Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 15
1.1. Физиологически активные пептиды в нервной системе беспозвоночных 15
1.1.1. Нейропептиды семейства CNP 16
1.1.2. Эволюционый аспект функционирования нейропептидов 24
1.2.0бщее строение медицинской пиявки 30
1.2.1. Нервная система медицинской пиявки 32
1.2.1.1. Идентифицированные нейроны сегментарных ганглиев. 36
1.2.1.2. Идентифицированные нейроны субэзофагеального ганглия 41
1.2.2. Лакунарная (сосудистая) система медицинской пиявки 48
2. Методика 57
2.1. Животные и препарирование 57
2.2. Иммуноблоттинг 59
2.3. Иммуногистохимия 63
2.4. Электрофизиология 65
3. Результаты. 68
3.1. Поиск гомологичных CNP полипептидов в белковых фракциях, выделенных из нервной системы беспозвоночных разных типов...68
3.2. Поиск CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе медицинской пиявки 71
3.2.1. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки whole-mount 72
3.2.1.1.Исследование различий в уровне иммунореакции при окрашивании антителами к пептидам CNP4 и CNP2...72
3.2.1.2.Влияние модулирующих воздействий на уровень иммунореакции 73
3.2.2. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки на последовательных срезах 73
3.3. Идентификация CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки 79
3.3.1. Анализ распределения CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки и сопоставление с картой расположения нейронов 79
3.3.2. Разработка и применение метода относительных автофлуоресцентных ориентиров 84
3.3.3. Исследование природы CNP-иммунореактивности в межсегментарных коннективах 90
3.3.4. Эксперименты с двойным мечением нейронов пиявки 93
3.3.4.1. Двойное мечение нейронов субэзофагеального ганглия...93
3.3.4.2. Двойное мечение нейронов других ганглиев 94
3.3.5. Идентификация CNP-иммунореактивных нейронов 254, 226, 227 сегментарных ганглиев 100
3.4. Исследование физиологических эффектов пептида CNP4 в нервной системе пиявки 104
3.4.1. Аппликация пептида CNP4 в модели сенситизации моносинаптических ответов 104
3.4.2. Аппликация пептида CNP4 на полуинтактных препаратах «сердце-мозг». 107
4. Обсуждение результатов 112
4.1. Поиск гомологичных CNP полипептидов в белковых фракциях, выделенных из нервной системы беспозвоночных разных типов. 112
4.2. Поиск CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе медицинской пиявки 114
4.2.1. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки whole-mount 114
4.2.1.1. Исследование различий в уровне иммунореакции при окрашивании антителами к пептидам CNP4 и CNP2...114
4.2.1.2. Влияние модулирующих воздействий на уровень иммунореакции 114
4.2.2. Иммуногистохимическое окрашивание нервной системы медицинской пиявки на последовательных срезах 116
4.3. Идентификация CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки 117
4.3.1. Анализ распределения CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки и сопоставление с картой расположения нейронов 117
4.3.2. Разработка и применение метода относительных автофлуоресцентных ориентиров 118
4.3.3. Исследование природы CNP-иммунореактивности в межсегментарных коннективах 119
4.3.4. Эксперименты с двойным мечением нейронов пиявки 121
4.3.4.1. Двойное мечение нейронов субэзофагеального ганглия 122
4.3.4.2. Двойное мечение нейронов других ганглиев 123
4.3.5. Идентификация CNP-иммунореактивных нейронов 254, 226 и 227 сегментарных ганглиев 124
4.4. Исследование физиологических эффектов пептида CNP4 в нервной системе пиявки 126
4.4.1. Аппликация пептида CNP4 в модели сенситизации моносинаптических ответов 126
4.4.2. Аппликация пептида CNP4 на полуинтактных препаратах «сердце-мозг» 128
Заключение 135
Выводы 139
Список использованных источников 140
Благодарности. 153
- Идентифицированные нейроны субэзофагеального ганглия
- Анализ распределения CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки и сопоставление с картой расположения нейронов
- Двойное мечение нейронов других ганглиев
- Аппликация пептида CNP4 на полуинтактных препаратах «сердце-мозг»
Введение к работе
Наверное, не осталось в биологии такой области, в которой можно было бы пренебречь влиянием эндогенных химических веществ. Однако, во многих направлениях науки о живом ввиду сложности изучаемого объекта описать этот вклад можно только в общем, лишь примерно указав на возможность влияния со стороны генов и неизвестных внутренних факторов. Именно поэтому очень перспективно выглядят исследования в области нейробиологии, изучающей такие сложные феномены, как поведение, обучение или память на клеточном и молекулярном уровне.
На данный момент имеется два методологических подхода к изучению поведения и других сложных функций нервной системы на уровне молекул. Один из успешно развивающихся подходов носит название нейрогенетики и использует методы классической и обратной генетики, такие как картирование хромосом или выведение нокаутных линий животных. Применяя этот подход, исследователи, как правило, изучают корреляции между различными параметрами поведения и генотипом животного. При этом реальные физиологические механизмы, связывающие гены с этологическим фенотипом либо не обсуждаются, либо остаются в области предположений.
Другим принципиальным подходом к изучению поведения является нейробиологии. Начинавшаяся с изучения методами клеточной электрофизиологии простейших поведенческих актов на беспозвоночных животных (Kandel and Tauc, 1965), в последние несколько десятилетий эта область с одной стороны впитала в себя методы молекулярной биологии (Boguski and Jones, 2004), а с другой стороны её методы стали применяться для изучения таких сложных явлений, как выбор поведения и механизм принятия решений (Briggman et al., 2005). Так как основой нейробиологии
являются физиологические методы, то в рамках этого подхода становится возможным изучение роли отдельных генов и их пептидных продуктов в механизмах реализации сложных функций нервной системы. Образно говоря, современные методы физиологии позволяют построить мостик между генами и поведением.
Наиболее хорошо изученным механизмом, по которому гены влияют на фенотип, является классический путь с образованием полипептидных продуктов путём транскрипции ДНК и последующей трансляции РНК клеточным аппаратом. Белки и пептиды влияют на функции нервной системы непосредственно, являясь нейромедиаторами (инсулин), нейромодуляторами (FMRF-амид), а также рецепторами к ним; будучи включёнными в каскады передачи сигналов (протеинкиназы) или метаболизма классических медиаторов и других нейроспецифичных веществ (ацетилхолинэстераза). Кроме этих, очевидных, путей известны также полипептиды, действующие в нервной системе через другие механизмы, например регуляторы экспрессии генов (CREB, Notch), белки цитоскелета (тубулин) или транспортные белки.
Эндогенные биоактивные вещества белковой (как и любой другой) природы распределены в нервной системе неравномерно, их содержание специфично в каждой структуре и даже в отдельных клетках мозга. Это позволяет говорить о клеточном фенотипе, который по-разному проявляется, например, в дофаминергических нейронах активирующей системы мозга или нектин-иммунореактивных стволовых клетках нервной системы. На позвоночных животных знание паттернов распределения нейроспецифичных веществ позволяет ставить эксперименты с экстирпацией или стимуляцией исследуемых структур. Нервная система беспозвоночных, которая характеризуется относительно малым количеством относительно крупных нейронов, позволяет ставить прямые физиологические эксперименты над клетками с известными нейрохимическими фенотипами.
I и
В последнее десятилетие огромное число исследований посвящено изучению локализации и функции эндогенных биоактивных веществ различной природы в ЦНС беспозвоночных животных: моллюсков, нематод, кольчатых червей, насекомых, ракообразных (недавние обзоры: Nusbaum etal., 2001; Homberg, 2002; Nassel, 2002; Skiebe, 2003; Hummon et al., 2005). Значительное место в этих работах занимает изучение паттернов распределения и механизмов действия нейропептидов.
Вещества этого класса широко распространены в нервных системах различных животных, начиная с диффузной нервной сети таких примитивных организмов, как кишечнополостные (Bosch and Fujisawa, 2001; Anderson et al., 2004) и заканчивая ЦНС человека (Storm and Tecott, 2005). При этом разнообразие нейропептидов позволяет им выполнять широкий диапазон функций в нервной системе. В основном, нейропептиды выбрасываются в синаптическую щель вместе с основным медиатором и играют модулирующую роль — меняют временные или амплитудные параметры постсинаптического ответа, влияют на выброс медиатора из пресинаптической терминали. Кроме того, нейропептиды могут распространяться далеко от места секреции, в таком случае их обычно называют нейрогормонами.
Действуя как модуляторы синаптических связей и нейрогормоны, пептиды участвуют в сложнейших функциях нервной системы и организма в целом. Для примера можно привести пептид NPY, участвующий в организации пищевого поведения у человека (Ramos et al, 2005) или пирокинины, без которых не может пройти развитие насекомых с полным превращением (Ewer, 2005). Нейропептиды могут иметь одинаковую или близкую структуру у беспозвоночных и млекопитающих. Необходимость исследования нейропептидов подчёркивается также тем, что нарушение их нормальной функции лежит в основе некоторых заболеваний нервной системы человека, таких как болезнь Альцгеймера,
эпилепсия или симптом гипералгезии (Cairo and Torres-Aleman, 2004; Baraban and Tallent, 2004; King et al., 2005).
Одной из недавно открытых групп нейропептидов является семейство CNP (Command Neuron Peptides), предсказанное по нуклеотидной последовательности гена HCS2 и после обнаруженное иммунохимическими методами в ЦНС виноградной улитки Helix lucorum L. (Bogdanov et al., 1998; Balaban et al., 2001). Эти пептиды локализованы в нейронах сети оборонительного поведения улитки (ген HCS2 был выделен из командных нейронов этой сети); также недавно было исследовано распределение пептидов CNP в ЦНС другого моллюска, Aplysia californica (lerusalimsky et al.,. 2003). Изучение функций пептидов CNP только началось, однако уже показана их функция в модуляции оборонительной моторной программы, а также нейроростовые свойства (Коршунова и др., 2005). На данный момент неизвестно, ограничивается ли распространение семейства нейропептидов CNP нервной системой моллюсков или они свойственны также нервной системе других беспозвоночных животных.
Цели и задачи исследования.
Целью настоящей работы является поиск и исследование представителей нового семейства нейропептидов CNP в разных группах беспозвоночных животных. В соответствии с такой, поисковой, целью, в первую очередь необходимо было:
1. Выяснить, являются ли пептиды CNP уникальными для ЦНС улитки, или же гомологичные им пептиды присутствуют также в нервной системе других беспозвоночных животных.
Когда результаты иммуноблоттинга подтвердили предположение о широкой распространённости пептидов семейства CNP, нами были поставлены следующие задачи:
Выяснить, какие клетки нервной системы содержат гомологичные CNP пептиды — являются ли эти пептиды неспецифическими маркёрами всех клеток нервной ткани, локализованы в определённых клеточных типах (например, в глии или мотонейронах) или образуют ещё более специфичный паттерн распределения.
Провести сравнительный анализ паттерна CNP-иммунореактивных клеток с картами идентифицированных клеток, известными для некоторых беспозвоночных.
Охарактеризовать и по возможности идентифицировать CNP-иммунореактивные клетки, которые не обозначены на таких картах.
Так как, исходя из структуры, CNP являются секретируемыми пептидами, то возникает задача проверить эффекты аппликации синтетических пептидов CNP на нервную систему в физиологических концентрациях.
Научная новизна работы.
Нами впервые показано широкое распространение пептидов, гомологичных пептидам CNP улитки, в нервной системе беспозвоночных, не принадлежащих к типу Mollusca. Применённая модификация метода иммуноблоттинга с поликлональными антителами к пептидам CNP2 и CNP4
J-O
выявила присутствие гомологичных полипептидов в центральных ганглиях Lymnaea stagnalis, Lumbricus terrestris, Drosophila melanogaster и позволила определить их молекулярную массу.
С использованием иммуногистохимической техники окрашивания клеток, в ганглиях центральной и периферической нервной системы медицинской пиявки, Hirudo medicinalis, были впервые обнаружены CNP-иммунореактивные нейроны; на основе анализа большого количества препаратов нами была построена суммарная схема распространения таких нейронов в нервной системе пиявки, В нервной системе пиявки — так же, как и в ЦНС виноградной улитки — паттерн локализации CNP-иммунореактивных нейронов высокоспецифичен: пептиды выявляются в строго определённых кластерах с небольшим количеством идентифицируемых нейронов.
Благодаря правильно выбранному объекту исследования (медицинская
пиявка является классической нейробиологической моделью) удалось
продолжить исследование CNP-иммунореактивных нейронов и на уровне
клеточной физиологии. В работе впервые предпринята попытка выяснить
функции CNP-иммунореактивных нейронов и определить мишени
биологического действия гомологичных CNP пептидов в организме
представителя типа Annelida, пиявки Hirudo medicinalis.
Электрофизиологическими методами мы идентифицировали часть нервной сети CNP-иммунореактивных интернейронов 254. В нашем исследовании не было обнаружено влияния пептида CNP4 на фасилитацию двух известных моносинаптических связей. Были показаны тормозные модулирующие эффекты на сердце и возбуждающие его мотонейроны. Существование физиологических эффектов подтверждает выдвинутую нами гипотезу о широком распространении пептидов семейства CNP в нервной системе беспозвоночных животных.
Положения, выносимые на защиту.
Пептиды CNP не являются уникальными для ЦНС улитки: это семейство нейропептидов представлено в нервной системе беспозвоночных животных разных типов.
В нервной системе пиявки гомологичные CNP пептиды локализованы высокоспецифично: в строго определённых кластерах с небольшим количеством идентифицируемых нейронов.
Синтетический пептид CNP4 оказывает модулирующее тормозное влияние на деятельность сердца пиявки.
Идентифицированные нейроны субэзофагеального ганглия
Субэзофагеальный, или, говоря по-русски, подглоточный ганглий образовался в процессе филогенеза путём слияния сегментарных ганглиев четырёх головных сегментов. Произошло это предположительно при возникновении в процессе эволюции класса Пиявки, для которого характерно слияние нескольких ростральных сегментов в переднюю присоску. Соответственно такой структуре, исследователи обнаруживают в SubG некоторые клетки, аналогичные клеткам в СГ.
Во-первых, это нейроны Ретциуса, которые здесь значительно меньше размером, чем в СГ, но легко идентифицируются после витального окрашивания по характерному положению на медиальной границе глиальных пакетов. Физиологические эксперименты с этими нейронами показали высокую гомологию свойств клеток Ретциуса СГ и SubG (Kufiler and Potter, 1964; Wilson etal., 1996).-.
Во-вторых, в классических статьях Яо, учёного второго поколения стэндфордской школы, были детально описаны сенсорные клетки Р, N и Т в SubG (Yau, 1976а, 1976b). Было показано сходство морфологии, физиологических свойств, характеристик сенсорных ответов на тактильную стимуляцию, связи сенсорных нейронов с клетками Ретциуса в SubG и SG. В этих двух работах были отмечены достаточно сильно перекрывающиеся рецептивные поля, что связано с несколько большим ветвлением по соседним сегментам отростков клеток Р, N и Т. Эти данные были логично интерпретированы как проявление процесса цефализации, обособления головного участка тела. У пиявок, по сравнению с другими аннелидами, появляются новые сложные органы на основе головных сегментов (ротовые челюсти, присоска, связанные с ними органы чувств), соответственно в этих сегментах наблюдается слияние нервных ганглиев, усложнение ветвления нейронных отростков.
После того, как было показана принципиальная гомология нейронов SG и SubG, дальнейшие исследования были сосредоточены на поиске нейронов, которые отличают субэзофагеальный ганглий от сегментарных ганглиев. Это действительно очень интересный вопрос, так как пиявки являются животными, у которых процесс цефализации, обособления головной части нервной системы (в иностранной литературе даже используется термин головной мозг, head brain) начался совсем недавно. Конечно, мы имеем в виду эволюционную шкалу — время обособления класса Пиявки от класса Малощетинковые черви (про степень цефализации которых метко сказано народом: «червяк безмозглый»). Как всегда, мнения палеонтологов расходятся на многие миллионы лет, но в последнее время похоже не возникает серьёзных возражений против называемых геологических периодов Триас-Юра (Brusca and Brusca, 2002). При желании, процесс цефализации в нервной системе можно подвести под хорошо известную гегелевскую формулу: действительно, появление в SubG нейронов с новыми качествами можно связать с тем, что количество нейронов в слившихся ганглиях начинает превышать некоторое критическое.
Начало этому направлению исследований на пиявке положил цикл работ, выполненных в лаборатории Отто Фризэна (Brodfuehrer and Friesen, 1986b, 1986c, 1986d). В пионерских статьях Питера Бродфюрера была описана проделанная им огромная работа по идентификации двух нейронов субэзофагеального ганглия: Trl и Тг2. Название нейронам дало сокращение английского слова trigger (переключатель).
Дело в том, что в англоязычной литературе уже много лет стараются не пользоваться термином командный нейрон (введёным впервые в обиход нейробиологов в той же англоязычной литературе Вирсмой и закрепившийся в классическом определении Купферманна и Вейсса (Wiersma and Ikeda, 1964; Kupfermann and Weiss, 1978)). Вместо этого, для классификации интернейронов с командными функциями учёными используется целый арсенал терминов, зачастую непоследовательно и по непонятной причине. К таким терминам относятся: воротные нейроны {gating interneurons), триггерные нейроны {trigger neurons), совсем уже расплывчатые командноподобные нейроны {command-like neurons) и просто интернейроны высшего порядка {high-order interneurons). Так как мы не ставим своей целью провести анализ использования англоязычных терминов и выяснения различий между ними, то просто расскажем о свойствах нейронов Тг, и предоставим читателю самому попробовать классифицировать эти клетки. По терминологии, установившейся в отечественной литературе, мы условно назовём их командными нейронами (КН).
Сомы нейронов Trl и Тг2 расположены в ростромедиальной области SubG, в глиальном пакете R1, а их проекционные аксоны идут вдоль всей брюшной цепочки ганглиев. Морфология клеток Тг была изучена методами антероградной и ретроградной трассировки красителями, а также физиологическими методами — экстраклеточной регистрацией нерва и регистрацией моносинаптических ответов (Brodfuehrer and Friesen, 1986d; Esch et al., 2002; Taylor et al., 2003). Эта пара клеток была найдена перебором среди примерно десяти клеток в кластере Тг, а сам кластер был «заподозрен» в командных функциях в ранних экспериментах Бродфюрера с аппликацией 4М ацетата калия на разные области субэзофагеального ганглия. Такое воздействие вызывало деполяризацию близлежащих нейронов, и одновременно с этим в далеко отстоящих сегментарных ганглиях регистрировалась активация клеток нервной сети плавания. В последующих опытах с внутриклеточной регистрацией клеток Тг было установлено, что Trl запускает CPG плавания в сегментарных ганглиях (активирует клетки 204, 205, модулирующие серотонинергические клетки Ретциуса, 21 и 61), а Тг2 вызывает торможение программы плавания посредством торможения указанных выше клеток и осциляторных нейронов CPG 208, 33 и 60, что выражается в сдвиге фазы плавательного ритма (его «сбрасывании» — авторы употребляют слово "reset"). Результатом кропотливой работы Бродфюрера и Фризэна по идентификации субэзофагеальных нейронов, контролирующих плавательное поведение пиявки, стала статья с рифмованным названием в одном из самых престижных научных журналов (Brodfuehrer and Friesen, 1986а).
Анализ распределения CNP-иммунореактивных клеток в нервной системе пиявки и сопоставление с картой расположения нейронов
Проанализировав данные, полученные нами на whole mount препаратах и последовательных срезах ЦНС пиявки, мы построили схему распределения CNP-иммунореактивных нейронов, Рис. 3.3.1.1. На этой схеме отображено положение тел и отростков CNP-иммунореактивных нейронов, которые воспроизводились от препарата к препарату. Нами не было отмечено CNP-иммунореактивных глиальных клеток или волокон соединительной ткани, формирующей оболочку ганглиев и нервов. Более того, число CNP-иммунореактивных нейронов оказалось небольшим по сравнению с общим числом нейронов в нервной системе пиявки.
Так, например, в одном сегментарном ганглии пиявки содержится порядка 300 нейронов, а CNP-иммунореактивными являются только 8-15 из них. Разброс в численности пула CNP-иммунореактивных нейронов отражён на схеме цветовым кодированием — чёрным закрашены сомы нейронов, которые стабильно выявляются иммуногистохимически, серым — встречающиеся только в некоторых препаратах. Аналогичные вариации в численности нейронов, выкрашиваемых методом иммуногистохимии, были показаны как другими исследователями, так и в нашей лаборатории при исследовании распределения пептидов CNP в ЦНС разных видов моллюсков. Несмотря на относительно малое количество CNP-иммунореактивных клеток, они присутствуют во всех ганглиях центральной нервной системы пиявки, а также в периферических ганглиях переднего корешка (ARG).
CNP-иммунореактивных клеток с литературными данными о локализации идентифицированных нейронов в нервной системе пиявки. Она изучается интенсивно в течение многих лет, однако, большая часть данных об идентифицированных нейронах касается только сегментарных ганглиев. Наоборот, значительная часть CNP-иммунореактивных нейронов расположена в ганглиях, которые представляют нелёгкую задачу для исследования электрофизиологическими методами (нам не известно ни одного исследования с идентифицированными нейронами в церебральных ганглиях, хвостовой ганглионарной массе, периферических ганглиях ARG).
Среди CNP-иммунореактивных нейронов сегментарного ганглия наиболее стабильным качеством иммунореакции выделяются 8 нейронов: парные 119, 29 и 254, непарные 226 и 227 (на Рис. 3.3.1.1 обозначены чёрной заливкой). Цифры являются именем клетки, если не имеется исторического названия, и однозначно определяют позицию нейрона на карте ганглия (Muller et al., 1981). К хорошо идентифицируемым по размеру и положению нейронам относятся мотонейроны сердечного ритма НЕ, мотонейроны сокращения продольной мускулатуры АЕ и нейросекреторные клетки Лейдига. Полный список CNP-иммунореактивных нейронов, вероятность их детектирования и соответствующая наблюдаемой локализации позиция на карте ганглия сведены в Таблицу.
В качестве одного из основных критериев при идентификации нейронов в ЦНС пиявки используется размер и расположение сомы (по литературным данным, для некоторых клеток использование одного только этого критерия обеспечивает удачную идентификацию в 100% случаев). При этом электрофизиологами широко используется такой способ уточнить положение исследуемых клеток на поверхности ганглиев: живой препарат подкрашивают очень слабым раствором витального красителя нейтральный красный, который накапливается только в моноаминергических нейронах (Stuart et al., 1974). В каждом ганглии пиявки локализовано всего несколько хорошо изученных моноаминергических нейронов (серотонин-, дофамин- и октопаминергических), относительно которых исследователи могут задавать положение любых исследуемых клеток.
С целью уточнить положение CNP-иммунореактивных клеток, нами был разработан очень простой вариант этого метода для фиксированных препаратов. Гистологам давно известно свойство альдегидных фиксаторов усиливать автофлуоресценцию клеток (De la Lande and Waterson, 1968). Были разработаны протоколы, призванные уменьшить это нежелательное явление, но, судя по продолжающимся поискам новых способов (Clancy and Cauller, 1998; Zhang et al., 2002), удовлетворяющего всех средства так и не было найдено. Автофлуоресценция в жёлто-зелёном спектре наблюдается у любых клеток, но наиболее сильно она проявляется в моноаминергических нейронах. Сложив одно с другим, мы решили попробовать не бороться с автофлуоресценцией, а использовать её для своих целей, то есть для идентификации клеток.
Процедура состояла в окраске живого препарата нейтральным красным в течение 10 минут (до появления розового оттенка моноаминергических клеток) и последующей отмывкой раствором Рингера не менее 10 минут. Окрашенные подобным образом нейроны сохраняют свои физиологические свойства в течение длительного времени, краситель является прижизненным и используется исследователями много лет. Механизм действия красителя неизучен (Nusbaum and Kristan, 1986). Для тех же целей в нашей лаборатории многие годы используется подкраска препаратов нервной системы моллюсков метиленовым синим (с той принципиальной разницей, что у моллюсков нейроны выкрашиваются по неизвестному критерию — но паттерн окраски всегда одинаковый). Мы проверяли действие метиленового синего на ЦНС пиявки и нейтрального красного на ганглии виноградной улитки. В этих опытах выяснилось, что паттерн выкрашиваемых клеток для всех животных одного вида постоянен и не зависит от применяемого красителя.
Двойное мечение нейронов других ганглиев
Эта часть данных появилась не в результате специальной серии экспериментов, а после анализа препаратов субэзофагеальных ганглиев, заинтересовавших нас (предыдущая глава). Поэтому, мы извиняемся перед читателем за фрагментарность данных, пока не складывающихся в чёткую и ясную картину.
Так как нейробиотин загружался в субэзофагеальные ганглии через межсегментарую коннективу после третьего или четвёртого СГ, то мы можем говорить только о существовании отростков CNP-иммунореактивных клеток ганглиев М1-М4, идущих в каудальном направлении. В крайних ганглиях всегда обнаруживалось большое количество клеток, содержащих нейробиотин, и среди них CNP-иммунореактивная пара нейронов 254, Рис. 3.3.4.3. В предпоследнем и других, более ростральных СГ, клетки 254 не содержали нейробиотин. Иными словами, клетки 254 посылают отросток в каудальном направлении не дальше, чем на один сегмент.
В ганглиях переднего корешка ARG, в сегментах от М4 до Ml все клетки прокрашивались нейробиотином, включая и CNP-иммунореактивный нейрон, Рис. 3.3.4.4. Либо они действительно имеют очень длинный каудальный отросток, либо образуют специфические электрические синапсы, по которым нейробиотин может распространяться от клетки к клетке (т. н. dye-coupling gap junction").
Сенсорные нейроны Рг окрашивались жёлтым цветом на композитных изображениях крайнего сегментарного ганглия, что лишний раз подтверждает их и без того давно известную морфологию. Все остальные CNP-иммунореактивные нейроны, присутствовавшие в крайних ганглиях этих препаратов, не выявлялись при окрашивании на нейробиотин, что говорит о том, что они не посылают каудальных отростков в межсегментарную коннективу. В наших препаратах такими были следующие CNP-IR нейроны: 29, 226, 227, 57, 163, НЕ и непарный нейрон рядом с клетками Ретциуса. а б» В кластере CNP-иммунореактивных нейронов вентральной поверхности сегментарных ганглиев наиболее стабильно и ярко окрашиваются методом иммуногистохимии клетки 226, 227 и пара клеток 254. Эти нейроны имеют характерное положение в медиальной части ганглия (Рис. 3.3.1.1), но из-за малого размера сомы и связанных с этим трудностей при внутриклеточной регистрации, не вызывали интереса исследователей и не были ранее идентифицированы.
Используя идентификацию по размеру и положению, мы зарегистрировали электрофизиологическую активность клеток 254. Для идентификации использовалось положение относительно а) крупных нейронов Ретциуса; б) средних по размеру, но всегда легко узнаваемых по положению и активности мотонейронов АЕ и расположенных строго рострально от них клеток 251; в) искомые клетки 254 находятся на воображаемой оси между двумя серотонинергическими клетками 61, которые выкрашиваются на живом препарате нейтральным красным; г) клетки 254 парные, их сомы обычно расположены рядом, на оси билатеральной симметрии ганглия. В дальнейших экспериментах мы учитывали также наличие возбуждающего химического синапса между парой клеток 254 и характер их ответов на сенсорный приток.
Нами была впервые электрофизиологически исследована часть нейронной сети, в которой работает парный нейрон 254. На данный момент мы описали синаптические входы этих клеток и взаимодействие левой и правой клетки 254 между собой. На Рис. 3.3.5.1, сверху, показан типичный ответ пары клеток 254 на стимуляцию тактильного сенсорного нейрона Pj. Такие же ответы наблюдались и на другие сенсорные нейроны: Р2, Nb N2. В ответах клеток 254 видно две компоненты — ВПСП от химического синапса и быстрые изменения потенциала, имеющие форму маленьких спайков. Эти быстрые колебания потенциала возникают при существовании электрического синапса, которые обычны для ЦНС пиявки.
От сенсорных нейронов кластера Т на клетки 254 приходит тормозный синаптический приток (Рис. 3.3.5.1, снизу). Также наблюдаются «тени спайков», приходящие через электрический синапс. Во всех экспериментах существование электрического синапса подтверждалось инъекцией ГП тока — в электрически связанных клетках. На Рис. 3.3.5.2, сверху, приведены записи, демонстрирующие существование возбуждающего химического синапса между клетками пары 254. В поисках других мишеней клеток 254 мы проводили их одновременную регистрацию с известными мотонейронами АЕ и CV, многофункциональными нейронами Ретциуса и нейросекреторными клетками Лейдига, но никаких синаптических связей обнаружено не было. На Рис. 3.3.5.2, снизу, приведена схема, иллюстрирующая обнаруженные связи клеток 254.
Аппликация пептида CNP4 на полуинтактных препаратах «сердце-мозг»
В наших экспериментах на полуинтактных препаратах медицинской пиявки были обнаружены два разных феномена, наблюдаемых при аппликации пептида CNP4.
Первый, это быстрый миотропный эффект пептида: в течение минуты после аппликации наблюдалось значительное уменьшение амплитуды сокращений сердца. Мы считаем, что в данном случае мишенью пептида CNP4 является постсинаптическая мембрана нервно-мышечного синапса, так как не наблюдается быстрых изменений в одновременно регистрируемой активности мотонейронов сердца НЕ. Изменения, которые наблюдаются в нейронах НЕ имеют большую латентность, а максимум действия пептида на клеточную мембрану НЕ приходится на время 4-5-ого периода ритма, то есть около одной минуты после аппликации. К этому времени, амплитуда сердечных сокращений возвращается к 90% от нормы. Также мы проводили вспомогательные эксперименты с денервированной сердечной трубкой, в условиях, когда сердце пиявки не способно к автономным сокращениям. Как и ожидалось, аппликация пептида CNP4 в условиях нарушенной иннервации не вызывает сердечных сокращений. Суммируя данные всех опытов с полуинтактными препаратами, мы определяем миотропный эффект пептида CNP4 на сердце пиявки как тормозный модулирующий. Действие пептида CNP4 заключается в уменьшении амплитуды сокращений сердца без изменения временных параметров сердечного ритма.
Второй эффект пептида CNP4 был обнаружен при статистическом анализе параметров ритмической активности клеток НЕ. Обнаруженные изменения (снижение мембранного потенциала; продление фазы ГП за счёт сокращения фазы залповой активности; снижение наполненности пачек) характеризуют тормозное действие пептида CNP4 на нейроны НЕ. Амплитуда этого эффекта пептида CNP4 слабее, чем на уровне сердечной мышцы, а временные параметры характеризуются большой латентностью и длительностью действия (минуты, десятки минут, вплоть до отмывания раствором Рингера). Наиболее чётко динамика нейротропного эффекта CNP4 наблюдается при анализе изменения мембранного потенциала нейронов НЕ (Рис. 3.4.2.3, первая гистограмма).
Интересно, что пептид CNP4 влияет на длительность фаз сердечного ритма в нейронах НЕ, но период ритма в целом не изменяется. Объяснение феномена кроется в организации генератора сердечного ритма пиявки. Дело в том, что клетки НЕ сами по себе не задают сердечный ритм, их спонтанная ритмическая активность задаёт только частоту ПД в пачках. В условиях блокированной синаптической передачи ритмическая активность НЕ вообще не прерывается фазами гиперполяризации (Nicholls and Wallace, 1978). Непосредственным генератором ритма сердца, его CPG, являются интернейроны HN, пейсмейкерная активность которых вызывает фазу гиперполяризации в мотонейронах НЕ, Рис. 4.4.2.1. Поэтому, при аппликации пептида CNP4 мы и не наблюдали изменений периода ритма — интернейроны HN не подвержены влиянию CNP4. Изменения в длительности фаз в нейронах НЕ обусловлены сдвигом МП, при более отрицательном его значении клетка медленнее достигает порога генерации спайков в конце фазы ГП, а сама фаза ГП начинается раньше (это хорошо видно на Рис. 3.4.2.2).
Сонаправленность эффектов CNP4 на мышечном и нейронном уровне (торможение) может свидетельствовать о сходстве рецепторного механизма пептидов семейства CNP в нервной и мышечной тканях. Конечно, наши данные позволяют только сделать предположение, для доказательства этой гипотезы и выяснения конкретных постсинаптических мишеней пептида CNP необходимо провести эксперименты по регистрации отдельных ионных каналов на постсинаптических мембранах.
Подобные эксперименты проводились, например, для выяснения мишеней пептида Mytilus SCP в нейронах ЦНС садовой улитки. Пептид Mytilus SCP, выделенный более 10 лет назад из мышечной ткани мидии Mytilus edulis группой японских учёных (Fujisawa et al., 1993а), по своей структуре (APNFLAYPRL-амид) принадлежит к семейству CNP. Действие пептида на нейроны садовой улитки изучалось группой Уолкера (Chen et al., 1995). В сериях экспериментов с манипулированием ионным составом Рингера и аппликацией различных блокаторов было показано, что деполяризация плазмалеммы нейронов F2 при аппликации пептида Mytilus SCP обусловлена повышением Na и Са проводимости через вторичный посредник невыясненной природы.
При исследовании других нейропептидов (например, миомодулина (Wang et al., 1999) и FMRF-амида (Li and Calabrese, 1987; Cottrell andDavies, 1987)), учёные также обнаруживали действие пептидов как на мышечную, так и на нервную ткань. Нет ничего удивительного, что и мы в нашей работе наблюдали эффекты пептида CNP4 на нейроны НЕ и на сердечную мышцу. В случае пептида CNP4 эти эффекты оказались сонаправлены, но характеризуются разными амплитудными и временными параметрами. Исходя из соотношения эффектов, можно сделать предположение, что для CNP4 основным является миотропное действие на сердце, в то время как нейротропное действие на нейроны НЕ больше похоже на проявление отрицательной обратной связи. Подобные связи широко распространены в биологических системах регуляции, в том числе и деятельности сердца. Напомним, что клетки НЕ являются CNP-иммунореактивными клетками, и скорее всего пептид(ы) семейства CNP выбрасываются вместе с другими медиаторами при активации нейронов НЕ. При такой гипотетической организации, функцией пептидов CNP будет ограничение активности сердца в физиологически оправданном диапазоне, регуляция сердечных сокращений в зависимости от нагрузки, Рис. 4.4.2.2.
