Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы 8
2.1. Различия в поведении мышей инбредных линий 129 Sv и C57BL/6.8
2.2. c-fos как молекулярный маркер для функционального картирования активности мозга при обучении 13
2.3. Формирование долговременной памяти в модели условно-рефлекторного замирания 19
2.4. Обоснование выбора структур мозга и их характеристика 21
2.4.1. Гиппокамп 23
2.4.2. Медиальная лимбическая (цингу лярная) кора 30
2.4.3. Моторная кора 35
3. Методика 39
3.1. Экспериментальные животные и условия содержания 39
3.2. Процедура обучения и тестирования 39
З.З .Иммуногистохимическое выявление нейронов, экспрессирующих c-fos 41
3.4. Количественный анализ экспрессии c-fos 43
3.5. Статистический анализ данных 46
4. Результаты 48
4.1. Поведение мышей во время сеанса обучения 48
4.2. Поведение мышей в тесте на обстановочные сигналы 50
4.3. Поведение мышей в тесте на звуковой сигнал 52
4.4. Топография экспрессии c-fos в моторной коре 55
4.5. Топография экспрессии c-fos в медиальной лимбической коре 62
4.6. Топография экспрессии c-fos в гиппокампе 69
5. Обсуждение 77
5 1 .Различия поведения мышей линий c57bl/6 и 129sv при обучении и тестировании в модели условно-рефлекторного замирания 77
5.2 .Различие поведения мышей групп обучения и активного
контроля , 79
5.З.Связь экспрессии с-fos с обучением и поведением 80
6. Выводы 85
8. Список литературы 87
- c-fos как молекулярный маркер для функционального картирования активности мозга при обучении
- Гиппокамп
- Топография экспрессии c-fos в моторной коре
- Топография экспрессии c-fos в медиальной лимбической коре
Введение к работе
Известно, что животные разных инбредных линий имеют различные способности к обучению, и поведение их в одних же задачах различается (Vadasz et al., 1992; Crawley, 1997; Montkowski et al., 1997; Contet et al., 2001; Brooks et al., 2004). Подтверждением тому, что генетические факторы играют в этих различиях большую роль, служат классические работы по селекции на способность и неспособность к определенным видам научения (Searle, 1949; Bignami, 1965). Однако нервный субстрат подобных генетических различий изучен недостаточно.
Существуют указания на то, что генетические различия проявляются, в частности, в том, что при решении одних и тех же задач у разных животных оказывается задействованным разное количество нейронов в одних и тех же структурах мозга (Ward et al., 1998). Исходя из этого, можно ожидать, что мыши инбредных линий, демонстрирующие значительные различия в обучении, например линий C57BL/6 и 129Sv, (Montkowski et al., 1997 Contet et al, 2001a; Contet et al., 2001b), будут различаться составом и числом нейронов, вовлекаемых в разных структурах мозга в процессы обучения.
Экспериментальная проверка этого предположения требует регистрации активности большого числа нейронов у генетически различных животных в одной и той же задаче обучения. Такую возможность предоставляет метод картирования активности нервных клеток по экспрессии в них индуцируемых транскрипционных факторов. Этот метод служит информативным приемом выявления нейрональных субстратов обучения и формирования памяти (Анохин, 1989; Dragunow, 1996; Анохин, 1997; Herdegen, Leah, 1998; Tischmeyer, Grimm, 1999; Kaczmarek L., 2002; Guzowski, 2001). В его основе лежит то, что белковые продукты ранних генов, синтезированные в ответ на действующие на нейрон при обучении экстраклеточные сигналы, запускают транскрипцию поздних генов-мишеней, приводящую к долговременным пластическим изменениям связей нейронов и формированию долговременной памяти (Анохин, 1997; Kaczmarek L., 2002; Guzowski, 2001).
Для сравнительного анализа нейронального обеспечения обучения у генетически различных животных требуется задача, в которой транскрипционную активность нейронов можно было бы оценить после однократного сеанса обучения, дающего выраженные и долговременные изменения поведения. Этим условиям удовлетворяет модель выработки у мышей и крыс условного рефлекса замирания (Bolles, Collier, 1976; Fanselow, 1980). В англоязычной литературе она получила название «cued and contextual fear conditioning» (Fanselow, 1980). Эта модель основана на способности животных ассоциировать электрокожное раздражение с обстановкой экспериментальной камеры, в которой они его получили, и звуковым сигналом, предшествовавшим удару током. В результате такого однократного обучения животные замирают при следующем помещении в данную обстановку или же при предъявлении звукового условного сигнала в иной обстановке (Fanselow, 1980; Radulovic, 1998; Sanders et аЦ 2003).
В настоящей работе экспрессия транскрипционного фактора c-Fos при выработке условнорефлекторного замирания у мышей линий C57BL/6 и 129Sv исследовалась в трех областях мозга: гиппокампе, медиальной лимбической и моторной коре.
Гиппокамп и медиальная лимбическая кора были выбраны как структуры мозга, принимающие непосредственное участие в обеспечении условно-рефлекторного замирания. Повреждение этих структур приводит к нарушению данного навыка (Kim et al., 1992; Young et al., 1994; Frysztak, Neafsey, 1994; Morgan, Le Doux, 1995; Maren et al., 1997; Anagnostaras et al, 1999; Kjelstrup et al., 2002; Sanders et al., 2003 ). Участие гиппокампа, в частности, было показано при обучении в модели «контекстуальное замирание», где обстановка экспериментальной камеры, в которой животные получили удар тока, является условным сигналом (Kim & Fanselow, 1992; Frankland et al, 1998).
Кроме того, медиальную лимбическую кору традиционно относят к структурам, регулирующим эмоциональное поведение и необходимых для обучения (MacLean, 1949; Vogt, 1992; Duncan et al., 1996; Joel et al., 1997). Известно, что эта область коры головного мозга обладает выраженной нейрогенетической (Bayer, 1990), морфологической (Zeng, 1991) и функциональной (Nauta, 1972; Vogt et al, 1992; Баклаваджян с соавт., 2000) гетерогенностью, однако роль ее различных отделов в процессах обучения остается предметом обсуждения (Divac et al., 1984; Frysztak, Neafsey, 1994; Vogt, 1992; Morgan, LeDoux, 1995). Поэтому в настоящей работе представлялось важным изучить вовлечение нейронов разных участков этой структуры в выработку изучаемого поведения.
Поскольку формирование пассивно-оборонительного поведения включает в себя изменения и в двигательной активности животных, можно ожидать, что при данном обучении могут происходить пластические изменения и в нейронах моторной коры. Пластичность моторной коры взрослых животных при обучении была недавно показана в серии экспериментов с изучением эффектов ингибиторов синтеза белка (Luft et al., 2004). Данная область коры организована соматотопически, и существование карты моторных представительств различных частей тела мыши в этой области (Проничев, 2000) потребовало анализа экспрессии c-Fos на всем ростро-каудальном протяжении этой структуры.
1.2 Цель и задачи исследования
Цель работы - изучить вовлечение нейронов коры головного мозга и гиппокампа у мышей инбредных линий C57BL/6 и 129Sv в процессы обучения в задаче условно-рефлекторного замирания.
Для достижения обозначенной цели предполагалось решить следующие задачи:
1. . Исследовать различия поведения мышей линий С57В1/6 и 129Sv при обучении в модели условно-рефлекторного замирания.
2. Сравнить у мышей двух данных линий число и топографию распределения нейронов, экспрессирующих c-Fos в медиальной лимбической коре, моторной коре и в гиппокампе после обучения.
3. Сопоставить различия экспрессии c-Fos в мозге мышей С57В1/6 и 129Sv с отличиями в их поведении при выработке и воспроизведении условно-рефлекторного замирания.
c-fos как молекулярный маркер для функционального картирования активности мозга при обучении
Семейство "немедленных ранних генов" (immediate early genes) или "ранних генов" (РГ) эукариот достаточно обширно. Внутри него выделяют гены, кодирующие два функциональных класса белков: класс регуляторних транскрипционных факторов, которые могут влиять на клеточные функции, регулируя активность других генов, и класс «эффекторных» белков, которые могут прямо модулировать различные клеточные функции. Регуляторные транскрипционные факторы кодируются такими РГ как c-fos и zif268. К классу «эффекторных» ранних генов относится, например, ЛгсЗ (Guzowski, 2001). Установлено, что из 30-40 генов, образующих общий нейрон альный ответ ранних генов на экстраклеточные стимулы, 10-15 кодируют регуляторные транскрипционные факторы, а остальные - ранние эффекторные белки. (Guzowski, 2001).
Ген c-fos является наиболее хорошо изученным представителем семейства ранних генов (Kaczmarek, 2002, Анохин, 2003). Его активация происходит при воздействии экстраклеточных сигналов (гормонов, нейромедиаторов, факторов роста) на мембранные рецепторы, с последующим вовлечением вторичных мессенжеров и протеинкиназ, которые фософорилирую конститутивные транскрипционные факторы (такие, как белок CREB). Последние проникают в ядро клетки и воздействуют на промоторы ранних генов. Промоторные последовательности, контролирующие экспрессию гена c-fos, установлены: две наиболее известные из них это CRE (Са2+ /cAMP responsive element) и SRE (serum responsive element) (Kaczmarek, 2002). От поступления сигнала на мембрану клетки до появления мРНК c-fos проходит лишь несколько минут.
Затем в цитоплазме происходит синтез белка c-Fos, который быстро транспортируется в ядро клетки. По данным, полученным в исследованиях на культуре клеток, время «жизни» продуктов c-fos очень мало: 2-кратное снижения исходного уровня c-fos mRNA происходит менее чем за 20 минут, а белка - менее чем за 2 часа (Vosatka et al., 1989; Greenberg et al., 1990; Werlenetal., 1993).
В настоящее время также известно многое из того, что происходит в клетке после появления в ней продукта гена c-fos - транскрипционного фактора c-Fos. Для инициации или подавления транскрипции генов-мишеней c-Fos должен образовать димер с одним из Jun-белков (c-Jun, JunB или JunD). Исследования на культуре клеток кожи показали, что сформированный димерный транскрипционный фактор АР-1, в зависимости от состава, оказывает различное влияние на связывание ДНК и экспрессию генов-мишеней. Функциональное значение этого феномена в мозге не ясно (Szabowski, 2000). Однако, известно, что димер с-Fos/AP-l может взаимодействовать с другими транскрипционными факторами (NFAT, ETS, ZIF268 и др.) и это модифицирует активность АР-1 (Kaczmarek, 2002).
Таким образом, транскрипционные факторы, кодируемые ранними генами, контролируя транскрипцию других генов, инициируют синтез разнообразных специфических белков. Эта «вторая волна» белкового синтеза начинается через несколько часов после первоначального воздействия, вызвавшего экспрессию РГ, и приводит к долговременным пластическим изменениям на уровне отдельных нейронов. Этот каскад молекулярных событий обеспечивает способность нервных клеток к перестройке своих синаптических контактов при обучении и приобретении специализации относительно вновь формирующихся функциональных систем (Анохин, 1996, 1997).
Систематические исследования экспрессии гена c-fos в мозге обучающихся животных ведутся, начиная с конца 80-х годов (см. обзоры: Анохин, 1997; Herdegen, 1998; Kaczmarek, 2002), Установлено, что в большинстве областей мозга взрослых животных, находящихся в знакомой для них обстановке, транскрипция ранних генов находится на низком уровне. Быстрая активация транскрипции ранних генов происходит в нервных, но не глиальных клетках при попадании животного в ситуацию обучения, при потере результативности ранее выработанных действий животного, а также при новых, неожиданных воздействиях среды или исчезновении привычных и ожидаемых событий (Анохин и Судаков, 1993; Анохин, 2003). При завершении выработки и автоматизации навыка, экспрессия ранних генов угасает (Анохин, 1997).
Критическими, для доказательства роли экспрессии гена c-fos в процессе консолидации долговременной памяти, стали эксперименты с антиСмысловыми олигонуклеотидами, которые подавляют синтез белка с-Fos, специфически связываясь с мРНК c-fos (Mileusnic, Anokhin, Rose, 1996; Lamprecht, Dudai, 1996). В этих работах в различных моделях обучения и на разных видах животных было показано, что подавление трансляции мРНК с-fos приводит к нарушению долговременной памяти, но не влияет на сам процесс обучения или кратковременную память.
Гиппокамп
Начало исследованиям роли гиппокампа в механизмах память было положено открытием, что двустороннее повреждение гиппокампа у человека привело к поражению эпизодической и декларативной памяти (Scoville, Milner, 1957). В 70-е годы XX века для выяснения роли различных мозговых структур широко использовалась методика прямой стимуляции мозга электрическим током. Применение этой методики во время диагностических и лечебных операций у человека позволяло сопоставлять эффект стимуляции с речевым отчетом пациента. Однако, если при раздражении миндалины, отделов гипоталамуса или структур среднего мозга пациент мог точно охарактеризовать переживаемую им эмоцию (страх, тревогу, ярость, гнев, наслаждение), то при стимуляции гиппокампа не возникало какого-либо отчетливо окрашенного эмоционального состояния: были зарегистрированы только спутанность сознания, временная потеря контакта с врачом и (иногда) страх, как вторичная реакция на расстройство восприятия окружающего мира (Смирнов, 1976). По мнению Симонова, при выработке условных рефлексов и при организации целенаправленного поведения прогнозирование вероятности удовлетворения потребности (вероятности подкрепления) осуществляется преимущественно с участием гиппокампа (а также передних отделов новой коры) (Симонов, 1987). Наиболее ярким дефектом гипокампэктомированных животных оказалась их чувствительность к ситуациям с низкой вероятностью подкрепления условных сигналов (Kimble, Kimble., 1970; Jarrard, Becker, 1977). Выпадение реакций на сигналы с низкой вероятностью подкрепления ведет к тому, что гпппокампэктомированные крысы превосходят контрольных в различении сигналов с разной вероятностью их подкрепления (Means, Douglas, 1970; Stevens, Cowey, 1973), частным случаем чего является облегчение у этих животных условно-рефлекторного переключения (Пигарева, 1983).
Будучи структурой, где мотивационное возбуждение от заднего и переднелатерального гипоталамуса сопоставляется с информацией, поступающей из внешней среды (через перегородку) и со следами ранее накопленного опыта (из коры), гиппокамп; по-видимому, осуществляет двойную функцию. С одной стороны, он играет роль входного фильтра информации, подлежащей или не подлежащей регистрации в долговременной памяти (Виноградова, 1975). С другой стороны, гиппокамп участвует в извлечении следов из памяти под влиянием мотивационного возбуждения для использования этих следов в организации текущего поведения (Hirsh, 1974).
Как уже было сказано, для электрической активности гиппокампа характерен тета-ритм (Adey et al., 1961). По заключения Симонова, все ситуации, в которых наблюдается усиление тета-ритма (ориентировочный рефлекс, поисковое поведение, организация сложных неавтоматизированных движений, появление признаков эмоционального напряжения и т.п.), обладают одной общей для них чертой: перечисленные случаи требуют активной мобилизации ранее выработанных условных связей, извлечения хранящихся в памяти энграмм для сопоставления с поступающими извне сигналами или для пересмотра, рекомбинации следов памяти в целях построения новых приспособительных действий, в порождении гипотез (Симонов, 1987).
Однако наиболее широко исследуется роль гиппокампа в пространственном научении. O Keef и Nadel доказали, что гиппокамп необходим для формирования когнитивной карты (O Keef and Nadel, 1978). Эти авторы заметили, что хотя ранние исследования гиппокампэктомированных крыс приводили к заключению о большей исследовательской активности животных, было показано, что такие животные также менее реактивны на новые стимулы, чем контрольные животные. Таким образом стало ясно, что эффект повреждения не заставляет животных исследовать больше, но делает их гиперактивными. А значит, хотя, перемещаясь, животное собирает информацию о новой среде и контакт животного с новой средой постепенно снижает активность, допущение, что уровень моторной активности обеспечивает точное измерение исследовательской тенденции следует отклонить (O Keef and Nadel, 1978).
У мышей с повреждением гиппокампа, так же как и у крыс в аналогичных задачах, наблюдается поражение пространственной когнитивной функции, хотя основные сенсомоторные способности не затронуты (Contet, Rawlins, Deacon, 2001b). Цитотоксическое разрушение гиппокампа у мышей вызывало ухудшение пространственной рабочей памяти (в задаче спонтанного и подкрепляемого выбора), пространственной референтной памяти (водный лабиринт Морриса, «мелкий» водный лабиринт, приподнятый Y-лабиринт) (Deacon, Bannerman, Kirby, Croucher, Rawlins, 2002). He было обнаружено влияния на обучение в лабиринте Лешли, которое не требует пространственных ориентиров (Deacon, Bannerman et al., 2002). Кроме того, были обнаружены изменения в видоспецифическом поведении: мыши переставали запасать и прятать в подстилке домашней клетки корм, находящийся снаружи на решетке клетки, хуже строили гнездо, меньше, чем контрольные мыши, исследовали края домашней клетки, если крышку открывали. Мыши с повреждением гиппокампа проявляли гиперактивность, либо не отличались от контрольных в тестах на локомоторную активность, однако в открытом и норковом полях показали сниженную по сравнению с контрольными мышами исследовательскую активность (Deacon, Croucher, Rawlins, 2002). В тестах, позволяющих оценить как исследовательскую активности, так и тревожность животных, было обнаружено, что мыши с повреждением гиппокампа с большей латенцией, чем контрольные мыши покидали начальные отсеки черно-белой аллеи и крестообразного лабиринта, приступали к новой еде (Bannerman, Deacon, Feldon, Rowling, 2003). Эта медлительность могла бы быть связанной с повышенной эмоциональностью, однако большее, чем у контрольных мышей время, проведенное в более открытых и освещенных отсеках установок (Bannerman, Deacon, Feldon, Rowling, 2003), говорило об обратном. Таким образом, в данной работе повреждение гиппокампа, хотя и не приводило однозначно к обычному у крыс и описанному в других работах снижению тревожности, однако значительно изменяло поведение мышей, снижая исследовательскую активность и замедляя инициацию необходимых поведенческих актов в новой обстановке (Deacon et al., 2002). Эти нарушения можно объяснить, используя теорию когнитивных карт (O Keef and Nadel, 1978). Если способность к пространственной ориентации в новой обстановке снижена в результате повреждения гиппокампа, животные при помещении в экспериментальную установку медленнее находят выходы или примыкающие отсеки, и привыкание к новой обстановке также будет замедлено. Таким образом, этот «пространственный дефицит» усложняет доказательство снижения эмоциональности после повреждения гиппокампа. С другой стороны, все описанные эффекты, вызванные повреждением гиппокампа, можно объяснить одной причиной - ослаблением способности к спонтанному целенаправленному поведению (Deacon et al., 2002). Внутренняя логика этого последнего утверждения смыкается с изложенным выше представлением Симонова (1987) о роли гиппокампа в поведении.
Топография экспрессии c-fos в моторной коре
Исследование топографии экспрессии c-Fos в первичной и вторичной моторной коре (Ml и М2) проводили у мышей пяти экспериментальных групп, на 15 координатных уровнях от АР+2.46 до AP-I.82 (рис.5 и 6). Количественный состав экспериментальных групп представлен на рис.1. Количественный анализ экспрессии c-Fos в структурах мозга проводился у части животных из групп обучения и активного контроля. Группа обучения мышей линии С57В1/6 (ОБ С57В1/6) состояла из 6 животных. Группа обучения мышей линии 129Sv (ОБ 129Sv) состояла из 7 животных. Группа активного контроля мышей линии С57В1/6 (АК С57В1/6) состояла из 5 животных. Группа активного контроля мышей линии 129Sv (АК 129Sv) состояла из 5 животных. Группа пассивного контроля (5 животных) была смешанной по составу (3 мышей линии С57В1/6 и 2 мыши линии 129Sv), поскольку у всех 5 животных, взятых их домашних клеток, уровень экспрессии c-Fos был низким (экспрессировали c-Fos лишь единичные нейроны исследованных структур) - см. рис.8, 11, 15 и 16.
Анализ выявил неравномерности распределений Fos-позитивных клеток вдоль ростро-каудальной оси мозга в первичной и вторичной моторной коре как в группах обучения, так и активного контроля у обеих линий (р 0.001). Отрицательное значение коэффициента корреляции г между расположением срезов (расстояние от брегмы) и количеством c-Fos-позитивных нейронов указывает на достоверное градиентное увеличение уровня экспрессии в ростро-каудальном направлении в группах как активного контроля, так и обучения (см. рис.6 и рис.7, табл.1 и 2).
Как в Ml, так и в М2 в группе пассивного контроля уровень экспрессии c-Fos был равномерно низким, и распределение плотности c-Fos репрессирующих нейронов вдоль ростро-каудальной оси мозга мышей группы пассивного контроля достоверно отличалось от групп обучения и активного контроля у обеих линий. Сравнение распределений экспрессии в мозге мышей из групп обучения и активного контроля выявило достоверные отличия в как в Ml так и в М2 у обеих линий. Не обнаружено достоверных межлинейных различий в распределениях экспрессии внутри обоих регионов моторной коры (рис.6 и рис.7).
При сравнении экспрессии c-Fos на каждом координатном уровне не обнаружено никаких межгрупповых различий (р 0.05) в ростральных частях первичной моторной коры с АР +2.46 до АР +1.54 (рис.6, рис.8). Например на координатном уровне АР +2.22 плотность экспрессии c-Fos (число c-Fos экспрессирующих нейронов в 0.1 мм ) в каждой из групп мышей была следующей: ПК - 2.47+0.53; АК 129Sv - 4.99±1.32; АК C57BL/6 - 5.77+1.37; ОБ 129Sv - 4.0710.86; ОБ C57BL/6 - 7.95+2.06.
При сравнении групп обучения с пассивным контролем был обнаружен более высокий уровень экспрессии (р 0.05) у обеих линий в Ml с АР +1.18 по АР -1.82. В группах активного контроля по сравнению с пассивным контролем более высокий уровень экспрессии наблюдался в отдельных координатных точках медиальной и каудальной части МІ у обеих линий (рис. 6). Большее количество Fos-позитивных клеток в группе обучения по сравнению с группой активного контроля в Ml обнаружено: у 129Sv - в точках с АР координатами +1.18, -0.22 и -1.82; у C57BL/6 только в АР -1.82 (рис.6 и табл.1). В медиальной части Ml на координатном уровне АР +0.02 плотность экспрессии c-Fos в каждой из групп мышей была следующей: ПК - 1.19±0.38; АК 129Sv -10.35+1.22; АК C57BL/6 - 15.36±2.50; ОБ 129Sv - 22.83±3.87; ОБ C57BL/6 -18.74+2.23. В каудальной части МІ на координатном уровне АР -1.82 плотность экспрессии c-Fos в каждой из групп мышей составляла: ПК -1.69+0.85; АК 129Sv - 15.32±3.42; АК C57BL/6 - 22.13±3.55; ОБ 129Sv -32,93±2,75; ОБ C57BL/6 - 35.70±2.93.
Такое же возрастание экспрессии относительно группы пассивного контроля наблюдалось и в М2 у С57В1/6: для группы обучения — каудальнее АР +1.94, а для группы активного контроля - каудальнее АР +1.54 (рис. 7). У мышей линии 129Sv в группе обучения по сравнении с пассивным контролем наблюдался более высокий уровень экспрессии Fos на всем протяжении М2, а в группе активного контроля - только в каудальной ее части. Большее количество Fos-позитивных клеток в группе обучения по сравнению с группой активного контроля в М2 обнаружено только у 129Sv - в медиальной части, в точках с АР координатами от +7. 78 по -0.22 (рис.7, табл.2).
Межлинейные различия в уровне экспрессии c-Fos во вторичной моторной коре выявлены только в группе обучения: в координатной точке АР -0.22 у мышей 129Sv наблюдалось большая плотность c-Fos-экспрессирующих нейронов, чем у С57В1/6 (ОБ 129Sv - 37.41+2.26, ОБ C57BL/6 - 26.96±2.26, р 0.05). Средние значения плотности c-Fos экспрессирующих нейронов в ростральной части М2 на координатном уровне АР +2.22 в каждой из групп мышей были следующими: ПК - 2.43±0.47; АК 129Sv - 8.25+2.20; АК C57BL/6 - 12.44+3.13; ОБ 129Sv - 14.58±2.13; ОБ C57BL/6 - 13.39+4.08. В медиальной части М2 на координатном уровне АР +0.02 плотность экспрессии c-Fos в каждой из групп мышей составляла: ПК - 3.29+0.11; АК 129Sv - 14.02+2.52; АК C57BL/6 - 21.53+2.24; ОБ 129Sv - 36.0914.82; ОБ C57BL/6 - 31.06+2.44. В каудальной части М2 на координатном уровне АР -1.82 плотность экспрессии c-Fos в каждой из групп мышей составляла: ПК - 1.69+0.85; АК 129Sv 15.32+3.42; АК C57BL/6 - 22.13+3.55; ОБ 129Sv - 32.93+2.75; ОБ C57BL/6 35.70+2.93. Представленные данные свидетельствуют о том, что нейроны ростральной части моторной коры вовлекаются в процессы обучения в данной задаче в меньшей степени, чем нейроны каудальных отделов моторной коры. Картирование коры мозга белой мыши по моторным ответам обнаруживает двигательные представительства лицевой мускулатуры и вибрисс в ростральной части моторной коры (приблизительно с АР +3.0 по АР +7.0), а представительство передних и задних лап лежит каудальнее {АР +1.0 - АР -1.0 - передние конечности, АР -0.5 - АР -3.0 - задние) (Проничев, 2000). По нашим данным, именно с уровня +1J8 мм от брегмы наблюдался достоверно более высокий уровень экспрессии c-Fos в группе обучения. Таким образом, градиентное ростро-каудальное увеличение уровня экспрессии c-Fos в моторной коре может отражать соматотопически организованное вовлечение этой структуры в механизмы обучения в данной задаче.
Топография экспрессии c-fos в медиальной лимбической коре
Исследование топографии экспрессии c-Fos в медиальной лимбической коре мышей пяти экспериментальных групп был проведен по данным об уровне экспрессии в 21 координатной точке (от АР +2.46 до ЛР-2.92). Данные о распределении плотностей экспрессии c-Fos в дорзомедиальной лимбической коре представлены на рис.9 и в вентромедиальной лимбической коре-на рис. 10.
В дорзальной части медиальной лимбической коры (ДМЛк), включающей область 1 цингулярной коры (Cgl) и ретросплениальную агранулярную кору (RSA), неравномерность экспрессии была выявлена только в одной группе - активного контроля 129Sv (F(20,65)=3.07, р 0,001). В вентромедиальной лимбической коре (ВМЛк), включающей прелимбическую кору (PrL), область 2 цингулярной коры (Cg2) и ретросплениальную гранулярную кору (RSG), неравномерность экспрессии наблюдалась как у животных из группы активного контроля так и обучения.
В ДМЛк корреляция между расположением срезов (расстояние от брегмы) и количеством c-Fos-позитивных нейронов достоверна только в группах активного контроля обеих линий: для AK-129Sv г=-0.22, р 0.04, для АК-С57В1/6 г=-0.24, рО.ОЗ. Отрицательное значение коэффициента корреляции указывает на усиление экспрессии c-Fos от ростральной к средней части ДМЛк. (рис.9).
Корреляция между координатой срезов и количеством c-Fos-позитивных нейронов в ВМЛк достоверна и коэффициент корреляции имеет положительное значение у 129Sv только в группе обучения (r=0.26} р 0.002), а у С57В1/6 в обеих экспериментальных группах. Это указывает на наличие областей со снижением экспрессии c-Fos: от средней к каудальной части ВМЛк (рис.10).
И в дорзальной, и в вентральной медиальной лимбической коре мышей из группы пассивного контроля уровень экспрессии c-Fos был равномерно низким, и распределение c-Fos экспрессии вдоль ростро-каудальной оси мозга в группе пассивного контроля достоверно отличалось от групп обучения и активного контроля у обеих линий (рис.9, 10). Сравнение распределений экспрессии в мозге мышей из групп обучения и активного контроля выявило достоверные отличия только в ДМЛк у 129Sv: 129Sv ГО vs. АК - F(l,8) = 7.8,/Ї 0,02 (рис.9, табл.3).
При попарном внутрикоординатном сравнении - как в дорсальной, так и в вентральной областях медиальной лимбической коры уровень экспрессии с-Fos в группе обучения был выше, чем в группе пассивного контроля в большинстве координатных точек. В дорзомедиальной лимбической коре максимальные значения плотности экспрессии c-Fos в мозге мышей из групп обучения наблюдались на координатном уровне АР+0,02; ОБ 129Sv -28.76±4,41; ОБ C57BL/6 - 23.66±2.14. В вентромедиальной лимбической коре максимальные значения плотности экспрессии c-Fos в мозге мышей из групп обучения наблюдались на координатном уровне АР+1.54: ОБ 129Sv -19.42+2.89; ОБ C57BL/6 - 21.15+3.24.
В группе активного контроля по сравнению с группой пассивного контроля в уровень экспрессии c-Fos был выше в средней части обеих структур, причем у с57В1/6 достоверные отличия наблюдались в большем числе координатных точек.
Достоверно более высокая плотность c-Fos-позитивных нейронов в группе обучения по сравнению с группой активного контроля в ДМЛк обнаружилась лишь у 129Sv в медиальной части Cgl (в точках с координатами +1.94, +L78 и +L54) и в каудальной RSA в координатной точке -2.70, (рис.9, табл.3). В вентромедиальной лимбической коре экспрессия c-Fos была выше в группе обучения по сравнению с активным контролем у 129Sv: в RSG регионе в координатных точках -1.46, -2.06 и -2.70, и в прелимбической коре (PrL) на АР+1.54 с тенденцией к достоверному отличию (129Sv: ОБ vs. АК -19.42+2.89 и 8.77+1.56, р=0.05); у 57В1/6 - только в RSG регионе в точке -1.82 (Рис. 10, табл.4). Межлинейные различия в экспрессии c-Fos в медиальной лимбической коре наблюдались лишь в виде тенденции: у обученных мышей I29Sv наблюдалось несколько большее количество c-Fos-позитивных нейронов в каудальной RSA области, чем у С57В1/6 ( рис9, табл.4, координатный уровень АР-2.92: OE-129SWS. ОБ-С57В1/6 - 23.61+3.58 и 12.60+1.71, р= 0.08).
