Введение к работе
Актуальность проблемы
Вазопрессинергические нейросекреторные нейроны гипоталамуса являются ключевым интегративным звеном центральной регуляции многих важнейших функций организма, таких как поддержание водно-солевого баланса, артериального давления, регуляция стрессорных реакций и многих других. Экспрессия вазопрессина определяется двумя взаимосвязанными процессами - синтезом белка и скоростью его выведения в общий кровоток в задней доле гипофиза. Регуляция функциональной активности нейросекреторных вазопрессинергических клеток гипоталамуса складывается из анализа сигнала, приходящего на рецепторы нейронов, и зависит от внутриклеточных механизмов, посредством которых этот сигнал передается в ядро клетки, где происходит транскрипция вазопрессина. На следующем этапе происходит синтез белка, его процессинг в ходе формирования секреторных гранул и их транспорт по аксонам в нейрогемальные отделы, где происходит выведение вазопрессина в кровь [Burbach, et al., 2001]. Очевидно, что все вышеперечисленные процессы зависят от множества факторов, которые включаются в регуляцию секреции вазопрессина на разных этапах. Эти факторы можно условно разделить на основные и модулирующие. Исследование регуляции вазопрессинергических нейронов осуществляется уже на протяжении многих лет. Однако сложность процессов, обеспечивающих функционирование нейронов в условиях поддержания водно-солевого баланса объясняет тот факт, что в настоящее время остаются неясными многие вопросы регуляции биосинтеза вазопрессина.
Один их них – характер влияния различных нейротрансмиттеров и нейромодуляторов, в том числе норадреналина и дофамина на уровень синтеза и скорость выведения вазопрессина в норме и при нарушении осмотического равновесия. Данные литературы по этому вопросу крайне противоречивы [Boudaba, et al., 2003; Kim, et al., 1989; Randle, et al., 1986], что возможно связано, во-первых, с широкой представленностью различных типов рецепторов катехоламинов в вазопрессинергических нейронах [Khanna, et al., 1993; Takano, et al., 1989], а, во-вторых, с возможностью участия различных внутриклеточных механизмов в передаче сигналов от рецепторов и вкладом в этот процесс различных модулирующих влияний. Одним из таких модуляторов является NO. Показано участие NO в регуляции вазопрессинергических нейронов, но и в этом случае данные противоречивы [Liu, et al., 1998; Lutz-Bucher and Koch, 1994]. Кроме того, было высказано предположение о возможности взаимодействия катехоламинов и NO в регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов, но характер этих взаимоотношений на сегодняшний день не установлен [Vacher et al. 2003].
Развитию гипоталамуса в ходе раннего онтогенеза посвящено множество исследований. Известен источник и приблизительные сроки возникновения нейронов гипоталамуса [Altman and Bayer, 1978, 1986], но при этом нет данных, касающихся особенностей возникновения в ходе онтогенеза вазопрессинергических нейронов супраоптического и паравентрикулярного ядер. Крайне важно изучение эмбрионального и постнатального периодов развития вазопрессинергической системы гипоталамуса, в том числе исследование роли апоптоза в формированиии вазопрессинергических нейросекреторных центров гипоталамуса. Время установления дефинитивных связей, особенности нейротрансмиттерной регуляции вазопрессинергической системы, анализ функциональной активности вазопрессинергических нейронов в ходе онтогенеза, анализ различных морфогенетических влияний, в том числе и со стороны катехоламинергической системы, являются чрезвычайно важными вопросами, решению которых посвящена настоящая работа.
Известно, что к развитию апоптоза приводят как внешние, рецепторные сигналы, так и внутриклеточные нарушения, связанные с повреждением ДНК. Апоптоз является конечным этапом многих нейродегенеративных заболеваний, в том числе болезни Паркинсона. Представляется интересным выяснение роли катехоламинов в индукции апоптоза в гипоталамусе, получающем мощную катехоламинергическую иннервацию. С другой стороны, известно участие NO как в инициации апоптоза [Brune, et al., 1998], так и в его подавлении [Kim, et al., 1997]. Исследование взаимодействия и характера влияния катехоламинов и NO на индукцию апоптоза вазопрессинергических нейронов и сопоставление этих данных с результатами анализа влияния этих веществ на функцию нейронов необходимо для выяснения роли катехоламинов и NO в регуляции жизнеспособности и физиологического статуса нейронов гипоталамуса.
В последние годы появились данные, указывающие на возможность участия антиапоптозного белка Bcl-2 и проапоптозного белка р53 в регуляции физиологических функций нейронов, не связанных с гибелью клеток [Nishimura, et al., 2004]. В связи с этим представляется важным исследование возможности, характера и механизмов влияния белков апоптоза на функциональную активность нейронов гипоталамуса. Можно предположить, что белки апоптоза скорее всего оказывают модулирующее действие на другие внутриклеточные каскады передачи сигнала. Одним из таких путей, возможно, является ERK1/2 модуль МАРК сигнального каскада, взаимодействие которого с изучаемыми белками апоптоза было выявлено при исследовании механизмов регуляции программированной клеточной гибели [Singh, et al., 2007; Wang, et al., 1996]. Роль ERK1/2 модуля МАРК сигнального каскада в регуляции функциональной активности вазопрессинергических нейронов гипоталамуса в настоящее время предполагается, но не установлена.
Таким образом, исследование взаимоотношений между поступающими к клеткам различными сигналами, как активирующими, так и тормозными, и внутриклеточными посредниками, участвующими в непосредственной передаче информации в ядро клетки с последующим изменением активности синтеза вазопрессина, являются важной проблемой, малоизученной в настоящее время.
Цель работы: исследование механимов внутриклеточной регуляции функциональной активности и жизнеспособности вазопрессинергических нейронов в ходе раннего онтогенеза и у взрослых животных.
Задачи
-
Оценить характер и механизмы взаимодействия катехоламинов и NO в регуляции функционального состояния и жизнеспособности вазопрессинергических нейронов гипоталамуса.
-
Изучить влияние различных воздействий (денервация, нарушение катехоламинергической иннервации, стресс, водная депривация и их сочетанное действие) на развитие апоптоза вазопрессинергических нейронов гипоталамуса.
-
Установить сроки окончания пролиферации и выхода в дифференцировку вазопрессин- и окситоцинергических нейронов гипоталамуса.
-
Исследовать экспрессию белков апоптоза вазопрессинергическими нейронами на ранних стадиях постнатального онтогенеза, а также показать морфогенетическое влияние катехоламинов и NO на формирование вазопрессинергических нейросекреторных отделов гипоталамуса.
-
Доказать существование неапоптозных функций белков апоптоза в вазопрессин- и дофаминергических нейронах и изучить механизмы влияния антиапоптозного белка Bcl-2 и проапоптозного белка р53 на функциональное состояние вазопрессинергических нейронов гипоталамуса.
-
Доказать возможность и механизмы участия членов ERK1/2 модуля МАРК сигнального каскада в регуляции синтеза и выведения вазопрессина нейронами гипоталамуса. Изучить возможность участия транспортного белка кинезина в регуляции антероградного транспорта вазопрессинергических гранул по аксонам и показать роль киназ ERK1/2 сигнального каскада в регуляции экспрессии кинезина.
Научная новизна
Впервые доказано, что катехоламины - дофамин и норадреналин оказывают ингибирующее действие на экспрессию вазопрессина. Любое значительное изменение уровня катехоламинов в мозге приводит к усилению экспрессии nNOS в вазопрессинергических нейронах. Ингибирующее действие катехоламинов на синтез и выведение вазопрессина опосредуется действием NO. Как снижение катехоламинергической иннервации, так и ее увеличение приводит к усилению экспрессии про- и антиапоптозных белков в вазопрессинергических нейронах гипоталамуса. Уменьшение плотности катехоламинергической иннервации является более сильным повреждающим фактором для изучаемых нейронов и приводит к их гибели. Экспрессия белков апоптоза при нарушении катехоламинергического баланса в мозге является NO-зависимой. Особенно выраженное активирующее влияние NO оказывает на экспрессию антиапоптозного белка Bcl-2.
Установлено, что вазопрессинергические нейроны супраоптического ядра заканчивают деление на 14 день эмбриогенеза, на сутки раньше, чем вазопрессинергические нейроны паравентрикулярного ядра. Апоптоз постмитотических нейронов, вызванный повышенным уровнем экспрессии проапоптозного белка каспаза-9, также завершается раньше в супраоптическом ядре, чем в паравентрикулярном. Выживаемость вазопрессинергических нейронов в раннем постнатальном онтогенезе зависит от антиапоптозного действия Bcl-2. Катехоламины, взаимодействуя с NO, играют важную роль в морфогенезе гипоталамических нейронов, влияя на экспрессию белков апоптоза.
Показано, что функциональные нагрузки (стресс и дегидратация) не вызывают гибели вазопрессинергических нейронов, несмотря на активацию экспрессии в нейронах проапоптозных белков. Белки апоптоза оказывают модулирующее влияние на функциональную активность вазопрессин- и дофаминергических нейронов мозга. Выявлены возможные пути внутриклеточной сигнализации, которые передают сигнал от белков апоптоза на аппарат биосинтеза вазопрессина. Показано, что Bcl-2 стимулирует экспрессию вазопрессина, и это влияние опосредовано транскрипционным фактором CREB. Проапоптозный белок р53 усиливает интенсивность транспорта вазопрессинергических нейросекреторных гранул по аксонам и их выведение в системный кровоток, и это влияние, по-видимому, опосредовано ERK1/2 сигнальным каскадом.
ERK1/2 каскад участвует в регуляции биосинтеза вазопрессина за счет активации транскрипционных факторов Elk1 и CREB. Показана зависимость экспрессии кинезина от активности ERK1/2 киназы и установлено участие кинезина в реализации антероградного транспорта вазопрессина.
Полученные данные свидетельствуют о возможности одних и тех же внутриклеточных сигнальных посредников принимать участие в регуляции функционального состояния нейронов и обеспечении их жизнеспособности.
Положения, выносимые на защиту.
1. Взаимодействие катехоламинов и NO играет важную роль в регуляции функциональной активности и жизнеспособности вазопрессинергических нейронов. Катехоламины и NO оказывают ингибирующее действие на синтез и секрецию вазопрессина, причем NO опосредует тормозное действие катехоламинов на экспрессию вазопрессина. Снижение уровня катехоламинов является сильным повреждающим фактором и вызывает массовую гибель вазопрессинергических нейронов путем апоптоза. Активация вазопрессинергических нейронов предохраняет нейроны от апоптоза, вызванного нарушением катехоламинергической иннервации.
2. Вазопрессинергические нейроны супраоптического ядра заканчивают пролиферацию, выход в дифференцировку и апоптотическую гибель раньше, чем нейроны паравентрикулярного ядра. NO опосредует морфогенетическое действие катехоламинов на развитие вазопрессинергических нейронов, как на формирование клеточного состава гипоталамических нейросекреторных центров, так и на функциональную активность развивающихся нейронов.
3. Сигнальные белки апоптоза обладают неапоптозными функциями в центральной нервной системе и оказывают модулирующее влияние на функциональное состояние вазопрессинергических и дофаминергических нейронов. Антиапоптозный белок Bcl-2 вызывает усиление синтеза вазопрессина за счет активации транскрипционного фактора CREB. Проапоптозный белок р53 активирует антероградный транспорт вазопрессина, взаимодействуя с ERK1/2 киназой.
4. ERK1/2 каскад участвует в регуляции синтеза вазопрессина путем активации транскрипционных факторов Elk1 и CREB, и в регуляции секреции вазопрессина участвуя в активации экспрессии кинезина.
Теоретическая и практическая значимость
Исследование имеет фундаментальное значение для понимания механизмов регуляции биосинтеза вазопрессина на уровне восприятия клеткой рецепторного сигнала от различных нейротрансмиттеров и передачи информации внутриклеточными посредниками в ядро клетки с последующим изменением активности синтеза вазопрессина. Полученные результаты, касающиеся роли дофамина, норадреналина и их взаимодействия с NO, указывают на ингибиторне действие катехоламинов и NO на секрецию вазопрессина, что может иметь важное значение при нарушении осмотического баланса для предотвращения истощения вазопрессинергической системы гипоталамуса. Полученные результаты важны для понимания механизмов регуляции водно-солевого обмена у млекопитающих, что имеет большое значение для разработки методических подходов лечения различного рода нарушений, в том числе приводящих к серьезным заболеваниям сердечно-сосудистой системы.
Существенно изменены традиционные представления о строго ограниченных функциях белков апоптоза, связанных с регуляцией клеточной гибели. Исследование имеет фундаментальное значение для понимания роли сигнальных белков апоптоза Bcl-2 и p53 в модуляции функциональной активности нейронов, что открывает новые перспективы в изучении взаимозависимости функциональной активности нейронов и их жизнеспособности. Исследование воздействий, приводящих к усилению экспрессии белков апоптоза в вазопрессинергических нейронах, которые в ряде случаев инициируют гибель нейронов, имеет важное значение для понимания причин возникновения нейродегенеративных заболеваний. Понимание механизмов взаимодействия различных белков апоптоза с внутриклеточными посредниками лежит в основе разработки новых подходов к лечению онкологических заболеваний, а также ряда нейродегенеративных заболеваний, патогенез которых связан с нарушением баланса про- и антиапоптозных белков. В настоящее время блокаторы белков апоптоза Bcl-2 и p53 используются при лечении онкологических заболеваний периферических органов, в связи с чем необходимо учитывать возможность влияния этих фармакологических агентов на центральную нервную систему. Полученные в работе данные могут быть использованы в курсах лекций для студентов биологических и медицинских факультетов университетов и медицинских институтов.
Апробация работы
Результаты исследования доложены и обсуждены на V Всероссийской конференции “Нейроэндокринология-2000” (С.-Петербург, 2000), на XVIII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, 2001), на Второй научной конференции с международным участием “Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии” (Новосибирск, 2002), на совещании “Monoaminergic and peptidergic neurons: Functional interactions in neuroendocrine regulations” (Париж, 2002), на международном симпозиуме “Neuron differentiation and plasticity – regulation by intercellular signals” (Москва, 2003), на Всероссийской конференции с международным участием “Нейроэндокринология-2003” (С.-Петербург, 2003), на 1 Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005), на Всероссийской конференции с международным участием “Нейроэндокринология-2005” (С.-Петербург, 2005), на XIII международном совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), на 6-th ICN (Питтсбург, США 2006), на XX съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва, 2007), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Санкт-Петербург, 2007), на Международной конференции «Apoptosis World 2008. From mechanisms to applications» (Люксембург, 2008), на Конференции с международным участием “Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга” (С.-Петербург, 2008), на 4th Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders (Лейпциг, Германия, 2009), на Всероссийской конференции с международным участием “Нейроэндокринология-2010” (С.-Петербург, 2010).
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российской академии наук, Российского фонда фундаментальных исследований №№ 98-04-49921, 01-04-48825, 05-04-48099, 08-04-00028.
Личный вклад автора. Результаты работы получены лично автором, под его руководством и при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 35 работы, 17 из которых – статьи в рецензируемых журналах, 18 - тезисы докладов.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 20 отечественных и 485 зарубежных источников. Работа изложена на 322 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 таблицами и 90 рисунками.
