Содержание к диссертации
Введение
Введение 6
Актуальность исследования 6
Цель и задачи исследования 8
Научная новизна работы 8
Научно-практическое значение работы 9
Положения, выносимые на защиту 9
Обзор литературы 11
Введение 11
Консолидация – экспериментальный феномен. Данные, послужившие основой для формирования представления о консолидации 13
Консолидация памяти с точки зрения разных уровней протекания данного процесса в мозге 15
Феномен восстановления нарушенной памяти 22
Экспериментальные свидетельства возможности восстановления памяти. Разнообразие ситуаций, в которых наблюдается этот феномен. Возможные мишени амнестических агентов, применяемых во время обучения 22
Условнорефлекторное замирание как модель формирования аверсивной
эмоциональной памяти: описание модели, нейроанатомические и
нейрохимические основы приобретенного условнорефлекторного страха 27
Описание модели 27
Нейроанатомический субстрат условнорефлекторного замирания 28
Материалы и методы 43
Животные 43
Экспериментальные камеры и условия 43
Поведенческие процедуры 43
Вещества, дозировки и способ введения 44
Экспериментальные группы 44
Иммуногистохимическая детекция белка c-Fos 45
Количественный анализ экспрессии c-Fos 46
Статистический анализ 47
Результаты 48
Поведение животных во время обучения условнорефлекторному замиранию48
Поведение животных во время процедуры напоминания 51
Поведение животных во время тестирования памяти на звуковой УС 51
Градуальное восстановление нарушенной памяти после напоминания 54
Количественный анализ экспрессии транскрипционного фактора c-Fos в мозге после напоминания 55
Количественный анализ экспрессии c-Fos в гиппокампе после напоминания 56
Количественный анализ экспрессии c-Fos в миндалине после напоминания 59
Количественный анализ экспрессии c-Fos в префронтальной коре после напоминания 62
Поведение животных во время тестирования памяти на звуковой УС 65
Количественный анализ экспрессии транскрипционного фактора c-Fos в мозге после тестирования памяти на звуковой УС 67
Количественный анализ экспрессии c-Fos в гиппокампе после тестирования памяти на звуковой УС 67
Количественный анализ экспрессии c-Fos в миндалине после тестирования памяти на звуковой УС 69
Количественный анализ экспрессии c-Fos в слуховой коре после тестирования памяти на звуковой УС 73
Обсуждение 74
Поведение животных во время обучения и тестирования памяти на звуковой УС 74
Топография экспрессии транскрипционного фактора c-Fos в мозге после напоминания 77
Топография экспрессии c-Fos в гиппокампе после напоминания 78
Топография экспрессии c-Fos в миндалине после напоминания 80
Топография экспрессии c-Fos в префронтальной коре после напоминания 80
Топография экспрессии c-Fos в передней цингулярной коре после напоминания 82
Топография экспрессии c-Fos в мозге при восстановлении памяти 82
Топография экспрессии c-Fos в мозге после тестирования памяти на звуковой УС 84
Топография экспрессии c-Fos в гиппокампе после тестирования памяти на звуковой УС 84
Топография экспрессии c-Fos в миндалине после тестирования памяти на звуковой УС 85
Топография экспрессии c-Fos в слуховой коре после тестирования памяти на звуковой УС 87
Возможные побочные эффекты действия ингибитора синтеза белка 88
Заключение 91
Выводы 93
Литература
- Научно-практическое значение работы
- Консолидация памяти с точки зрения разных уровней протекания данного процесса в мозге
- Вещества, дозировки и способ введения
- Градуальное восстановление нарушенной памяти после напоминания
Введение к работе
Актуальность проблемы
Память является одной из основных функций мозга, которая обеспечивает адаптивное поведение организмов в условиях изменяющейся окружающей среды. Вызванные обучением изменения поведения организма, работы областей мозга, активности клеточных ансамблей и отдельных нейронов, а также лежащие в основе этого молекулярно-биологические процессы в совокупности составляют одну из ключевых проблем современной нейробиологии (Dudai, 2012; Gallistel and Matzel, 2013).
Известно, что в первые минуты и часы после обучения память переходит из кратковременной, лабильной формы в долговременную, стабильную (Agranoff et al., 1965; McGaugh, 1966; Анохин, 1997; Medina et al., 2008), то есть фиксируется, консолидирует, постепенно приобретая устойчивость к действию амнестичных агентов (McGaugh, 2000). Многие клеточные и молекулярные процессы, сопровождающие консолидацию памяти, описаны в литературе (Goelet et al., 1986; McGaugh, 2000; Abel and Lattal, 2001; Kandel, 2001) и послужили основой для создания схемы каскада событий, приводящих к формированию долговременной памяти.
Использование специфических интерферирующих воздействий в экспериментах на животных приводило к развитию амнезии, которую в большинстве случаев считали необратимой (Sara and Hars, 2006, Flexner et al.,1963; Gibbs, Ng, 1977; Davis, Squire, 1984; Bourtchouladze et al., 1994, 1998); это позволило продемонстрировать критическую значимость отдельных этапов каскада молекулярных событий для консолидации памяти.
Однако с конца 60-х годов XX века начали накапливаться данные, свидетельствовавшие о том, что память, нарушенная во время консолидации, тем не менее, может быть восстановлена (Sara and Hars, 2006). В качестве интерферирующих воздействий в этих экспериментах использовали введение антибиотиков-ингибиторов синтеза белка (Quartermain et al., 1970, Randt et al., 1972; Squire and Barondes, 1972). При этом наблюдали спонтанное восстановление нарушенной памяти (Quartermain et al., 1970; Squire and Barondes, 1972) или восстановление, связанное с использованием процедуры «напоминания», которая заключалась в предъявлении животному перед тестом на долговременную память одного из компонентов ситуации обучения: условного или безусловного сигнала (Miller and Springer, 1972; Quartermain et al., 1972; Radyushkin and Anokhin, 1999). Однако с тех пор молекулярные и клеточные процессы, лежащие в основе восстановления нарушенной памяти оставались неизученными.
В настоящей работе мы сочли необходимым вернуться к исследованию возможности восстановления памяти, нарушенной введением ингибиторов синтеза белка
при обучении, а также исследовать один из ключевых этапов каскада молекулярных
событий, сопровождающих обучение и извлечение ранее приобретенного опыта, –
активацию генома нейронов, вызванную восстановлением нарушенной памяти. В качестве
экспериментальной модели нами было выбрано однократное обучение
условнорефлекторному замиранию у мышей (Fanselow, 1980, Payor et al., 1994, Stiedl and Spess, 1997). Функциональное картирование мозга по экспрессии c-Fos было выбрано в качестве подхода для локализации клеточных ансамблей, претерпевающих пластические перестройки под действием напоминания и при тестировании памяти на условный сигнал амнестичных животных и животных с нормальной памятью. Известно, что экспрессия c-Fos в нейронах сопровождает ситуации новизны, обучения и извлечения приобретенного опыта, требующие пластичности синаптических связей (Guzowski, 2002, 2005; Flavell and Greenberg, 2008).
Цель и задачи исследования
Перед работой была поставлена цель: исследовать возможность и особенности процесса восстановления памяти, нарушенной блокадой синтеза белка при обучении мышей в модели условнорефлекторного замирания, а также различия в активности областей мозга амнестичных животных по сравнению с необученными животными и животными с нормальной памятью.
Для достижения поставленной цели мы решали следующие конкретные задачи:
-
исследовать возможность восстановления памяти, нарушенной у мышей введением ингибитора синтеза белка циклогексимидом, в модели условнорефлекторного замирания;
-
изучить временную динамику процесса восстановления памяти, нарушенной введением циклогексимида;
-
провести сравнительный анализ активности мозга по экспрессии c-Fos при напоминании у животных с восстановленной, нарушенной и нормальной памятью;
-
провести сравнительный анализ активности мозга по экспрессии c-Fos при предъявлении условного сигнала животным с нормальной или нарушенной, но восстановленной памятью.
Научная новизна работы
В работе впервые разработана модель восстановления памяти напоминанием в модели условнорефлекторного замирания у мышей. Впервые выяснено, что память, нарушенная введением ингибитора синтеза белка циклогексимида, может быть восстановлена кратковременной процедурой поведенческого напоминания. Впервые описана временная динамика данного процесса. Впервые показано, что восстановление
напоминанием нарушенной памяти у млекопитающих является медленным градуальным процессом и начинается не ранее, чем через 6 часов после напоминания.
В работе впервые исследована экспрессия транскрипционного фактора c-Fos в мозге животных после напоминания и тестирования. Установлено, что процедура напоминания вызывала различную активацию полей гиппокампа, цингулярной и прелимбической коры, которая зависела от степени целостности памятного следа у животных разных экспериментальных групп. При этом впервые установлено, что экспрессия c-Fos в зубчатой фасции и поле СА1 гиппокампа предшествует восстановлению нарушенной памяти, а в поле СА3 и прелимбической коре наблюдается при реактивации нормально сформированной памяти, причем таких изменений не наблюдали в мозге амнестичных животных.
Научно-практическое значение работы
Полученные в настоящей работе данные указывают на возможность
восстановления доступа к памяти, нарушенной во время консолидации, с помощью
предъявления напоминающих стимулов через достаточно длительное (до 24 часов) время
после нанесения повреждающего память воздействия. Сходства свойств и динамики этого
процесса восстановления у млекопитающих с данными, ранее полученными на птицах,
позволяет предполагать, что память, считающаяся нарушенной и безвозвратно
потерянной, потенциально может быть восстановлена и у человека. При этом ключевым
вопросом становится подбор адекватных воздействий, способных реактивировать
диссоциированный след памяти или же замедлить его диссоциацию при
нейродегенеративных заболеваниях у человека.
Выявленные в настоящей работе различия в активации областей мозга животных с восстановленной памятью по сравнению с амнестичными животными и животными с нормальной памятью указывают на нейроанатомические субстраты и специфические нервные механизмы, лежащие в основе восстановления нарушенной памяти, и могут послужить основой для поиска фармакологических и других воздействий, направленных на компенсацию нарушений памяти у человека.
Положения, выносимые на защиту
1. Память, нарушенная у мышей введением ингибитора синтеза белка при
обучении, может быть восстановлена процедурой поведенческого напоминания через 24 ч
после обучения. Восстановление памяти не связано с повторным обучением животных, а,
вероятно, является следствием реинтеграции диссоциированных элементов
индивидуального опыта.
-
Восстановление памяти после напоминания развивается постепенно. Первый эффект наблюдается через 6 ч после напоминания, через 24 ч память восстанавливается до уровня нормальных животных.
-
Экспрессия c-Fos в мозге после напоминания отражает процессы восстановления нарушенной и извлечения нормальной памяти. Нейроанатомические субстраты этих явлений различны. Повышение плотности c-Fos-позитивных клеток в зубчатой фасции и поле СА1 гиппокампа происходит в мозге амнестичных животных после напоминания и предшествует восстановлению нарушенной памяти. Повышенная экспрессия c-Fos в поле СА3 гиппокампа и прелимбической коре сопровождает реактивацию нормальной памяти.
Апробация диссертации
Материалы диссертационной работы доложены на итоговой конференции НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН (Москва, 2010 г.), 7th FENS Forum of European Neuroscience (Amsterdam, The Netherlands, 2010), 1ой Международной междисциплинарной конференции “Современные проблемы системной регуляции физиологических функций” (Сафага, Египет, 2010), 8th IBRO World Congress of Neuroscience (Florence, Italy, 2011), 41st Society For Neuroscience annual meeting (Washington, DC, USA, 2011), XV Школе-конференции молодых ученых Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (Москва, 2011), A joint meeting of European Molecular and Cellular Cognition Society and Haifa forum for Brain and Behavior (Haifa, Israel, 2012), 5ой Международной конференции по когнитивной науке (Калининград, 2012), 10ой Курчатовской молодежной научной школе (Москва, 2012).
Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 10 печатных работ, из них 2 – статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа объемом 114 страниц состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками. Список цитируемой литературы включает 261 источник.
Научно-практическое значение работы
Эпизоды приобретения нового опыта могут быть как достаточно длительными, так и сравнительно кратковременными, занимая секунды. Тогда как память об этих событиях, вне зависимости от длительности обучения, зачастую храниться месяцами и даже годами. Известно, что в первые минуты и часы после обучения память переходит из кратковременной, лабильной формы в долговременную стабильную (Agranoff et al., 1965; McGaugh, 1966; Анохин, 1997; Medina et al., 2008), другими словами фиксируется, консолидируется, постепенно приобретая устойчивость к действию различных амнестичных агентов (McGaugh, 2000). Многие клеточные и молекулярные процессы, обеспечивающие консолидацию памяти, описаны в литературе (Goelet et al., 1986; McGaugh, 2000; Abel and Lattal, 2001; Kandel, 2001) и послужили основой для создания схемы каскада событий, приводящих к формированию долговременной памяти.
Критическая значимость отдельных этапов каскада молекулярных событий для консолидации была продемонстрирована в работах с использованием специфических интерферирующих воздействий. Животных подвергали действию амнестических агентов незадолго до или сразу после ситуации обучения, что приводило к нарушению долговременной памяти и развитию амнезии, которую в большинстве случаев считали необратимой (Sara and Hars, 2006, Flexner et al.,1963; Gibbs, Ng, 1977; Davis, Squire, 1984; Bourtchouladze et al., 1994, 1998).
Однако с конца 60-х годов XX века начали накапливаться данные, свидетельствовавшие о том, что память, нарушенная во время консолидации, тем не менее, может быть восстановлена (Sara and Hars, 2006). В качестве интерферирующих воздействий в этих экспериментах использовали электроконвульсивный шок (Quartermain et al., 1970; Cooper and Koppenaal, 1964; Kohlenberg and Trabasso, 1968) или введение антибиотиков-ингибиторов синтеза белка (Quartermain et al., 1970, Randt et al., 1972; Squire and Barondes, 1972). При этом, наблюдали спонтанное восстановление нарушенной памяти (Cooper and Koppenaal, 1964; Kohlenberg and Trabasso, 1968; Quartermain et al., 1970; Squire and Barondes, 1972) или восстановление, связанное с использованием процедуры «напоминания», которая заключалась в предъявлении животному перед тестом на долговременную память одного из компонентов ситуации обучения: условного или безусловного сигнала (Lewis et al., 1968; Koppenaal et al., 1967; Miller and Springer, 1972; Quartermain et al., 1972; Radyushkin and Anokhin, 1999).
Результаты этих экспериментов послужили основой для развернувшейся дискуссии о необходимости синтеза белка для процесса консолидации памяти, а также о возможной природе экспериментальной амнезии (Davis and Squire, 1984; Miller and Matzel, 2006; Sara and Hars, 2006). Согласно классической точке зрения, нарушение консолидации считали необратимым, приводящим к нарушению приобретения, хранения и извлечения из памяти индивидуального опыта (Davis and Squire, 1984). Наблюдаемое же в ряде случаев “восстановление” памяти связывали с новым обучением или с недостаточной эффективностью интерферирующих воздействий (Gold and King, 1974; McGaugh and Petrinovich, 1966). Противники этой точки зрения предполагали, что амнезия связана лишь с невозможностью извлечения из памяти ранее приобретенного опыта, которая вызвана действием амнестического агента. В качестве аргументов использовали работы, в которых была показана возможность восстановления памяти спонтанно, в результате действия напоминания или введения экспериментальным животным психоактивных веществ (Miller and Springer, 1973; Lewis and Maher, 1966; Quartermain, 1988; Radyushkin and Anokhin, 1999). Таким образом, обсуждение возможных сценариев формирования долговременной памяти и причин амнезии привело к пересмотру считавшейся долгое время незыблемой концепции консолидации (Sara and Hars, 2006). Однако в последующие годы данная тема не получила продолжения, и были выполнены лишь отдельные исследования возможности восстановления памяти, нарушенной во время консолидации, а также молекулярных процессов, лежащих в основе данного феномена (Radyushkin and Anokhin, 1999).
В настоящей работе мы сочли необходимым вернуться к исследованию возможности восстановления памяти, нарушенной введением ингибиторов синтеза белка при обучении, а также исследовать один из ключевых этапов каскада молекулярных событий, сопровождающих обучение и извлечение ранее приобретенного опыта, – активацию генома нейронов, вызванную восстановлением нарушенной памяти. В качестве экспериментальной модели нами было выбрано однократное обучение условнорефлекторному замиранию у мышей. Преимущества данной модели заключаются в том, что ассоциативный навык приобретается животными в течение одного сеанса, а формирующаяся при этом память является долговременной (Fanselow, 1980., Payor et al., 1994, Stiedl and Spess, 1997). Являясь весьма популярной, данная поведенческая методика позволила подробно описать нейрональный субстрат и каскады молекулярных событий, необходимых для обучения и формирования долговременной памяти у млекопитающих (Kim et al., 1993; Milanovic et al., 1998; Radulovic et al., 1998; Schafe and LeDoux, 2000; Fanselow and LeDoux, 1999; Pape and Pare, 2010). Первым этапом изменений на молекулярном уровне является экспрессия «ранних» генов, в частности, c-fos, в нейронах головного мозга в ситуациях, связанных с новизной, обучением и извлечением приобретенного опыта, требующих при этом пластических перестроек (Анохин, 1997; Guzowski, 2002, 2005; Flavell and Greenberg, 2008). В настоящей работе экспрессия c-Fos была использована с целью выявления локусов пластических событий, происходящих в мозге амнестичных животных под действием напоминания, а также для обнаружения сходств и различий активации мозга на условный сигнал у животных с нормальной и восстановленной памятью.
Цель и задачи исследования Перед работой была поставлена цель: исследовать возможность и особенности процесса восстановления памяти, нарушенной блокадой синтеза белка при обучении мышей в модели условнорефлекторного замирания, а также различия в активности областей мозга амнестичных животных по сравнению с необученными животными и животными с нормальной памятью.
Для достижения поставленной цели мы решали следующие конкретные задачи: 1) исследовать возможность восстановления памяти, нарушенной у мышей введением ингибитора синтеза белка циклогексимида, при обучении в модели условнорефлекторного замирания; 2) изучить временную динамику процесса восстановления памяти, нарушенной введением циклогексимида; 3) провести сравнительный анализ активности мозга по экспрессии c-Fos после напоминания у животных с нарушенной и нормальной памятью; 4) провести сравнительный анализ активности мозга по экспрессии c-Fos при предъявлении условного сигнала животным с нормальной и восстановленной памятью.
Консолидация памяти с точки зрения разных уровней протекания данного процесса в мозге
Роль миндалины в формировании ассоциативной связи между УС и БС исследовали в экспериментах по регистрации вызванной активности нейронов. В экспериментах на кроликах и крысах было установлено, что нейроны центрального и латерального ядер миндалины демонстрируют специфическое повышение амплитуды коротколатентных ответов при предъявлении условного звукового сигнала, сочетавшегося ранее с безусловным электрокожным раздражением (Applegate et al., 1982; Quirk et al., 1995). В LA этот эффект не наблюдали при предъявлении неассоциированного сигнала (Quirk et al., 1995), что свидетельствовало о специфической чувствительности нейронов данной области к конвергенции условного и безусловного стимулов (Quirk et al., 1995; Fendt and Fanselow, 1999). Непосредственное подтверждение этому было получено в экспериментах Романски и соавт. (1993) по регистрации нейронной активности у анестезированных крыс, которым предъявляли звуковой сигнал, сочетавшийся с электрокожным раздражением. В дорзальной части латерального ядра были обнаружены нейроны, спайковая активность которых повышалась лишь при совместном предъявлении звукового сигнала и электрокожного раздражения (Romanski et al., 1993). Повышение реактивности нейронов LA на предъявление УС являлось следствием обучения, а не проявления выработанной реакции страха, поскольку при ее угнетении в присутствии антагониста NMDA-рецепторов АР-5 или лидокаина повышенная активность нейронов LA сохранялась (Goosens et al., 2003). Данные по активации LA при совместном предъявлении УС и БС получили подтверждение в недавних экспериментах по картированию миндалины с помощью антител к ERK/MAPK р42/44 (Bergstrom et al., 2011). Сочетанное предъявление звукового сигнала и электрокожного раздражителя приводило к воспроизводимой между животными, топографически локализованной повышенной экспрессии рМАРК в дорзальной части LA, чего не наблюдали в группах псевдообученных и необученных животных (Bergstrom et al., 2011). Таким образом, эксперименты по регистрации вызванной электрической активности в LA, совместно с данными по функциональному картированию, продемонстрировали избирательную реакцию нейронов данной области на сочетание звукового и болевого стимулов. Электрофизиологическими методами была продемонстрирована их способность к пластичности, которая выражалась в изменении амплитуды спайковой активности при предъявлении УС, ассоциированного с БС. В западной литературе LA была названа «sensory gateway to the amygdala» - «сенсорные ворота миндалины» (LeDoux et al., 1990b), что подчеркивало ее ключевое значение для обучения ассоциативному УРЗ.
Центральное ядро миндалины занимает ключевое место на пути сигналов из BLA к эффекторным областям мозга. Морфологическое разделение СеА на латеральную и медиальную части, подкрепляется данными о функциональных особенностей данных областей миндалины. Нейроны СеАт отдают проекции в структуры мозга, осуществляющие контроль движений и сердечнососудистой деятельности (см. выше), и иннервируются обширно ветвящимися аксонами нейронов CeAl (Petrinovic and Swanson, 1997). Основным медиатором этих проекций является гаммааминомасляная кислота (ГАМК) (Sun and Cassell, 1993; PitkDnen et al., 1997), что свидетельствует об ингибирующем характере связей между нейронами латеральной и медиальной областей центрального ядра миндалины (Petrinovic and Swanson, 1997; PitkDnen et al., 1997). Экспериментальные исследования подтвердили существенную роль CeAl в регуляции ответа CeAm на предъявление УС. Так, ингибирование центрального ядра в целом (Wilensky et al., 2006) или отдельно области CeAl (Ciocchi et al., 2010) предотвращало обучение УРЗ. Дальнейшие электрофизиологические исследования позволили охарактеризовать реципрокно связанные популяции нейронов в пределах CeAl: регистрация через 24 часа после обучения выявила повышение спайковой активности одних (CeAl-On) нейронов и снижение активности других (CeAl-Off) в ответ на предъявление УС (Ciocchi et al., 2010). Вероятную схему событий при обучении условнорефлекторному замиранию представляют следующим образом: предъявление УС приводит к возбуждению CeAl-On нейронов, которые ингибируют CeAl-Off нейроны, тем самым снимая тормозные влияния со стороны CeAl на CeAm. Это выражается в поведенческих и вегетативных проявлениях реакции страха в ответ на предъявление УС (Ehrlich et al., 2009; Pare and Duvarci, 2012; Ciocchi et al., 2010).
Как упоминалось выше, использование транскрипционного фактора c-fos в качестве маркера пластических перестроек в нейронах позволило выявить области мозга, вовлекающиеся в различные формы обучения у животных (Curran and Morgan, 1995; Herdegen and Leah, 1998; Kaczmarek, 2002; Flavell and Greenberg, 2008). Этот подход к исследованию функциональной активности гетерогенной структуры миндалины при обучении УРЗ позволил идентифицировать вклад отдельных ядер в процессы приобретения и извлечения аверсивного опыта. Обучение в модели контекстуального УРЗ, также как обследование нового контекста без удара током, приводило к повышению экспрессии c-Fos в BLA по сравнению с необученными животными (Milanovic et al., 1998; Radulovic et al., 1998; Stanciu et al., 2001). В работе Уилсон и Мёрфи (2009) с применением трансгенных мышей, содержащих под промотором гена c-fos репортерную конструкцию tau-lacZ, продемонстрировали повышение Fosau-LacZ-экспрессирующих клеток в LA обученных животных по сравнению с животными, получившими немедленный удар током или не получившие электрокожного раздражения (Wilson and Murphy, 2009). Повышение экспрессии c-Fos в CeA после обучения было неспецифическим: его наблюдали как при нанесении электрокожного раздражения сразу после помещения в новую обстановку (в этом случае контекстуальное обуславливание не происходит), так и в ситуации, когда электрокожное раздражение подавали после обследования животными экспериментальной камеры (т.е. в ситуации контекстуального обуславливания) (Milanovic et al., 1998;Stanciu et al., 2001; Holahan and White, 2004). Иную картину наблюдали в миндалине при обучении животных ассоциировать УС (звуковой сигнал) с электрокожным раздражением. Повышенная экспрессия c-Fos в BLA была обнаружена у мышей, получивших сочетанное предъявление УС и БС по сравнению с животными, обучавшимися без звукового сигнала (т.е. в модели контекстуального обуславливания; Radulovic et al., 1998). При этом в CeA наблюдали повышение количества c-Fos-позитивных клеток у животных, получивших удар током в новой обстановке, а также при его сочетании с УС, по сравнению с контрольными животными, не получавшими удар током (Radulovic et al., 1998). Таким образом, процедура обучения УРЗ вызывала повышение экспрессии c-Fos в BLA животных, обученных на сочетание УС и БС по сравнению с животными, обученными контекстуальному замиранию, и необученными животными. Неспецифическая индукция экспрессии c-Fos в CeA была связана с получением животными электрокожного раздражения, вне зависимости от того, формировалась при этом ассоциативная память или нет.
Вещества, дозировки и способ введения
Процедура обучения проходила на фоне невысокого уровня замирания у животных всех экспериментальных групп. Предъявление звукового УС не приводило к существенному увеличению этого показателя. После однократного сочетания УС и БС мы наблюдали в сеансе обучения незначительное возрастание длительности эпизодов замирания у животных всех групп, получивших ЭКР.
Результаты тестирования памяти животных на звуковой УС через 48 ч после сеанса обучения свидетельствуют об эффективной выработке условнорефлекторного замирания у мышей. В то же время, в наших экспериментах системное введение мышам ингибитора синтеза белка циклогексимида за 20 мин до обучения вызывало нарушение долговременной памяти в тесте с предъявлением звукового условного сигнала через 26, 32 и 48 ч после обучения. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными ранее в данной модели обучения (Radulovic et al., 1998, Stiedl et al., 1999). Классическое объяснение этих результатов основано на гипотезе, согласно которой синтез белка de novo необходим для консолидации памяти (Alberini, 2008, Davis and Squire, 1984). При этом предполагают, что введение ингибиторов синтеза белка до или сразу после обучения приводит к необратимому нарушению процесса консолидации, что делает невозможным хранение и последующее извлечение долговременной памяти (Davis and Squire, 1984).
Однако наши данные, полученные в первом эксперименте, не подтверждают эту гипотезу. Нами показана возможность восстановления нарушенной при обучении памяти после применения процедуры напоминания в модели условнорефлекторного замирания у мышей. Сходные результаты были получены ранее в экспериментах по обучению пассивному избеганию цыплят, крыс и мышей (Радюшкин, Анохин, 1997, Miller and Springer, 1972, Quartermain et al., 1970, Sara and Hars, 2006).
В настоящей работе показано, что кратковременная процедура напоминания безусловным стимулом в новой обстановке приводит к восстановлению нарушенной памяти на условный звуковой сигнал. Этот факт позволяет по-новому рассмотреть вопрос о факторах, определяющих процесс восстановления памяти в подобных исследованиях (Miller and Springer, 1972, Quartermain et al., 1970, Quartermain et al., 1972). Сильным контраргументом при обсуждении возможности восстановления памяти, нарушенной во время консолидации, было предположение о возможности повторного обучения при напоминающих воздействиях (Gold and King, 1974, Sara and Hars, 2006). В разработанном нами протоколе процедура напоминания включала в себя предъявление одного лишь безусловного стимула – электрокожного раздражения. Таким образом, наблюдаемое в тесте на условный сигнал восстановление памяти не могло быть связано с повторным обучением на сочетание условного сигнала (звука) с безусловным (электрокожным раздражением) или с повторным попаданием в известную обстановку – контекст обучения и контекст напоминания существенно различались (Miller and Matzel, 2006). Процедура напоминания не приводила к генерализации реакции замирания в новом контексте, так как в тесте на условный сигнал в течение первых трех минут (до подачи звука) животные всех групп практически не замирали.
В литературе обсуждается вопрос о роли разных компонентов напоминающего воздействия в восстановлении памяти. Отдельное внимание уделяют новизне, или эраузелу, состоянию возбуждения, которое могло сопровождать процедуру напоминания (Brown et al., 1985). Однако исследования группы Миллера и Спрингера продемонстрировали, что наибольшей эффективностью обладали стимулы, идентичные по модальности тем, которые использовались при обучении (Springer and Miller, 1972; Miller and Springer, 1974). Исследования Брауна и соавт. (1985) подтвердили ограниченную роль возбуждения в восстановлении памяти. Восстановление памяти у амнестичных животных наблюдали как при предъявлении УС в новой камере, так и при предъявлении этого же УС в камере, с которой животные были предварительно ознакомлены (Brown et al., 1985). Таким образом, большую значимость имел используемый напоминающий стимул, но не ситуация новизны и общее возбуждение животного. В разработанной нами процедуре напоминания можно выделить два ключевых компонента: новую обстановку и безусловный стимул (ЭКР). Попадание в новую обстановку в данном случае, вероятно, можно исключить как возможный фактор, приводящий к восстановлению памяти из-за кратковременности нахождения в ней. Нанесение удара током, несомненно, приводило к сильному возбуждению животных (мыши прыгали, ускоренно перемещались по клетке, вокализировали). Однако необученные животные, получавшие напоминание (группа АК+Нап) в тех же условиях не демонстрировали существенного повышения уровня замирания во время тестирования. Таким образом, в разработанной процедуре напоминания существенным фактором было скорее обращение к прошлому аверсивному опыту животных, чем неспецифическое возбуждение в ответ на болевое раздражение (Brown et al., 1985).
В экспериментах на цыплятах ингибиторы синтеза белка вводили в структуру мозга, для которой показано вовлечение в обучение пассивному избеганию (промежуточная часть медиальной области вентрального гиперстриатума) (Радюшкин, 1998). Наблюдаемое восстановление памяти в этой работе могло быть связано с участием других областей мозга в консолидации. Мы вводили циклогексимид системно, поэтому компенсаторное вовлечение одних структур мозга в процесс консолидации при нарушенной функции других в наших экспериментах представляется маловероятным.
Таким образом, процедура напоминания не вызывала генерализованной реакции замирания и не приводила к повторному обучению, но была эффективной для восстановления специфической реакции замирания в тесте на условный звуковой сигнал.
Во втором эксперименте нами была показана градуальность восстановления нарушенной памяти. Она выражалась в постепенном увеличении времени замирания у амнестичных животных при тестировании через 2, 6 и 24 ч после напоминания. Эти данные согласуются с результатами, полученными в модели обучения пассивному избеганию у цыплят (Радюшкин, 1998). В указанной работе животных обучали избегать клевать бусину определенного цвета. Перед обучением цыплята получали инъекцию циклогексимида. Через 24 ч после обучения проводили напоминание. Тестирование животных через разные временные интервалы после напоминания показало, что восстановление памяти происходило через 5-7 ч после напоминания.
Как у цыплят, так и у мышей 6-часовой интервал считают ключевым для окончания молекулярных процессов консолидации памяти, связанных со второй волной синтеза и гликозилирования белков (Dudai, 2004, Freeman et al., 1995, McGaugh, 2000). Совпадение временной динамики восстановления памяти на поведенческом уровне и описанных внутриклеточных событий позволяет предположить ключевую роль процедуры напоминания в индукции молекулярных каскадов консолидации памяти. Можно предположить, что завершение данного процесса после второй волны синтеза белка через 4-7 ч, делает возможным извлечение долговременной памяти на более поздних сроках.
Градуальное восстановление нарушенной памяти после напоминания
Анализ транскрипционной активности мозга амнестичных животных и животных с восстановленной памятью при извлечения прошлого опыта проведен в настоящей работе впервые. Продемонстрировано повышение количества c-Fos-позитивных клеток в СеА животных, получивших перед обучением ЦГ. Известно, что предъявление обученному животному УС сопровождается повышением спайковой активонсти нейронов СеА (Ciocchi et al., 2010). Устройство нейронной микросети CeA было охарактеризовано на основании данных по импульсной активности клеток, вызванной предъявлением звукового УС обученным животным (Ciocchi et al., 2010). В пределах латеральной части CeA были выделены on- и off-клетки, которые соответственно проявляли возбуждающие и тормозные ответы при предъявлении УС. Коллатерали этих нейронов направляются в медиальную часть СеА, нейроны которой также приобретали дифференцированный ответ на предъявление УС (Ciocchi et al., 2010). Таким образом, при обучении животных на сочетание УС и БС происходила специализация нейронных популяций относительно конкретного УС в зависимости от его значимости (предсказывает он БС или нет) (Ciocchi et al., 2010). Известно, что обучение вызывает специализацию нейронов относительно эпизодов индивидуального опыта и требует активации генетического аппарата и синтеза белка в нейронах (Agnihotri et al., 2004; Анохин, 1997; Dudai, 2004; Svarnik et al., 2005). В связи с этим, повышение экспрессии c-Fos, которое мы наблюдали в CeA животных групп ЦГ-Нап и ЦГ+Нап, могло быть связано с реконструкцией нейронной сети, целостность которой была нарушена введением ЦГ при обучении. Ранее напоминание могло индуцировать аналогичные процессы в других областях мозга (см. результаты экспрессии в гиппокампе после напоминания). У животных группы ЦГ-Нап в отсутствии напоминания нейронная сеть, обеспечивающая манифестацию поведения замирания на звуковой УС, не была реактивирована. В связи с этим, предъявление звукового УС не приводило к замиранию во время тестирования. Можно также предположить, что процедурой тестирования у этих животных был запущен иной процесс: звуковой сигнал, утратив ассоциативную значимость для амнестичных животных, был квалифицирован как индифферентный стимул. Как и любая другая процедура обучения, этот процесс также требовал пластических перестроек (в том числе в той части сети, которая связана с проявлением поведения замирания) и сопровождался индукцией c-Fos. Проверка этих альтернативных гипотез требует проведения дополнительных экспериментов.
Топография экспрессии c-Fos в слуховой коре после тестирования памяти на звуковой УС Извлечение памяти во время тестирования сопровождалось индукцией экспрессии c-Fos в слуховой коре животных экспериментальных групп по сравнению с группой ПК. Однако между группами ФР+Нап, ЦГ-Нап и ЦГ+Нап достоверных различий обнаружено не было. Слуховая кора была выбрана для анализа транскрипционной активности c-Fos после тестирования памяти на звуковой УС как область, нейроны которой модулируют свою спайковую активность в связи с обучением УРЗ (Galvan and Weinberger 2002; Weinberger, 2004). Реактивация прошлого опыта вызывала не только градуальное увеличение амплитуды ответов в слуховой коре в течение нескольких дней после обучения (Galvan and Weinberger, 2002), но также приводила к повышению экспрессии zif268 при предъявлении УС (Kwon et al., 2012). Повышение плотности zif268-позитивных клеток в слуховой коре наблюдали после тестирования памяти мышей на звуковой УС через 24 ч после обучения. Сопоставимое увеличение экспрессии было обнаружено также в группе животных, которым накануне предъявляли звуковой УС без ЭКР (Kwon et al., 2012). Авторы интерпретировали повышение экспрессии zif268 в слуховой коре как отражение активности мозга при повторном предъявлении знакомого сигнала, не связывая ее с извлечением аверсивной ассоциативной памяти о звуковом УС (Kwon et al., 2012). Как упоминалось выше, ответы нейронов слуховой коры претерпевают «настройку» на звуковой УС в течение трех дней после обучения (Galvan and Weinberger, 2002), что, вероятно, требует включения механизмов пластичности в данный процесс. В наших экспериментах животные группы ЦГ-Нап замирали мало при предъявлении звукового УС; тем не менее, нельзя исключить возможность узнавания этого УС животными данной группы. В связи с этим, повышение экспрессии c-Fos в мозге животных с восстановленной и реактивированной нормальной памятью (ЦГ+Нап и ФР+Нап соответственно) нельзя однозначно связать с реактивацией ассоциативной памяти. Для уточнения причины, вызвавшей сопоставимую индукцию c-Fos в слуховой коре животных с различным индивидуальным опытом и разной степенью сохранности памяти, необходимы дополнительные исследования.
Возможные побочные эффекты действия ингибитора синтеза белка
Обсуждая индукцию экспрессии «ранних» генов в мозге животных, подвергшихся действию ингибиторов синтеза белка, необходимо учитывать возможные побочные эффекты этих веществ (Alberini, 2008; Radulovic and Tronson, 2008). Так, для некоторых ИСБ (среди которых и циклогексимид) был продемонстрирован эффект супериндукции, выражавшийся в длительном (в отличие от кратковременного в нормальных условиях) повышении экспрессии мРНК «ранних» генов (Radulovic and Tronson, 2008). Но, даже учитывая тот факт, что эффект супериндукции мРНК может длиться намного дольше, чем ингибирование белкового синтеза, он все же существенно ослабевает уже через 3-4 ч (Greenberg et al., 1986; Fort et al., 1987). В связи с этим, представляется маловероятным, чтобы повышение экспрессии c-fos в наших экспериментах проявилась через 24-48 ч после введения ЦГ и оказало влияние на полученные результаты. Кроме того, повышение стабильности мРНК следовало бы ожидать во многих областях мозга всех животных, получивших ЦГ. Однако этого мы также не наблюдали: после напоминания экспрессия была повышена лишь в некоторых областях мозга, только в группе ЦГ+Нап, но не ЦГ-Нап, а после тестирования памяти повышение уровня c-Fos наблюдали лишь в CeA у животных групп ЦГ-Нап и ЦГ+Нап, но не в соседних областях мозга.
Помимо побочного эффекта ИСБ на молекулярном уровне, Шарма и соавт. (2012) продемонстрировали подавление электрической активности у анестезированных животных при внутримозговом введении анизомицина (и циклогексимида) в дозах, эквивалентных используемым в поведенческих экспериментах для нарушения консолидации памяти. Интрагиппокампальное введение 100 мкг анизомицина вызывало практически полное подавление спонтанного тета-ритма и вызванной активности; максимальный эффект наблюдали спустя 20-30 мин после инъекции, его длительность составляла до 4-6 ч (Sharma et al., 2012). Сходный эффект был обнаружен и при введении анестезированным крысам циклогексимида. Степень ингибирования синтеза белка прямо коррелировала с подавлением нейронной активности, свидетельствуя, таким образом, о необходимости синтеза белка для поддержания электрической активности нейронов (Sharma et al., 2012). Таким образом, нарушение консолидации могло быть связано не с подавлением синтеза белка, а, в первую очередь, с угнетением текущей нейронной активности (Sharma et al., 2012). Системное введение ИСБ применяется в исследованиях консолидации памяти наряду с внутримозговыми инъекциями веществ, однако необходимо учитывать, что в данном случае действию препарата подвергается мозг в целом, а не отдельная его область. Глобальное нарушение нейронной активности в мозге неминуемо должно было найти отражение в поведении животных. Тем не менее, ни в наших исследованиях, ни в работах других авторов, использовавших системное введение ИСБ, глобальных нарушений поведения животных обнаружено не было (Quinton and Kramarcy, 1977; Davis and Squire, 1984). В то же время, можно предположить большую чувствительность одних областей мозга по сравнению с другими к подавляющему действию ИСБ на нейронную активность. Для выяснения ответа на этот вопрос необходимы дополнительные эксперименты, в которых проводили регистрацию электрической активности у свободноподвижных животных во время и после системного введения ИСБ.
Еще одним важным вопросом в исследованиях памяти, связанных с действием ИСБ, является вопрос о мишенях действия амнестических агентов. В частности, модулируется ли экспрессия белка c-Fos при системном введении ЦГ. Согласно данным литературы, вызванная экспрессия целого ряда РГ, в том числе c-Fos, в мозге грызунов подавляется однократным введением ИСБ (Schreiber et al., 1993; Lee et al., 2003; Inda et al., 2005; Canal et al., 2007). Системное введение ЦГ крысам не препятствовало кратковременному (в течение одного часа) повышению экспрессии гена в СА3 и СА1 под действием каината, однако предотвращало долговременное (в течение 16 ч) повышение уровня мРНК c-fos в этих структурах (Schreiber et al., 1993). Снижение количества белка c-Fos в DG, СА3 и СА1 наблюдали уже через 2 ч после введения каиновой кислоты на фоне действия циклогексимида (Lee et al., 2003). Введение другого ингибитора синтеза белка (анизомицина) подавляло вызванную каинатом экспрессию c-Fos в целом ряде структур мозга крыс (DG, СА1,СА3, пириформной коре и миндалине) на срок до 6 ч после инъекции (Inda et al., 2007). Аналогично, введение анизомицина в ВА существенно снижало количество c-Fos-позитивных клеток в области введения (Canal et al., 2007). В экспериментах на крысах был продемонстрирован непосредственный эффект циклогексимида на экспрессию c-Fos, вызванную обучением
