beague, 1986). Ма+/Са2+-обмен является и сАМР-зависимым процессом. Возможно даже, что влияние Na ,К -насоса на Na /Са -обмен вторично, тогда как первичный эффект ингибирования Na+,K -насоса заключается в увеличении уровня cAMP (Saghian et al, 1996). Ингибирование Na+,K+-Hacoca уабаином может приводить к повышению концентрации [Са2+;] за счет его высвобождения из внутриклеточных Са2+-депо через оба типа рецепторов - рианодиновых (Micci, Christensen, 1998) и рецепторов IP3 (Calvino et al., 2002). Таким образом, при ингибировании Na+,K+-Hacoca уабаином повышается уровень внутриклеточного Са2+ благодаря, как минимум, двум механизмам: за счет реверсированного Na /Са -обмена и высвобождения Са+ из внутриклеточных Са2+-депо через оба типа рецепторов -рианодиновых и рецепторов 1Р3. Net,lC -насос и холиночувствительностъ нейронов Активность Na+,K+-Hacoca влияет на хеморецептивность мембраны гигантских нейронов улитки несколькими способами. Во-первых, при изменении объема нейрона изменяется количество функционально активных хеморецепторов мембраны (Айрапетян, 1990). Na+,K+-Hacoc может модулировать мембранную хеморецептивность изменением клеточной поверхности (Сулейманян, 1990). С другой стороны, инактивация Na+,K+-Hacoca приводит к увеличению АТР, к увеличению cAMP (Arvanov et al, 1992; Saghian et al, 1996), уменьшению cGMP и стимуляции фосфорилирования мембраны (Айрапетян, 1990).
Регуляция холинорецепторов нейронов виноградной улитки внутриклеточным Са2+
Нейроны беспозвоночных имеют холиновые рецепторы, отличающиеся от таковых позвоночных животных (Скок, 1987). Так, в нейронах моллюска АХ активирует три фармакологически различных типа холинорецепторов, из которых два являются никотиновыми и обусловливаются деполяризацией мембраны нейрона, а третий является мускариновым, и его активирование вызывает гиперполяризацию мембраны нейрона (Скок, 1987). Мускариновые рецепторы нейронов моллюска отличаются от соответствующих рецепторов позвоночных отсутствием чувствительности к атропину и некоторым мускариновым агонистам (Скок, 1987).
На соме нейронов ППаЗ, ППа4 и ЛПаЗ идентифицированы холинорецепторы никотинового и мускаринового типов, фармакологически отличающиеся от соответствующих холинорецепторов позвоночных (Пивоваров, 1992). Эти отличия более выражены для мускариновых холинорецепторов: их следует отнести к особому виду мускариновых холинорецепторов, отличному от известных М]- и М2-подтипов (Пивоваров, 1992).
Никотиновый холинорецептор представляет собой гликопротеин, состоящий из пяти трансмембранных полипептидов (Альберте и др., 1994). Они кодируются четырьмя различными генами. Поскольку четыре этих гена обнаруживают тесную гомологию, предполагают, что они произошли от одного гена-предшественника (Альберте и др., 1994). Два идентичных полипептида в пентамере имеют участки связывания АХ. При связывании двух молекул АХ с пентамерным комплексом происходит индуцированное конформационное изменение, приводящее к открыванию канала. Строгих ограничений на вид катионов, проходящих через канал, не существует, поэтому поток каждого из них через канал опрелеляется главным образом их концентрациями и электрохимическими движущими силами (Скок, 1987). Определить относительную проницаемость канала, связанного с АХ-рецептором, можно по величине его потенциала реверсии и его чувствительности к концентрациям ионов во внешней среде (Скок, 1987).
Совместная активация никотиновых и мускариновых холинорецепторов нейрона виноградной улитки ППа4 ацетилхолином приводит к возрастанию проницаемости для Na+ и Са2+ (Скок, 1987). Взаимодействие никотина с никотиновым холинорецептором вызывает входящий ток Na+, а связывание мускарина мускариновым холинорецептором - входящий ток Са2+ (Скок, 1987). Регуляция холинорецептора может осуществляться со стороны Са +, вошедшего в клетку по хемоуправляемым ионным каналам (Скок, 1987). Ионы Са играют важную роль в нормальной деятельности холинорецепторов. В белке никотинового холинорецептора обнаружено значительное количество связанного Са2+, не устраняемого диализом (Скок, 1987). Взаимодействие холинорецептора с АХ приводит к выделению 4-6 связанных ионов Са2+ на каждую молекулу холинорецептора, а последующее добавление а-бунгаротоксина (блокатора никотиновых холинорецепторов) вызывает обратимый захват 94 ионов Са (Скок, 1987). Предположили, что АХ конкурирует с ионами 94 Са" за места связывания (Скок, 1987). Координационные связи белковой молекулы с ионами Са важны для сохранения ее конформации. Поэтому возможно, что они принимают участие в вызываемом АХ изменении конформации молекулы холинорецептора, в частности, в открывании ионного канала (Скок, 1987). 9-4 Холинорецептор обладает сходством с Са -связывающими белками, и в холинорецепторе можно найти участки, сходные с кальциевой петлей, как в отношении вторичной структуры, так и по разным показателям, характерным для различных Са -связывающих белков (Скок, 1987). Местом связывания ионов Са2+ обладает и сам ионный канал никотинового холинорецептора нейрона моллюска (Скок, 1987). Места связывания избирательных блокаторов в ионном канале холинорецептора в нормальных условиях могут связывать ионы Са2+, а, возможно, и другие проникающие ионы. В отношении мускариновых холинорецепторов можно сказать, что связывание агонистов с некоторыми 94- 94 из них может усиливаться двухвалентными ионами (Са , Mg ) (Скок, 1987). Са2+ может влиять на чувствительность холинорецептора и с внутренней стороны мембраны. Так, ионы Са при действии с внутриклеточной стороны мембраны угнетали АХ-ток в нейронах прудовика (Скок, 1987). Са влияет на холиночувствительность через активацию Са /KM-зависимомой протеинкиназы, фосфорилирующей рецепторные белки, или через увеличение активности ферментов фосфолипидного обмена, приводящее к возрастанию текучести мембраны и пула жирных кислот (Айрапетян, 1990). Активация фосфолипазы А2 через деацилирование моно- и полиеновых жирных кислот изменяет липидное окружение холинорецепторов и их чувствительность к агонисту (происходит подавление холиночувствительности мембраны) (Айрапетян, 1990). 94 Таким образом, Са участвует в регуляции холинорецепторов как напрямую, связываясь с молекулой рецептора, так и с помощью активации протеинкиназ клетки и последующего фосфорилирования молекул холинорецепторов и белков, связанных с ними (Скок, 1987; Айрапетян, 1990).
Влияние уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции
В ответ на действие тактильного раздражителя возникала пассивная оборонительная реакция. Ритмическая тактильная стимуляция вызывала ослабление оборонительной реакции животного (п=48) на 49.86 ± 1.32% (р=0.0000, критерий Стъюдента; рис. 5). Сниженная оборонительная реакция спонтанно восстанавливалась после перерыва (10-15 мин) в стимуляции (п=48) и составляла 78.89 ± 5.40% (р=0.0000, критерий Стъюдента; рис. 5). Выявлено такое свойство поведенческого привыкания как растормаживание уменьшенной реакции животного на повторяющийся раздражитель. Действие экстрастимула приводило к достоверно большему на 33.02 ± 10.53% (р=Ю.0087, критерий Стъюдента) увеличению амплитуды оборонительной реакции улитки по сравнению с контролем, в котором действие экстрастимула отсутствовало (табл. 2; рис. 6).
Ингибитор Na+,K+-Hacoca уабаин изменял привыкание интактной улитки к действию повторяющихся тактильных стимулов по сравнению с контрольной серией, в которой вместо уабаина в висцеральный мешок инъецировали физиологический раствор (100 мкл). Инъекция уабаина (100 мкл) приводила к достоверному возрастанию выборочной дисперсии, которая характеризует разброс глубины подавления оборонительной реакции улитки. При этом уабаин не изменял средние значения улитки в ответ на 2-10-й стимулы в серии ритмических тактильных стимуляций по сравнению с оборонительной реакцией, возникающей в ответ на 1-й стимул в серии до и после действия уабаина (%); по оси ординат - число улиток, % от общего числа в выборке. А - без фармакологического воздействия (контроль 1), Б - после инъекции физиологического раствора (контроль 2, 100 мкл), В - после инъекции уабаина (100 мкМ).
На клеточном аналоге привыкания средняя амплитуда АХ-тока в ответ на 5-й стимул в серии ритмических аппликаций АХ в контрольной схеме (аппликация физраствора, п=9) уменьшалась на 52.49 ± 4.56%, а амплитуда 5-го тока утечки достоверно не изменялась: ее снижение составляло 2.60 ± 1.72% по сравнению с 1-й амплитудой токов. Для подсчета коэффициента корреляции между изменениями амплитуд тока утечки и АХ-тока взята схема с внеклеточным действием уабаина, поскольку в этой схеме выборка самая многочисленная (п=25). Коэффициент линейной корреляции Пирсона составлял 0.0311, значимость коэффициента составляла 0.8799 (п=25). Средние амплитуды 5-го АХ-тока и тока утечки составляли 48.94 ± 2.30% и 94.51 ± 3.91% соответственно (п=25). Таким образом, не выявлено корреляции между изменениями амплитуд токов утечки и АХ-токов на клеточном аналоге привыкания.
Оценивали влияния на глубину депрессии АХ-тока на клеточном аналоге привыкания: 1) внеклеточного добавления в проточную камеру 100 мкл физиологического раствора (11=9, контроль); 2) уабаина (100 мкМ, п=29); 3) уабаина на фоне пониженной в 5 раз внеклеточной концентрации CaZT (п=13); 4) уабаина после внеклеточного действия бензамила (15-35 мкМ, 20-50 мин, п=16); 5) уабаина после внутриклеточного введения циклопиазоновой кислоты (0.1 мМ, 80-135 мин, п=11); 6) уабаина после внутриклеточного введения тапсигаргина (0.1 мМ, 70-140 мин, п=11); 7) уабаина после внутриклеточного введения растворителя 5%-ного DMSO в течение 50-140 мин (п=11, контроль к сериям 5 и 6); 8) уабаина после внутриклеточного введения гепарина (0.1 мМ, 60-140 мин, п=11); 9) инозитолтрифосфата (0.1 мМ, 50-150 мин, п=13); 10) рианодина в концентрации 0.1 мМ (60-130 мин, п=13); 11) рианодина в концентрации 0.1 мМ (50-100 мин, п=14) и 12) дантролена (0.1 мМ, 50-145 мин, п=14). Сравнивали изменения глубины депрессии АХ-тока, вызванные уабаином. Ингибитор Na+,K+-Hacoca уабаин модифицировал депрессию АХ-тока проанализированных нейронов по сравнению с контрольной серией, когда вместо уабаина в проточную камеру с препаратом ганглиев вводили физиологический раствор (100 мкл), что подтверждает полученный ранее результат (Пивоваров, Богуславский, 2000). Уабаин (100 мкМ) достоверно увеличивал выборочную дисперсию, отражающую разброс (рассеяние) величин глубины депрессии АХ-тока в серии повторных аппликаций АХ, не изменяя средние значения сравниваемых выборок (табл. 4; рис. 10; 11; 12; рис. 13, А).
Влияние уабаина на стационарную амплитуду АХ-тока и тока утечки
Изменения оборонительной реакции виноградной улитки, вызванные ритмической тактильной стимуляцией, удовлетворяли основным критериям поведенческого привыкания (Pinskeret al., 1970; Кэндел, 1980).
В литературе отсутствуют данные о влиянии уабаина на такие простые формы обучения как привыкание. В настоящей работе обнаружено влияние ингибитора Na+,K+-Hacoca уабаина на привыкание виноградной улитки к тактильной стимуляции, вызывающей оборонительную реакцию. Это влияние оказалось идентичным эффекту уабаина на холиночувствительность нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания. Исследуемые нейроны вовлечены в реализацию оборонительного поведения виноградной улитки (Максимова, Балабан, 1983). Поэтому, идентичность действия уабаина на поведенческое привыкание и на его клеточный аналог позволяет перенести обнаруженные внутриклеточные механизмы с аналога привыкания на соответствующее поведение животного.
Na+,K+-Hacoc регулирует депрессию холиночувствительности нейронов виноградной улитки на клеточном аналоге привыкания, поскольку ингибитор насоса уабаин модифицирует динамику снижения амплитуды АХ-тока при ритмическом подведении медиатора к соме. Направление эффекта зависит от базальной концентрации внутриклеточного Са (Пивоваров, Богуславский, 2000).
Физиологическая роль влияния уабаина на увеличение дисперсии глубины подавления амплитуды АХ-тока и оборонительной реакции улитки при привыкании может состоять в повышении тем самым чувствительности системы (нейрона, нервной системы или целого организма) к факторам внешней среды. Это отражается в адаптивном поведении животных. Имея более полный спектр реакций на воздействие окружающей среды, животное (или даже вид) может с большей вероятностью выжить, приспособиться к изменившимся условиям среды.
На разных клетках, в том числе и на командных нейронах оборонительного поведения виноградной улитки, получены данные, свидетельствующие о повышении уабаином концентрации внутриклеточного Са2+ за счет его проникновения из внеклеточной среды (Fujino S., Fujino М, 1982; Deitmer et al., 1987; Meyer-Lehnert et al., 2000; Пивоваров и др., 2001). Повышение уровня Са2+ в нейронах при ингибировании Na+,K+-Hacoca уабаином происходит благодаря, как минимум, двум механизмам - активации №+/Са2+-обмена в обратном режиме работы, а также усилению высвобождения Са из внутриклеточных Са -депо (Balduini, Costa, 1990; Condrescu et al., 1995; Saghian et al., 1996; Rakovic et al., 1999).
Решить вопрос о роли Na /Са -обмена во влиянии уабаина на депрессию холиночувствительности нейронов на клеточном аналоге привыкания должны были результаты серий, в которых действие уабаина оценивали на фоне пониженной концентрации внеклеточного Са и ингибитора Ма+/Са2+-обмена бензамила. В случае понижения концентрации Са2+ с внешней стороны мембраны мы рассчитывали ослабить активируемый уабаином реверсированный №+/Са2+-обмен (Na+ - выход, Са - вход). Бензамил должен был также затормозить реверсированный Na /Са -обмен. Предполагали, что оба описанных выше воздействия должны уменьшить повышение уабаином внутриклеточного Са + через Na+/Ca2+-aHTHnopT. Оба примененных воздействия нарушали способность уабаина модифицировать депрессию холиночувствительности нейрона на клеточном аналоге привыкания. Некоторые различия в действии пониженного внеклеточного Са и бензамила на эффект уабаина связаны, вероятно, с другими эффектами этих воздействий. Повышение уабаином внутриклеточной концентрации Са+ в результате активации в реверсивном направлении Na /Са +-антипорта - один из возможных клеточных механизмов модификации уабаином холиночувствительности нейронов на клеточном аналоге привыкания. Известно, что под контролем Na+/Ca2+-o6MeHa находится влияние уабаина на мобилизацию внутриклеточного Са (Golovina et al., 1996; Міссі, Christensen, 1998). Роль мобилизованного из внутриклеточных депо Са во влиянии уабаина на депрессию холиночувствительности нейронов на клеточном аналоге привыкания должны были выявить результаты серий, в которых действие уабаина оценивали на фоне внутриклеточных инъекций ингибиторов Са2+-насоса эндоплазматического ретикулума, закачивающего свободный цитоплазматический Са2+, - циклопиазоновой кислоты и тапсигаргина. Оба блокатора должны были опустошить Са2+-депо и, поэтому, препятствовать влиянию уабаина на концентрацию свободного Са2+ в цитоплазме через его мобилизацию. Циклопиазоновая кислота и тапсигаргин нарушали действие уабаина, что позволяет считать повышение уабаином внутриклеточной концентрации Са2+ в результате активации мобилизации Са одним из возможных клеточных механизмов модификации уабаином холиночувствительности нейронов на клеточном аналоге привыкания.
