Введение к работе
Актуальность исследования. Среди исследователей поведения существует полное согласие в том, что углубление наших представлений о феноменах памяти и обучения должно проистекать из знаний о клеточных и молекулярных механизмах этих процессов (Балабан П М, Захаров И С, 1992, Hawkins R D et al, 1993, 2006, Matzel L D et al, 1998, Balaban PM et al, 2004, Соколов E H , Незлина H И, 2007) К настоящему времени накопились экспериментальные данные, демонстрирующие важную роль мембранных процессов в ассоциативных и неассоциативных формах обучения (Alkon DL, 1984, Byrne J, 1987, Farley J, Hun Y, 1997, Frysztak R D ,Crow T, 1997, Staras К et al, 1998, Matzel L D et al, 1998, Haney J , Lukowiak K, 2001, Balaban PM, 2002b, Гайнутдинов ХЛ и др , 2002, Nikitm ES et al, 2006)
Нейробиологические механизмы формирования временной связи остаются мало изученными в силу целого ряда трудностей Один из путей преодоления этих трудностей - использование для анализа механизмов ассоциативного обучения простых клеточных систем, к каковым относится мозг моллюсков (Сахаров Д А, 1974, 1992, Kandel ER, 1980, 2001, Максимова О А, Балабан ПМ, 1983, Alkon D L, 1984, Sangha S et al, 2003) Интенсификация исследований механизмов обучения и памяти привела к новым экспериментальным подходам в изучении нейромедиаторных и модуляторных эффектов серотонина, а также механизмов участия соответствующих систем в явлениях пластичности поведения (Kandel Е R , Schwartz JH, 1982, Сахаров ДА, 1990, Balaban PM, 2002b) Многочисленные исследования свидетельствуют, что ассоциативное обучение и формирование долговременной сенситизации затрагивает пути, в которых нейромедиатором и нейромодулятором выступает серотонин (Glanzman D L et al, 1989, Балабан П М и др, 1986, 1992, Clark G A, Kandel ER, 1993, Гайнутдинова ТХ и др, 1998, 2002, Захаров И С , 2001, Burrell В D , Sahley С L , 2005, Gillette R , 2006) Эффект серотонина является цАМФ-зависимым, так как серотонин поднимает уровень цАМФ, а цАМФ и форсколин иммитируют серотониновый ответ в нейронах (Pollock J D et al, 1985, Yanow S К et al, 1998, Burrell В D , Sahley С L , 2005, Song X -J et al, 2006)
Факторы, влияющие на образование и распад цАМФ, хорошо изучены Внутриклеточная концентрация цАМФ находится под контролем двух противоположно направленных действий и опосредуется относительной активностью аденилатциклазы, образующей цАМФ из АТФ, с одной стороны, и фосфодиэстеразы, разрушающей циклический нуклеотид - с другой (Пивоваров
АС и др, 1989, Torphy TJ, 1998) Показано, что в нервных клетках комплекс Са2+-кальмодулин стимулирует аденилатциклазу, что должно потенцировать цАМФ - опосредованые реакции (Теппермен Дж , Теппермен X , 1989, Реутов В П , 1998) Эти данные свидетельствуют о функциональной зависимости между двумя вторичными посредниками - цАМФ и Са2+, а также между двумя системами -аденилатциклазной и системой мобилизации ионов Са2+ (Крутецкая 3 И и др, 2003) Таким образом, исследование роли серотонина и аденилатциклазной сигнальной системы в долговременных эффектах обучения на уровне параметров нейрональной мембраны и ионных каналов, представляется актуальным
Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось исследование мембранных механизмов длительных модификаций поведения у виноградной улитки и роли серотонинергической и аденилатциклазной систем в ассоциативном обучении В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи
-
сравнить электрические характеристики командных нейронов оборонительного поведения при разных формах условных рефлексов у виноградной улитки оборонительного, пищеотвергательного и обстановочного,
-
сравнить длительность сохранения изменений электрических характеристик командных нейронов при ассоциативном обучении и долговременной сенситизации, включая эффекты истощения серотонина и дофамина в нервной системе,
-
исследовать роль серотонинергической системы в формировании условного оборонительного рефлекса,
-
исследовать роль аденилатциклазной системы в формировании условного оборонительного рефлекса
Положения, выносимые на защиту:
1 Формирование условного оборонительного^ рефлекса, выработка
долговременной сенситизации, эффекты инъекций 5,7-дигидрокситриптамина и 6-
гидроксидофамина характеризуются деполяризационным сдвигом мембранного
потенциала и снижением порога генерации потенциала действия командных
нейронов виноградной улитки, которые сохраняются в течение 2-х недель
2 Долговременным эффектом обучения у улиток является повышение
активности фосфодиэстеразы цАМФ в командных нейронах оборонительного
поведения
Научная новизна. Найдено, что ежедневное введение предшественника серотонина 5-НТР перед началом сеанса обучения ускоряет процесс выработки
условного рефлекса Впервые показано, что введение предшественника серотонина 5-НТР перед началом сеанса обучения улиткам, которым была произведена предварительная инъекция 5,7-дигидрокситриптамина снимает эффект этого вещества Если на поведенческом уровне 5-НТР препятствовал действию 5,7-ДОТ, то на уровне электрических характеристик командных нейронов подобный эффект 5-НТР отсутствовал Найдено, что формирование условного обстановочного рефлекса, когда у улитки наблюдалось значительное увеличение амплитуды оборонительной реакции только в той обстановке, в которой при обучении наносились электрошоки, не влияет на Электрофизиологические параметры командных нейронов оборонительного поведения
Впервые найдено, что изменения электрических характеристик командных нейронов сохраняются в течение одного месяца после выработки условного оборонительного рефлекса и в течение двух недель после формирования долговременной сенситизации, т е в течение времени сохранения поведенческих изменений Впервые показано, что сдвиг значений электрических параметров командных нейронов, вызванный введением 5,7-дигидрокситриптамина и 6-гидроксидофамина сохраняется в течение не менее 2-х недель
Показано, что аппликация водорастворимого аналога цАМФ - 8Вг-сАМР и активатора аденилатциклазы форсколина вызывает деполяризацию командных нейронов как у интактных, так и у обученных улиток Применение хинина на фоне 8Вг-сАМР и форсколина увеличивает деполяризацию мембранного потенциала как у интактных, так и у обученных улиток Найдено, что аппликация ингибитора фосфодиэстеразы IBMX, увеличивающего уровень цАМФ в клетке, снижала мембранный потенциал покоя командных нейронов в группе обученных животных, но не в группе интактных улиток, что выявляет метаболические изменения, произошедшие в командных нейронах оборонительного рефлекса после ассоциативного обучения, на уровне фосфодиэстераз Показано, что аппликация блокатора кальмодулина трифлуопиразина приводила к увеличению мембранного потенциала у интактных улиток, в группе обученных животных 'потенциал покоя не изменился
Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли мембранных процессов в механизмах обучения и сохранения долговременной памяти Результаты, свидетельствующие об увеличении скорости формирования условного оборонительного рефлекса при ежедневной инъекции метаболического предшественника серотонина 5-НТР до
6 процедуры обучения, позволяют составить более полное представление о роли серотонина в процессах обучения и памяти Снижение мембранного потенциала покоя командных нейронов после аппликации неселективного блокатора фосфодиэстераз IBMX в группе обученных животных, но не в группе интактных улиток, выявляет метаболические изменения, произошедшие после ассоциативного обучения, на уровне фосфодиэстераз
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на итоговых конференциях Казанского научного центра РАН (Казань, 2000-2006 гг), 5, 7, 8 Всероссийских школах молодых ученых «Актуальные проблемы нейробиологии» (1998, 2000, 2001 гг). Central European Conference of Neurobiology, (Krakow, Poland, 2001 r), XVIII съезде Физиологического общества им И П Павлова, (Казань, 2001 г), 7-ой и 9-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2003, 2005 гг), V, VI, VII и VIII Всероссийских симпозиумах "Растущий организм адаптация к физической и умственной нагрузке" (Казань, 2000, 2002, 2006 г и Набережные Челны, 2004 г), Sixth IBRO World Congress of Neuroscience (Prague, Czech Republic, 2003 г), XIX съезде Физиологического общества им И П Павлова, (Екатеринбург, 2004 г), Всероссийской конференции «Нейрохимия Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005 г), Всероссийская конференция молодых исследователей «Физиология и медицина» (Санкт-Петербург, 2005 г), I съезда физиологов СНГ (Сочи-Дагомыс, 2005 г), 6-th, 8-th East European Conference of the International Society for Invertebrate Neuiobiology 'Simpler Nervous Systems" (Moscow-Pushchino, 2000, Kazan, 2006), Всероссийской ^конференции «Нейроспецифические метаболиты и энзимологические основы деятельности цнс» (Пенза, 2006 г), «Человек и его здоровье» 10-ая Всероссийская конференция молодых исследователей (Санкт-Петербург, 2007г), XX съезд физиологического общества им И П Павлова (Москва, 2007 г)
Реализация результатов исследования. Материалы исследования отражены в 10 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, и в 25 тезисах докладов
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 149 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, главы результатов исследования, общего их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы Список цитируемой литературы включает 284 источников, из них 182- иностранных авторов Диссертация иллюстрирована 37 рисунком и содержит 3 таблицы
