Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 12
2.1. Долговременные модификации поведения, определяемые условиями выращивания потомства в раннем постнатальном периоде 12
2.1.1. Роль материнского ухода за потомством в формировании поведенческого фенотипа незрелорождающихся лабораторных животных 12
2.1.2. Долговременные модификации поведения, опосредованные изменением уровня материнского ухода за потомством в раннем постнатальном периоде 13
2.2. Роль эпигенетических механизмов в долговременных модификациях поведения, определяемых условиями выращивания потомства в раннем постнатальном периоде 18
2.2.1. Характеристика эпигенетических механизмов 18
2.2.2. Роль эпигенетических механизмов в долговременных модификациях поведения, определяемых условиями выращивания потомства в раннем постнатальном периоде 22
2.2.3. Значение эпигенетических механизмов в пластичности нервной системы и введение блокаторов гистоновых деацетилаз как инструмент для их исследования 25
2.3. Характеристика поведенческого фенотипа мышей линии 129Sv как потенциальной модели для исследования роли эпигенетических механизмов в долговременной модификации поведения, определяемой условиями выращивания потомства 31
2.3.1. Ранний постнатальный период 31
2.3.2. Поведение взрослых животных – сенсомоторные показатели .32
2.3.3. Поведение взрослых животных – эмоциональные показатели...32
2.3.4. Поведение взрослых животных – когнитивные показатели 33
3. Материалы и методы исследования 36
3.1. Условия содержания животных 36
3.2. Определение уровня ацетилирования гистона H3 в мозге мышей линии 129Sv сразу после их выращивания в разных условиях на первой неделе жизни 37
3.3. Влияние депривации от матери, сопровождающейся тактильной стимуляцией, в раннем постнатальном периоде на результаты раннего обонятельного обучения 40
3.4. Влияние введения вальпроата натрия в раннем постнатальном периоде на модификацию поведенческого фенотипа 42
3.4.1. Регистрация материнского поведения интактных самок (F0)
на 5-6 постнатальные сутки их потомства 43
3.4.2. Влияние введения вальпроата натрия в раннем постнатальном периоде на результаты раннего обонятельного обучения 48
3.4.3. Батарея развитийных тестов 48
3.4.4. Исследование поведения взрослых самцов, подвергавшихся в раннем постнатальном периоде различным экспериментальным воздействиям 50
3.4.4.1. Открытое поле 51
3.4.4.2. Приподнятый крестообразный лабиринт 52
3.4.4.3. Обучение условнорефлекторному замиранию на обстановку 52
3.4.4.4. Т-лабиринт 53
3.4.5. Исследование поведения взрослых самок (F1),
подвергавшихся в раннем постнатальном периоде различным экспериментальным воздействиям 55
3.4.6. Процедура обучения мышат второго поколения (F2) 55
3.5. Статистическая обработка данных 55
4. Результаты исследования 56
4.1. Анализ контрольных параметров 56
4.1.1. Определение уровня ацетилирования гистона H3 в мозге мышей линии 129Sv сразу после их выращивания в разных условиях на первой неделе жизни 56
4.1.2. Масса мышат первого поколения (F1) и их сенсомоторное развитие в гнездовой период 57
4.1.3. Масса мышат второго поколения (F2) 64
4.2. Анализ основных параметров 65
4.2.1. Влияние депривации от матери, сопровождающейся тактильной стимуляцией, в раннем постнатальном периоде на результаты раннего обонятельного обучения 65
4.2.2. Влияние введения вальпроата натрия в раннем постнатальном периоде на модификацию фенотипа 66
4.2.2.1. Результаты анализа обучения мышат первого поколения (F1) 66
4.2.2.2. Анализ поведения взрослых самцов 69
4.2.2.2.1. Открытое поле 69
4.2.2.2.2. Приподнятый крестообразный лабиринт 71
4.2.2.2.3. Соотношение времени, проводимого в каждой из зон открытого поля и приподнятого крестообразного лабиринта 73
4.2.2.2.4. Обучение условнорефлекторному замиранию и тестирование на обстановку 74
4.2.2.2.5. Т-лабиринт 77
4.2.2.3. Материнское поведение интактных самок (F0) и самок, подвергавшихся в раннем постнатальном периоде экспериментальным воздействиям (F1) 78
4.2.2.3.1. Поведение самок F0 и F1 с потомством в домашней клетке 78
4.2.2.3.2. Корреляции в структуре поведения самок F0 и F1 с потомством в домашней клетке 87
4.2.2.3.3. Сопоставление результатов переноса мышат двух поколений 91
4.2.2.4. Результаты анализа корреляции поведения самцов в раннем постнатальном периоде, а также во взрослом возрасте с материнским поведением воспитывавших их самок 92
4.2.2.5. Результаты анализа обучения мышат второго поколения (F2) 93
4.2.2.6. Сопоставление результатов обучения мышат двух поколений 95
4.2.3. Поведенческий фенотип мышей линии 129Sv, выращенных в различных условиях 96
5. Обсуждение результатов 98
6. Заключение 116
7. Выводы 117
8. Список сокращений 118
9. Список литературы
- Долговременные модификации поведения, опосредованные изменением уровня материнского ухода за потомством в раннем постнатальном периоде
- Определение уровня ацетилирования гистона H3 в мозге мышей линии 129Sv сразу после их выращивания в разных условиях на первой неделе жизни
- Исследование поведения взрослых самцов, подвергавшихся в раннем постнатальном периоде различным экспериментальным воздействиям
- Влияние депривации от матери, сопровождающейся тактильной стимуляцией, в раннем постнатальном периоде на результаты раннего обонятельного обучения
Введение к работе
Ранний постнатальный опыт оказывает долговременное влияние на формирование поведенческого фенотипа. Предполагается, что в основе этого лежат эпигенетические модификации генома нервных клеток (Colvis C.M. et al., 2005), играющие важную роль в пластичности нервной системы новорожденных и взрослых животных (Liu D. et al., 1997; Francis D. et al., 1999; Caldji C. et al., 2000; Liu D. et al., 2000; Bredy T.W. et al., 2003; Bredy T.W. et al., 2004; Weaver I.C.G. et al., 2004; Weaver I.C.G. et al., 2006; Pedersen C.A. et al., 2011; Lindeyer C.M. et al., 2013). К наиболее изученным эпигенетическим модификациям, возникающим в ответ на воздействия среды, относятся метилирование ДНК и посттрансляционные модификации гистонов, определяющие транскрипционную активность генов (Dulac C., 2010). В связи с этим исследование эпигенетических механизмов модификаций поведения – актуальная проблема современной нейробиологии и физиологии ЦНС. Настоящее исследование направлено на изучение влияния средовых эпигенетических стимулов посредством модификации гистонов в мозге на долговременную модификацию поведения.
Поведение незрелорождающихся млекопитающих формируется под постоянным материнским контролем (Claessens S.E. et al., 2011). Закономерно, что отношения мать-детеныш определяют физическое развитие и формирование поведения у грызунов (Fleming A.S. et al., 1999; Cameron N.M. et al., 2005) и человека (Heim C., Nemeroff C.B., 2001; Hedges D.W., Woon F.L., 2011). Это было продемонстрировано с помощью моделей пре- и постнатального стресса, депривации потомства от матери, хэндлинга, вариации уровня материнского ухода за потомством у грызунов (Anisman H. et al., 1998; Francis D. et al., 1999; Caldji C. et al., 2000; Champagne F. et al., 2003; Cirulli F. et al., 2003; Colvis C.M. et al., 2005; Pryce C.R. et al., 2005; Champagne D.L. et al., 2008; Franklin T.B. et al., 2010).
Хэндлинг (3-15-минутное отсаживание детенышей от самки, сопровождающееся тактильной стимуляцией) в раннем постнатальном периоде оказывает благоприятное воздействие на эмоциональные и когнитивные характеристики взрослых животных (Levine S., 1956; Denenberg V.H., Haltmeyer G.C., 1967; Levine S. et al., 1967; Meaney M.J. et al., 1988; Meerlo P. et al., 1999; Caldji C. et al., 2000; Kosten T.A. et al., 2007). Противоположное, отрицательное, действие оказывает длительная депривации потомства от самки (3-24 ч) (Huot R.L. et al., 2002; Kalinichev M. et al., 2002; Uysal N. et al., 2005; Aisa B. et al., 2007, 2008, 2009), приводящая к снижению уровня ацетилирования гистонов в мозге выросшего потомства (Tesone-Coelho C. et al., 2013).
Наблюдения за детско-материнскими отношениями лабораторных крыс и мышей в первую неделю жизни показали, что в их популяции имеют место естественные вариации
уровня материнского ухода за потомством (Meaney M.J., 2001; Champagne F. et al., 2003; Wei L. et al., 2010; Pedersen C.A. et al., 2011). Эти различия сильно сказываются на экспрессии генов и поведении потомства в будущем (Liu D. et al., 1997; Caldji C. et al., 1998; Francis D. et al., 1999; Champagne F. et al., 2001; Meaney M.J., 2001; Champagne F. et al., 2003; Pedersen C.A. et al., 2011). Показано, что механизмом, определяющим поведенческий фенотип потомства самок с различным уровнем материнского ухода, является различие в уровне метилирования ДНК промотора гена глюкокортикоидных рецепторов в нейронах гиппокампа и в уровне ацетилирования гистона Н3 в области этого же промотора (Weaver I.C.G. et al., 2004). Экспериментальная модуляция молекулярных эпигенетических механизмов в этой модели приводит к изменению поведенческого фенотипа крыс (Weaver I.C.G. et al., 2004; Weaver I.C.G. et al., 2006).
Одним из методов вмешательства в эпигенетические механизмы является блокада гистондеацетилаз (HDAC – histone deacetylases), приводящая к увеличению уровня ацетилирования гистонов в мозге. К изученным и доступным ингибиторам HDAC относятся трихостатин А, бутират натрия, вальпроевая кислота и ряд других, каждый из которых обладает различной степенью селективности к классическим изоформам HDAC (Roth T.L., Sweatt J.D., 2009).
Таким образом, эпигенетические механизмы, в том числе ацетилирование гистонов, играют важную роль в пластичности нервной системы как новорожденных, так и взрослых животных, и одним из главных инструментов для исследования этих механизмов является блокада гистоновых деацетилаз.
Однако попытка исследования влияния введения блокаторов гистоновых деацетилаз в первую неделю жизни, являющуюся критическим периодом для формирования будущего эпигенетического статуса животных, на модификацию поведенческого фенотипа животных до сих пор не предпринималась. В литературе отсутствуют данные о роли эпигенетических стимулов в формировании поведенческого фенотипа в раннем постнатальном периоде, в частности, результативности обучения лабораторных мышат, о соотношении результатов этого обучения с поведенческим фенотипом взрослых животных в зависимости от условий выращивания в раннем онтогенезе, о влиянии эпигенетических стимулов на результаты обучения детенышей следующего поколения.
Удобным объектом для исследования долговременной модификации поведения, определяемой условиями выращивания потомства мышей, а также роли эпигенетических механизмов в этом процессе являются мыши линии 129Sv, поскольку в раннем постнатальном периоде они характеризуются высокой поведенческой пластичностью при изменении уровня материнского ухода (Александрова Е.А. с соавт., 2005).
Цель и задачи исследования
Целью исследования явилось изучение влияния изменения уровня ацетилирования гистонов в мозге мышей линии 129Sv в первую неделю жизни на формирование их поведенческого фенотипа в двух поколениях
В соответствии с поставленной целью конкретными задачами работы были:
-
Исследование влияния блокады гистоновых деацетилаз у мышат линии 129Sv на фоне депривации от матери в первую неделю жизни на раннее обонятельное обучение мышат, непосредственно подвергавшихся воздействию, и мышат следующего поколения;
-
Исследование влияния блокады гистоновых деацетилаз и депривации от матери в первую неделю жизни самок мышей линии 129Sv на стиль их материнского поведения;
-
Исследование влияния блокады гистоновых деацетилаз и депривации от матери в первую неделю жизни самцов мышей линии 129Sv на их поведенческий фенотип во взрослом возрасте.
Научная новизна работы
Впервые показано, что 45-60-минутная депривация от матери в раннем постнатальном периоде, сопровождающаяся тактильной стимуляцией, ухудшает результаты раннего обонятельного обучения. Установлено, что влияние эпигенетических стимулов на формирование поведенческого фенотипа лабораторных мышей, в том числе на раннее обучение, имеет зависящий от пола характер: под влиянием многократных инъекций вальпроата натрия избирательное улучшение результатов раннего обонятельного обучения наблюдается у самцов, а у самок к этому эффекту приводят многократные инъекции физиологического раствора. В работе впервые дана характеристика долговременного влияния блокатора гистоновых деацетилаз на формирование поведенческого фенотипа потомства: изменение уровня материнского ухода у самок и эмоционального профиля у самцов. Также впервые показано влияние введения блокатора гистоновых деацетилаз в раннем постнатальном возрасте на результаты раннего обонятельного обучения детенышей следующего поколения.
Научно-практическая значимость работы
Результаты этой работы позволят расширить представления о механизмах долговременных модификаций поведения, обусловленных эпигенетическими воздействиями на организм. Исследование биологических механизмов, лежащих в основе долговременного влияния условий окружающей среды в раннем постнатальном периоде, имеет важное прикладное значение, поскольку их знание может быть использовано в терапевтических целях для профилактики и лечения последствий неблагоприятных событий в раннем возрасте. Так, поскольку исследуемые эпигенетические механизмы долговременной модификации поведения
могут лежать в основе различных форм заболеваний (формирование зависимости к алкоголю и наркотикам, невротические и постстрессорные состояния) и являться объектом для создания новых подходов к их коррекции, большое значение имеют показанные в данной работе гендер-зависимые особенности влияния эпигенетических стимулов, свидетельствующие о необходимости применения различных подходов при работе с особями каждого пола.
Положения, выносимые на защиту
-
Ежедневная депривация от матери продолжительностью 45-60 мин в течение первой недели жизни приводит к изменению фенотипа животных. Наибольшее влияние этих условий выращивания на модификацию поведения показано в раннем онтогенезе. Долговременные эффекты депривации на поведенческий фенотип взрослых животных выражены слабее.
-
Вмешательство в эпигенетические механизмы модификации поведения путем блокады гистоновых деацетилаз в раннем постнатальном периоде развития мышей оказывает гендер-зависимое действие на раннее обонятельное обучение. Данная экспериментальная процедура также оказывает долговременные эффекты на фенотип взрослых животных обоих полов, как и на фенотип детенышей следующего поколения.
-
Воздействие блокады гистоновых деацетилаз приводит к коррекции модификаций поведенческого фенотипа детенышей и взрослых самок, вызванных такими манипуляциями в раннем постнатальном периоде, как депривация от матери и введение физраствора.
Апробация работы
Результаты исследования доложены и обсуждены на XXI Съезде физиологического общества им. Павлова (Калуга, 2010); 8м Международном конгрессе по нейронаукам IBRO (Флоренция, 2011); Конференции молодых ученых «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2011); V Всероссийской конференции по поведению животных (Москва, 2012); 8м Форуме FENS (Барселона, 2012); конференциях Отдела системогенеза НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (2010-2013); Итоговых сессиях НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина (2011-2014).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методики экспериментов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 155 страницах, содержит 27 рисунков, 5 таблиц и 11 приложений. Библиографический указатель содержит 217 источников, из них 12 на русском и 205 на иностранных языках.
Публикации
Долговременные модификации поведения, опосредованные изменением уровня материнского ухода за потомством в раннем постнатальном периоде
Процессы метилирования ДНК и гистоновых модификаций тесно связаны друг другом, в конечном счете определяя структуру хроматина в промоторах тех или иных генов и активацию или подавление транскрипции. Так, метил-цитозин-связывающий белок (MeCP, methyl-CpG-binding protein) связывается с метилированными промоторными участками ДНК, вовлекая в работу мультибелковые комплексы, содержащие, в том числе, HDAC, что ведет к деацетилированию гистонов и конденсации в области промотора, обуславливая подавление транскрипции (Sharma R.P. et al., 2005).
Наличие гистондеацетилаз показано у позвоночных животных, растений, насекомых, грибов, дрожжей и бактерий (Lechner T. et al., 1996; Marmorstein R., 2001; Minucci S., Pelicci P.G., 2006).
Существует 11 различных изоформ HDAC, большинство из которых экспрессируется в ЦНС, а также неклассическая форма HDAC, к которой относятся сиртуины, функционирование которой характеризуется совершенно иными каталитическими механизмами, нежели классические изоформы HDAC (Marmorstein R., 2001; Roth T.L., Sweatt J.D., 2009).
Согласно локализации, структурным и функциональным особенностям, а также паттернам экспрессии выделяют 4 класса гистондеацетилаз (Minucci S., Pelicci P.G., 2006). К классу I относятся HDAC 1, 2, 3 и 8 – экспрессирующиеся практически во всех органах и тканях конститутивные ядерные белки, которые характеризуются высоким сродством именно к гистоновым субстратам (Broide R.S. et al., 2007; Haberland M. et al., 2009). Гистондеацетилазы класса II (HDAC 4, 5, 6, 7, 9 и 10) экспрессируются только в некоторых типах тканей (например, HDAC 5 и HDAC 9 – преимущественно в мышцах, сердце и мозге, HDAC 4 – в мозге и костной ткани, HDAC 7 – в эндотелиальных клетках и тимоцитах) и локализуются как в ядре, так и в цитоплазме. В отличие от гистондеацетилаз класса I, они менее специфичны по отношению к ацетилированным гистонам и участвуют в деацетилировании белков цитоскелета, трансмембранных белков, шаперонов (Minucci S., Pelicci P.G., 2006; Broide R.S. et al., 2007; Haberland M. et al., 2009). К III классу гистондеацетилаз относят сиртуины (Marmorstein R., 2001; Broide R.S. et al., 2007; Hildmann C. et al., 2007). К IV классу гистондеацетилаз относится единственный фермент HDAC11, имеющий общие черты с гистондеацетилазами I и II классов, однако, вероятно, имеющий специфические физиологические функции. Его экспрессия наблюдается в мозге, сердце, мышцах, почках и семенниках (Haberland M. et al., 2009). Представители I, II, IV классов гистондеацетилаз экспрессируются в ЦНС. Самый высокий уровень экспрессии в мозге наблюдается у HDAC3, HDAC5 и HDAC11. Большинство HDAC экспрессируется преимущественно в нейронах, в то время как HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC5 и HDAC11 экспрессируются также в олигодендроцитах (Broide R.S. et al., 2007). Топография экспрессии HDAC в мозге индивидуальна для каждого типа гистондеацетилаз, однако в целом экспрессия максимальна в гиппокампе, пириформной коре и обонятельных луковицах (Broide R.S. et al., 2007). Конститутивные нокауты большинства HDAC летальны, что демонстрирует важную роль этих ферментов в процессах развития (Haberland M. et al., 2009).
Показано, что вышеперечисленные эпигенетические механизмы способны долговременно поддерживать не только стабильные геномные свойства отдельных клеток, но и делать это на уровне их ансамблей, обеспечивающих долговременные изменения в поведении (Korzus E. et al., 2004).
Таким образом, поскольку эпигенетические механизмы лежат в основе долговременных изменений транскрипционной активности генома, они могут являться основой для поддержания долговременных устойчивых эффектов раннего опыта. Роль эпигенетических механизмов в долговременных модификациях поведения, определяемых условиями выращивания потомства в раннем постнатальном периоде
Для изучения вклада эпигенетических воздействий в раннем периоде развития на долговременную модификацию взрослого поведенческого фенотипа используются модели материнского ухода или его имитации, перинатального стресса, материнской депривации, обогащенной среды, постнатального хэндлинга и.т.д. Полученные в них данные свидетельствуют о том, что вариации перинатального опыта определяют не только поведенческие (Meaney M.J., 2001; Champagne F.A. et al., 2003) и физиологические (Liu D. et al., 1997; Caldji C. et al., 1998) свойства взрослого потомства, но также и характер экспрессии генов во взрослом мозге (Liu D. et al., 1997).
Было выяснено, что у потомства самок, которые часто чистят своих детенышей и находятся в позе кормления, и у потомства самок, которые делают это редко, ДНК промотора глюкокортикоидных рецепторов (экзона 17 промотора GR) в гиппокампе метилирована по-разному: в первом случае наблюдается низкая степень метилирования ДНК, а у детей матерей с низким уровнем ухода за потомством – наоборот. Уровень ацетилирования гистона H3 в области этого же промотора противоположен: у детей матерей с высоким уровнем ухода за потомством наблюдается высокий уровень ацетилирования, а у детей матерей, чей уровень ухода низок – наоборот. Эти различия в уровне метилирования ДНК и ацетилирования гистонов в мозге потомства появляются после первой недели жизни и сохраняются на всем ее протяжении (Weaver I.C.G. et al., 2004), обуславливая свойства эмоционального и когнитивного профиля взрослых животных (Liu D. et al., 1997; Francis D.D. et al., 1999; Caldji C. et al., 2000; Liu D. et al., 2000; Bredy T.W. et al., 2003; Bredy T.W. et al., 2004; Weaver I.C.G. et al., 2006; Pedersen C.A. et al., 2011; Lindeyer C.M. et al., 2013). Известно также, что условия выращивания в первую неделю жизни способны оказывать влияние на экспрессию гена нейротрофического фактора головного мозга (BDNF, brain-derived neurotrophic factor), одного из ключевых генов, задействованных в нейрональной пластичности
Определение уровня ацетилирования гистона H3 в мозге мышей линии 129Sv сразу после их выращивания в разных условиях на первой неделе жизни
Таким образом, выявленные различия в уровне ацетилирования гистона H3 в мозге мышат на 7ПС показали, что использованная нами процедура депривации от матери приводила к его снижению, и лишь многократное введение вальпроата натрия - к его восстановлению. Это позволило нам предположить, что выявленная разница в уровне ацетилирования может быть связана с различиями в поведении животных различных экспериментальных групп.
Масса мышат первого поколения (F1) и их сенсомоторное развитие в гнездовой период Для оценки физического развития животных разных экспериментальных групп мы проводили анализ массы тела животных и открывания их глаз (руководство OECD (Organization for Economic Cooperation and Development, Организация экономического сотрудничества и развития), 2006; Alton-Mackey M.G., Walker B.L., 1973; Alton-Mackey M.G., Walker B.L., 1978).
Анализ показателя массы тела детенышей со 2ПС по 9ПС не выявил межгрупповых различий (Рисунок 7). Рис. 7 Масса тела мышат первого поколения (F1) в возрасте 2-9ПС: А – самцов, Б – самок (среднее значение ± стандартная ошибка).
Динамика увеличения массы тела с возрастом была сходной у животных всех экспериментальных групп, что может свидетельствовать об отсутствии влияния экспериментальных процедур на физическое развитие со 2ПС по 9ПС. Анализ показателя массы самцов с 10ПС по 20ПС также не выявил достоверных отличий в группе «депривация б/и» от детенышей других групп.
Масса самок с 10ПС по 20ПС в группах «депривация б/и», «физраствор однократный» и «физраствор многократный» была одинаковой. Масса самок в группе «вальпроат однократный» на 16ПС была ниже, чем в группе «вальпроат многократный» (U=17,5; Z=-2,0; p=0,042).
У самок в группе «депривация б/и» на 19ПС показатель открывания глаз был выше, чем в группе «физраствор однократный» (2=4,20, p=0,040). У самок в группе «физраствор однократный» показатель открывания глаз был ниже, чем в группе «физраствор многократный» на 17ПС (2=4,70, p=0,03), 18ПС (2=7,18, p=0,007), 19ПС (2=6,23, p=0,013) и 20ПС (2=4,95, p=0,026). На 18ПС у самок в группе «вальпроат однократный» показатель открывания глаз был ниже, чем в группе «вальпроат многократный» (2=5,24, p=0,022) (Рисунок 8).
В целом, самки прозревали раньше, чем самцы. Так, на 14ПС лишь у некоторых самцов в группе «депривация б/и» наблюдалось полное открывание глаз (показатель 1,0), а в остальных группах оно отсутствовало. У самок из групп «физраствор однократный», «физраствор многократный» и «вальпроат многократный» в этом возрасте было отмечено полное прозревание. У самцов до 20ПС ни в одной из групп не наблюдалось полного прозревания, в то время как полное прозревание всех самок впервые наблюдалось на 16ПС в группе «вальпроат многократный», а на 18ПС также полностью прозревали все самки в группе «физраствор многократный».
У животных в группе «депривация б/и» межполовые различия открывания глаз наблюдались на 16ПС: число самок с полностью открывшимися глазами было больше (2=3,94, p=0,047). В группе «физраствор однократный» межполовые различия отсутствовали. В группе «физраствор многократный» количество самок с полностью открывшимися глазами было больше на 17ПС (2=4,44, p=0,035), 18ПС (2=7,89, p=0,005) и 19ПС (2=4,44, p=0,035). В группе «вальпроат однократный» межполовые различия отсутствовали. В группе «вальпроат многократный» количество самок с полностью открывшимися глазами было больше на 16ПС (2=7,01, p=0,008) и 17ПС (2=7,01, p=0,008).
Таким образом, однократное введение физраствора самцам в раннем постнатальном периоде на фоне депривации от матери не повлияло на скорость их прозревания, но привело к возрастанию их массы тела во вторую и третью неделю жизни по сравнению с самцами из групп «физраствор многократный» и «вальпроат однократный». Однократное введение физраствора не сказалось на массе тела самок, но привело к замедлению их прозревания относительно самок из интактной группы и из группы «физраствор многократный». Многократное введение физраствора не повлияло ни на массу, ни на открывание глаз у животных обоих полов относительно интактных животных. Однократное введение вальпроата не повлияло на массу и степень открывания глаз самцов, но привело к снижению значений этих показателей у самок по сравнению с самками из группы «вальпроат многократный». Многократное введение вальпроата не повлияло ни на их массу, ни на открывание глаз у животных обоих полов относительно интактных животных.
Анализ результатов теста достижения опоры перекладины не выявил межгрупповых статистически значимых достоверностей, за исключением того, что на 19ПС время достижения опоры перекладины у самцов в группе «вальпроат однократный» (69,3±58,3) было больше, чем в группе «вальпроат многократный» (19,8±35,6) (U=27,0; Z=2,0; p=0,048) (Рисунок 9). Межполовые различия отсутствовали. Таким образом, произведенные нами в раннем постнатальном периоде манипуляции не привели к значительному изменению координационно-моторных навыков у животных обоих полов по сравнению с интактными животными, за исключением самцов группы «вальпроат многократный», у которых на 19ПС наблюдалось их улучшение.
Исследование поведения взрослых самцов, подвергавшихся в раннем постнатальном периоде различным экспериментальным воздействиям
Наличие корреляционных связей в структуре, их устойчивость и вариабельность отражает степень ее интегрированности, структурированности, а также может характеризовать ее жесткость и лабильность. Количественное описание выявленных корреляционных связей в структуре поведения самок в домашней клетке представлено в Таблицах 3, 4, Приложении 9 и на Рисунке 25. Полученные числа положительных и отрицательных корреляций между показателями продолжительности актов и их частотами внутри и между категориями поведения («связанное с потомством» и «не связанное с потомством») мы приводили к числу анализируемых показателей в каждой группе (Таблица 3 и 4). Необходимость оценки приведенных значений была обусловлена различиями абсолютных значений анализируемых показателей внутри категорий в каждой из групп самок.
Анализ числа положительных корреляций между показателями поведенческих актов внутри категории «не связанное с потомством» показал, что у интактных самок оно было больше, чем в группах самок «физраствор однократный» (2=14,44, p=0,0001), «физраствор многократный» (2=12,98, p=0,0003) и «вальпроат однократный» (2=4,21, p=0,04) (Рисунок 25Б). В группе самок «депривация б/и» это число было больше, чем в группах самок «физраствор однократный» (2=7,94, p=0,005) и «физраствор многократный» (2=6,92, p=0,009) (Рисунок 25А). У самок группы «физраствор многократный» число положительных корреляций между показателями поведенческих актов внутри категории «не связанное с потомством» было больше, чем в группе самок и «вальпроат многократный» (2=3,92, p=0,048) (Рисунок 25Б).
Анализ числа положительных корреляций между показателями поведенческих актов между категориями «не связанное с потомством» и «связанное с потомством» показал, что у интактных самок этот показатель был ниже, чем в группах самок «физраствор однократный» (2=7,03, p=0,008), «физраствор многократный» (2=8,13, p=0,004), «вальпроат однократный» (2=4,61, p=0,032) и «вальпроат многократный» (2=4,61, p=0,032) (Рисунок 25В). Этот показатель у самок в группе «депривация б/и» был также ниже, чем в группах самок «физраствор однократный» (2=12,14, p=0,0005), «физраствор многократный» (2=10,14, p=0,001), «вальпроат однократный» (2=6,75, p=0,009) и «вальпроат многократный» (2=6,75, p=0,009) (Рисунок 25В).
Анализ числа отрицательных корреляций между показателями поведенческих актов внутри категории «связанное с потомством» с помощью непараметрического критерия 2 показал, что у самок в группе «депривация б/и» это число было меньше, чем в группах самок «физраствор однократный» (2=4,82, p=0,028) и «вальпроат однократный» (2=6,66, p=0,01).
Анализ числа отрицательных корреляций между показателями поведенческих актов внутри категории «не связанное с потомством» показал, что в группе самок «физраствор однократный» оно было больше, чем в группах самок «интактные» (2=9,83, p=0,002), «депривация б/и» (2=5,85, p=0,016) и «вальпроат однократный» (2=6,85, p=0,009).
Анализ числа отрицательных корреляций между показателями поведенческих актов между категориями «не связанное с потомством» и «связанное с потомством» показал, что в группе самок «депривация б/и» этот показатель был выше, чем в группах самок «интактные» (2=4,57, p=0,033) и «физраствор многократный» (2=5,40, p=0,02).
Таким образом, анализ числа корреляций между показателями поведенческих актов в различных группах выявил, что наиболее интегрированным поведением, связанным с потомством, характеризовались интактные самки и самки группы «депривация б/и». Инъекции в раннем онтогенезе привели к дезинтеграции поведения, направленного на потомство у выросших самок. Это выражалось в снижении числа положительных корреляций между его показателями. Кроме того, у всех самок с инъекциями в поведении в домашних клетках наблюдался рост числа положительных корреляций между показателями категорий «не связанное с потомством» и «связанное с потомством». Несмотря на то, что многократное введение вальпроата натрия, как было показано выше, приводило к восстановлению материнского фенотипа по показателям числа и продолжительности поведенческих актов, анализ корреляционных связей показывает, что такое восстановление не затронуло структуры материнского поведения. Фенотип этих самок характеризовался самым низким по сравнению с фенотипом самок остальных групп исследовательским поведением и высоким уровнем материнской заботы на фоне нарушения структурированности их поведения.
Интегрированное поведение (характеризующееся большим числом положительно коррелирующих показателей поведенческих актов) отражает взаимную согласованность поведенческих актов для реализации адаптивного поведения. Биологический смысл интегрированности виден на примере исследований синхронизации электрической активности зон коры головного мозга методом когерентного анализа: выявлено повышение когерентности электрической активности в альфа-, бета- и тета-диапазонах при решении когнитивных и моторных задач (Zhavoronkova L.A. et al., 2011).
Различия в латентных периодах переноса в гнездо интактными самками (F0) детенышей, подвергавшихся в раннем постнатальном периоде различным экспериментальным воздействиям (F1), отсутствовали, как и различия в латентных периодах переноса в гнездо самок и самцов мышат второго (F2) поколения. В Приложении 10 приведены данные по результатам теста переноса на 5-6ПС. Латентные периоды переноса самцов (U=15,0; Z= -1,95; p=0,051) и самок (U=10,0; Z= -2,31; p=0,021) первого поколения в группе «вальпроат однократный» были достоверно меньше, чем у животных в группе «вальпроат однократный» второго поколения. Других различий при сравнении латентных периодов переноса в гнездо детенышей двух поколений всех экспериментальных групп выявлено не было. В данном исследовании тест переноса мог отражать наиболее консервативное материнское поведение, уровень которого не зависел от экспериментальных процедур в онтогенезе животных
Влияние депривации от матери, сопровождающейся тактильной стимуляцией, в раннем постнатальном периоде на результаты раннего обонятельного обучения
Поскольку показано, что плотность окситоциновых и вазопрессиновых рецепторов в мозге самок мышей положительно коррелирует с уровнем их материнского ухода (Curley J.P. et al., 2012) и эти особенности имеют зависимый от раннего опыта, а именно от уровня материнского ухода и депривации от матери, характер (Francis D.D. et al., 2002; Veenema A.H. et al., 2007), можно предположить, что наблюдаемое в нашей работе снижение уровня материнского ухода после многократных инъекций физраствора в раннем онтогенезе могут быть обусловлены снижением плотности окситоциновых и вазопрессиновых рецепторов в мозге.
Многократное введение вальпроата натрия в нашем исследовании привело к компенсации снижения уровня материнского ухода и ацетилирования гистона H3 в мозге детенышей в результате депривации и инъекций физраствора до уровня, наблюдаемого у интактных животных. Поскольку известно, что, с одной стороны, взрослое потомство самок с высоким уровнем материнского ухода характеризуется повышенным уровнем ацетилирования в области промотора глюкокортикоидных рецепторов гиппокампа (Weaver I.C.G. et al., 2004), а, с другой, дочери самок с высоким уровнем материнского ухода также характеризуется высоким уровнем материнского ухода (Francis D.D. et al., 1999), то увеличение уровня материнского ухода в ответ на многократные инъекции вальпроата натрия в раннем онтогенезе соответствовало литературным данным.
В настоящее время отсутствуют литературные данные, объясняющие связь между полученными нами характеристиками фенотипа животных в раннем онтогенезе и во взрослом возрасте. В частности, отсутствуют данные о влиянии уровня материнского ухода на результативность раннего обонятельного обучения потомства. Исключение составляют результаты теста переноса, которые, как было показано ранее, соотносятся с результативностью раннего обучения (Александрова Е.А. с соавт., 2005). Однако в нашей работе такой закономерности выявлено не было. Ничего не известно и о влиянии уровня материнского вылизывания и груминга на уровень ацетилирования гистонов в мозге выросших самок потомства, поскольку долговременные эффекты в данной области были показаны до сих пор только на самцах.
Результаты обучения детенышей поколения F2 свидетельствовали о том, что экспериментальные воздействия, производившиеся в раннем постнатальном периоде с детенышами первого поколения (F1), оказывали отставленное действие на уровень раннего обучения детенышей следующих поколений. Однако долговременные модификации поведения, определяемые условиями выращивания потомства в раннем постнатальном периоде, могут быть также обусловлены эпигенетическими процессами гаметического наследования.
Воспроизводящиеся в поколениях потомков модификации экспрессии регуляторных генов и фенотипа животных могут быть обусловлены как внешними, так и внутренними факторами. В первом случае для воспроизведения фенотипа в ряду поколений требуется воздействие обуславливающего изменения фактора, как правило, на протяжении лишь критического периода в развитии. Например, перенос определенного стиля материнского поведения из поколения в поколение самок невозможен без воздействия на потомство каждого последующего поколении такого внешнего фактора, как соответствующий материнский уход (McGowan P.O. et al., 2008; Szyf M. et al., 2008). Во втором случае воспроизведение фенотипа из поколения в поколение не зависит от постоянного воздействия внешних факторов и обусловлено гаметическим эпигенетическим наследованием (Skinner M.K., Guerrero-Bosagna C., 2009).
Гаметическое наследование подразделяется на мультигенерационное и трансгенерационное. К первому относятся случаи, когда эпигенетический стимул одновременно действует на соматические и половые клетки нескольких поколений организмов. Это происходит в случае, когда при воздействии фактора среды на беременную самку оно затрагивает непосредственно ее организм F0, организм эмбриона F1, а также гаметы F2 этого эмбриона, а эффект на организм поколения F3 отсутствует. В случае же транс-генерационного гаметического наследования фенотип передается в отсутствие исходного воздействия, т.е. сохраняется в поколении F3 и далее (Skinner M.K., 2008).
Половая дифференцировка гамет в эмбриональном периоде является самым важным этапом в формировании эпигенома и дифференцировке клетки (Surani M.A., 2001). Этот период в развитии наиболее чувствителен к воздействиям внешней среды, затрагивающим эпигеном. В отличие от женских половых клеток, в которых задействован ряд эпигенетических механизмов, в мужских половых клетках в ходе сперматогенеза большинство гистонов заменены протаминами, что приводит к компактизации хроматина и подавлении экспрессии (Godmann M. et al., 2009). Таким образом, наибольшее значение в транс-генерационном переносе эпигенетического статуса по мужской линии имеют не гистоновые метки, а метилирование ДНК (Ideraabdullah F.Y. et al., 2008).
Следует отметить, что в основе транс-генерационной гаметической наследственности лежит вероятностный процесс реконструкции, а не точного копирования. Хотя эпигеном как мужских, так и женских гамет в ходе гаметогенеза стирается – у млекопитающих, например, удаляется большинство метильных групп с ДНК и гистоновых меток – однако, оно не является полным, причем при этом наблюдаются половые различия (Jablonka E., 2013). Часть меток метилированной ДНК и модифицированных гистонов сохраняется, что является достаточным для реконструкции паттернов эпигенетических меток у потомства и их транс-генерационного переноса (Margueron R., Reinberg D., 2010).
Примером эпигенетического воздействия, приводящего к трансгенерационному изменению фенотипа, может служить модель хронической депривация детенышей от самки (ежедневно в течение 3 ч с 1ПС по 14ПС), подвергаемой во время депривации воздействию стресса (либо иммобилизации в течение 20 мин, либо вынужденному плаванию в холодной воде в течение 5 мин) непредсказуемым и случайным для нее образом
