Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1 Память: общие вопросы 7
1.1.1 Кратковременная и долговременная память: теория консолидации, этапы формирования долговременной памяти 7
1.1.2 Нейроанатомические основы формирования долговременной памяти 10
О возможности спинальпых механизмов памяти 16
1.2 Пространственная память и тест Морриса 17
1.3.1. Тест Морриса: общие характеристики 17
1.3.2. Нейроанатомические основы и механизмы навигационного научения и формирования пространственной памяти 20
1.3 Двигательная (процедурная) память 23
1.3.1 Современные представления 23
1.3.2 Тест «выученного выпрыгивания из воды» 26
1.4 Молекулярио-клеточные механизмы формирования долговременной памяти—28
1.5 Ингибиторы синтеза белка в изучении механизмов формирования долговременной памяти 35
1.5.1 Механизмы действия ингибиторов синтеза белка 35
1.5.2 Влияние ингибиторов синтеза белка на формирование долговременной памяти— 38
1.5.3 Ингибиторы синтеза белка, гибель клеток головного мозга и память 42
Постановка цели и задач исследования 44
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1 Стереотаксические операции 45
2.2 Внутримозговые инъекции 45
2.3 Определение локализации канюль 45
2.4 Извлечение головного и спинного мозга и выделение структур 46
2.5 Определение глубины подавления синтеза белка- 46
2.6 Определение гибели клеток головного мозга 46
2.7 Навигационное научение в водном лабиринте Морриса 46
2.8 Двигательное научение в тесте «выученного выпрыгивания из воды»
47
Результаты работы и обсуждение 47
Глава 3. Количественный анализ подавления синтеза белка в интракраниальном введении циклогексимида 47
3.1 Токсичность циклогексимида 47
3.2 Подавление синтеза белка в структурах головного мозга после двустороннего введения циклогексимида в хвостатое ядро 48
3.3 Подавление синтеза белка в ЦНС и печени после двустороннего введения циклогексимида в боковые желудочки 49
Глава 4. Анализ навигационного научения у крыс в водном лабиринте Морриса при различных протоколах процедуры научения 53
4.1 Роль зрительной ориентации в навигационном пространственном научении—53
4.2 Влияние перемещения «знакового» дистального зрительного ориентира в пространстве на навигационное научение 54
4.3 Быстрое навигационное научение по модифицированному протоколу 58
4.4 Навигационное научение в упрощенном лабиринте Морриса при постоянном и случайном положении платформы 61
Глава 5. Влияние блокады синтеза белка в ЦНС на формирование различных видов долговременной памяти 62
5.1 Влияние блокады синтеза белка в течение одного часа после обучения на формирование долговременной памяти 62
5.1.1 Стандартный лабиринт Морриса 63
5.1.2 Упрощенный лабиринт Морриса 64
5.1.3 «Выученное выпрыгивание из воды» 66
5.2 Влияние блокады синтеза белка в течение десяти часов после обучения на формирование долговременной памяти 67
5.2.1 Упрощенный лабиринт Морриса 67
5.2.2 «Выученное выпрыгивание из воды» 68
Гибель клеток головного мозга при введении максимальных доз циклогексимида 71
Глава 6. CLASS Заключительное обсуждени CLASS е 72
Выводы 81
Список литературы 82
- Кратковременная и долговременная память: теория консолидации, этапы формирования долговременной памяти
- Ингибиторы синтеза белка в изучении механизмов формирования долговременной памяти
- Подавление синтеза белка в структурах головного мозга после двустороннего введения циклогексимида в хвостатое ядро
- Навигационное научение в упрощенном лабиринте Морриса при постоянном и случайном положении платформы
Введение к работе
Актуальность проблемы: Исследование механизмов формирования памяти является одной из наиболее приоритетных областей нейронауки. Изучение этого вопроса несомненно поможет понять многие фундаментальные принципы работы мозга и откроет путь' к излечению нарушений памяти, Связанных с такими тяжелыми психическими заболеваниями, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, наркомании, алкоголизм и др. Проблеме памяти уделяется огромное внимание уже более 100 лет. Количество накопленного экспериментального материала в этой области постоянно растет. Однако открытие множества новых деталей механизмов памяти значительно усложняет наши представления о работе этой системы и приводит к пересмотру сложившихся теоретических коїщепций, а многие вопросы до сих пор остаются открытыми (Виноградова 2000; Arshavsky, 2002).
Так, унитарная теория памяти, согласно которой гиппокампальная система считалась критически необходимой для формирования всех типов памяти, сменилась новой. По современным представлениям существует две основные системы памяти: (1) декларативная (экспликативная) память, зависящая от медиальных структур височной доли, включая гиппокамп и (2) недекларативная (импликативная) память, не зависящая от структур гиппокампальной системы. Одним из многих типов памяти, относящихся к недекларативной системе, является двигательная (процедурная) память, в которой хранится информация о способах исполнения репертуара движений и навыков, приобретенных в течение личного опыта (Milner et al., 1998). В настоящее время вопрос о нейроанатомических и молекулярно-клеточных основах двигательной памяти мало разработан. Однако в последние несколько лет ему стало уделяться значительное внимание (Brushers-Krug et al., 1996; Muellbacher et al., 2002). Тем не менее, до сих пор исследования формирования двигательной памяти проводятся в основном на людях, а экспериментальных моделей на животных, на наш взгляд, явно недостаточно.
Общепринятая теория молекулярных механизмов формирования долговременной памяти (т.е. перехода информации из лабильной кратковременной памяти в стабильную долговременную) предполагает, что ключевую роль в этом процессе играет специфическая активация экспрессии генов и синтез белков de novo, участвующих в модификации существующих и/или образовании новых синаптических связей (Clayton, 2000). В связи с этим ингибиторы синтеза белка (антибиотики эукариот) являются одними из наиболее широко применяемых амнестических агентов в изучении механизмов формирования различных видов долговременной памяти от беспозвоночных до млекопитающих. Однако в области психофармакологических исследований памяти, связанной с применением антибиотиков, остается несколько разногласий, которым, на наш взгляд, до сих пор не найдено адекватного объяснения. Во-первых, постулируется, что для достижения эффекта (т.е. амнезии) необходимо вводить ингибиторы в очень высоких («сверхфизиологических») дозах, вызывающих подавление синтеза белка в мозге как минимум на 80-90 % в течение небольшого периода времени после научения (первый период чувствительности) или через 4-6 ч (иногда 13-14 ч) после научения (второй период чувствительности). Лишь в некоторых работах формирование долговременной памяти нарушалось при 50-60% подавления (Davis, Squire, 1984). Во-вторых, имеется ряд доказательств того, что формирование некоторых видов долговременной памяти у беспозвоночных и позвоночных не нарушается глубоким подавлением синтеза белка в течение как минимум многих часов (Laudein et al., 1986; Shoel, Agranoff, 1972; Staubli et al., 1985; Tully, 1997; Westenberg et al., 1998). Нельзя не отметить, что в последнее время появляются гипотезы, предполагающие, что формирование долговременной памяти может также обеспечиваться за счет молекулярных механизмов не связанных напрямую с синтезом белков de novo (Lynch & Baudry, 1984; Arshavsky, 2002).
Таким образом, несмотря на довольно обширный материал, накопленный в течение
МНОГИХ ЛЄТ В ОбЛаСТИ ИЗуЧеНИЯ "п-і<уттарпгі.ігтт<Уіуупгт.у- ..«і.шт.лі ттячатп даштайтттао
исследование влияния подавления синтеза белка на"арзрЧй4ШйЛП^ВАЯчЬых типов
| БИБЛИОТЕКА |
| С. Петербург , У
долговременной памяти и, в особенности, двигательной памяти, в настоящее время остается актуальным.
Цель и задачи исследования: Целью данной работы было изучение влияния максимально возможного подавления синтеза белка в ЦНС крыс (а) на формирование долговременной двигательной памяти в недавно разработанном тесте «выученного выпрыгивания из воды» (Подольский, 1996, 1997); (б) на формирование долговременной пространственной памяти при обучении нахождению невидимой платформы в водном лабиринте Морриса (Morris, 1982).
Для исследования этой проблемы также были поставлены следующие задачи:
1) В связи с недостаточностью данных литературы о подавлении синтеза белка при -.
центральных введениях максимальных доз циклогексимида было решено (а) провести
детальный количественный анализ кинетики подавления синтеза белка в головном мозге; (б)
оценить скорость диффузии циклогексимида в головном мозге и возможность его проникновения из цереброспинальной жидкости в общий кровоток; (в) учитывая возможность локализации простых форм двигательной памяти на спинальном уровне (Бернштейн, 1990; Petterson, 1976), исследовать кинетику подавления синтеза белка в спинном мозге.
-
В связи с тем, что поведение животных в водном лабиринте Морриса зависит от влияния многих факторов (D' Hooge & De Deyn, 2001), было решено провести исследование тактик навигационного научения при различных методологических вариациях процедуры обучения и различных параметрах бассейна, используемых в нашей работе.
-
Поскольку в последнее время появляется все больше работ, указывающих на то, что ингибиторы синтеза белка в высоких дозах могут вызывать апоптоз и/или некроз в различных типах тканей in vivo и in vitro (Higami et al., 2000; Squier et al., 1999), было решено провести предварительную проверку наличия гибели клеток ЦНС при введении максимальных доз циклогексимида.
Научная новизна: В ходе работы были подтверждены и расширены данные других авторов о быстром (в течение 1 ч) и широком распространении подавления синтеза белка в головном мозге при внутримозговом (интракаудатном или внутрижелудочковом) введении циклогексимида.
Впервые показано, что двустороннее введение максимальных доз циклогексимида в боковые желудочки (100 и 200 мкг/канюля) вызывает равномерное и практически полное подавление синтеза белка не только в головном мозге, но и во всех отделах спинного мозга. Также показано, что при таком режиме введения антибиотика наблюдается сильное (хотя и значимо меньшее, чем в ЦНС) подавление синтеза белка в печени, что, по-видимому, связано с высокой способностью циклогексимида к проникновению через гематоэнцефалический барьер из цереброспинальной жидкости в общее кровяное русло.
Впервые показано, что формирование долговременной двигательной памяти в тесте «выученного выпрыгивания из воды» (эта форма памяти основана на модификации врожденных двигательных программ и является одной из наиболее простых) не нарушается длительным и глубоким подавлением синтеза белка в головном и спинном мозге (более 95% в течение первого часа и не менее 75% в течение последующих 9 ч после научения).
Кроме того, впервые начата экспериментальная проверка предположения о том, что ингибиторы синтеза белка при внутримозговом введении в высоких дозах, широко применяемых в психофармакологии памяти, могут вызывать сильные нейротоксические эффекты. Предварительные данные показывают, что циклогексимид в дозе 200 мкг/канюля через 4 ч после введения вызывает гибель клеток головного мозга.
Полученные нами данные позволяют по-новому интерпретировать эффекты ингибиторов синтеза белка на консолидацию долговременной памяти, и дают основания
предположить, что общепринятая концепция ключевой роли синтеза белков де novo в молекулярных механизмах формирования памяти не является универсальной.
Практическое значение: Исследование молекулярно-клеточных механизмов формирования долговременной памяти является одной из основных задач современной нейробиологии. Результаты наших систематических исследований вносят вклад в понимание этого вопроса. Обнаруженная нами чрезвычайная устойчивость процесса консолидации двигательной долговременной памяти к такому жесткому воздействию, как длительное и практически полное подавление синтеза белка в ЦНС показывает, что механизмы формирования различных типов долговременной памяти могут существенно различаться. Наши результаты указывают на существование таких форм долговременной памяти, формирование которых в течение многих часов не зависит от активации трансляционного аппарата нейронов.
Апробация работы: Результаты работы были представлены на совместном заседании секции «Нейробиология» ученого совета ИТЭБ РАН с Путинским отделением Физиологического общества (Пушино, 2003), XVII и XVIII съездах физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998; Казань, 2001), Международной конференции «Фундаментальные и клинические аспекты интегративной деятельности мозга» (Москва, 2003), а также в материалах других конференций.
Публикации: По материалам диссертации опубликованы 2 статьи. 1 статья принята в печать Тезисы 10 докладов напечатаны в рабочих материалах всероссийских и международных конференций.
Структура и объем диссертации: Диссертационная работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты и обсуждение»,
«Заключение», «Выводы», «Список цитируемой литературы». Работа изложена на
страницах машинописного текста, содержит рисунков, таблиц и список литературы
из ссылок.
Кратковременная и долговременная память: теория консолидации, этапы формирования долговременной памяти
В работах ранних философов и психологов память представлялась как единый процесс. В конце девятнадцатого века это положение стало изменяться. Поводом послужили работы основателей школы экспериментальной психологии -Густава Фехнера, Вильгельма Вундта и Германа Эббингауза (G. Fechner, W. Wundt, П. Ebinghaus). Исходя из результатов своих экспериментов, в которых субъектам предлагалось запомнить вербальную информацию различного рода, они постулировали существование лабильной стадии формирования долговременной памяти, в течение которой хранение информации довольно легко нарушается.
Работы в этом направлении были продолжены Мюллером и Пилзекером (G. Е. Miiller & A. Pilzecker, 1900). Субъектам предлагалось запомнить парные слоги, которые они должны были воспроизвести при предъявлении первого слога из каждой пары через различные интервалы времени после обучения. При минимальных интервалах между первым и повторным предъявлением большинство испытуемых давало неправильные ответы. По мере увеличения интервала процент ошибочных ответов быстро снижался и через 10-12 мин достигал минимального уровня. Кроме того, был открыт феномен «интерференции» («ретроактивного подавления»): предъявление слогов, изначально не предназначенных для запоминания, через несколько секунд после научения, приводило к быстрому забыванию заученного материала. По мере увеличения интервала между обучением и интерферирующим воздействием амнестический эффект также снижался. Аналогичные явления наблюдались и при запоминании сложных зрительных образов.
На основании этих фактов в 1900 г. была сформулирована гипотеза консолидации (персеверации), согласно которой процессы, лежащие в основе запоминания информации, сначала очень лабильны, но с течением времени упрочняются («консолидируются») (Милнер, 1973; Анохин, 1997; Lechner et al., 1999; McGaugh, 2000).
Гипотеза консолидации объясняла явления ретроградной амнезии (т.е. потери памяти на недавние события, предшествующие травматическому воздействию) и антероградной амнезии (т.е. потерю способности к запоминанию новой информации при поражении определенных областей головного мозга), обнаруженные соответственно Рибо (Т. Ribot) и Корсаковым в восьмидесятых годах девятнадцатого века. В дальнейшем гипотеза консолидации стала базовой концепцией иейробиологии памяти (Dudai, 1996; Warrington, 1996; White, 1997; Lorenzini et al., 1999; Morris, 1999; McGaugh, 2000).
В середине прошлого века на основании гипотезы Мюллера и Пилзекера и исследований влияния различных амнестических воздействий (таких как электроконвульсивный шок, наркоз, гипотермия и др.) на запоминание информации у животных Хебб, Джерард и Конорски разработали первую теорию двухфазного формирования памяти и физиологических механизмов, лежащих в основе этого процесса (Konorski, 1948; Hebb, 1949). Согласно их гипотезе фиксация следа памяти (энграммы) протекает в два последовательных этапа - сначала информация хранится в кратковременной памяти, характеризующейся высокой чувствительностью к различным повреждающим воздействиям, постепенно переходя в долговременную стабильную память. Кратковременная память обеспечивается и поддерживается реверберацией электрической активности в локальных цепях нейронов, участвующих в хранении следа памяти. С течением времени этот процесс способствует структурным изменениям в синапсах, которые обеспечивают перманентное хранение информации в долговременной памяти (Милнер, 1973; Lecher et al., 1999, McGaugh, 2000).
На основании этой гипотезы в начале восьмидесятых годов прошлого века была разработана теория синаптической пластичности (т.е. морфофункциоиального изменения эффективности синаптической связи в ответ на изменения электрической активности нейронов, образующих синапс), объясняющая ход молекулярио-клеточных процессов, лежащих в основе формирования долговременной памяти.
Дальнейшие исследования эффектов психологических и фармакологических воздействий, а также неинвазивные методы анализа (функциональный ядерно-магнитный резонанс (fMRI), позитронно-эмиссионная томография) показали, что длительность консолидации энграммы варьирует в зависимости от вида животного и параметров задачи, и подвели основания для более тонкого разделения этапов формирования памяти.
В 1968 г. было введено модифицированное и расширенное по сравнению с термином «кратковременная память» понятие «рабочей памяти» (R.C. Atkinson & R.M. Shiffrin, 1968). По современным представлениям, рабочая память обеспечивает одновременное хранение и «on 1іпе»-обработку информации, необходимой для решения определенных поведенческих задач, но не предназначенной для дальнейшей фиксации и запоминания. После завершения обработки след памяти мгновенно или постепенно забывается. В этом заключается главное отличие рабочей памяти от кратковременной (Буреш и соавт., 1991; Baddeley, 1996; Goldman-Rakic, 1996).
В начале 60-х г.г. прошлого века началось исследование роли синтеза белков de novo в процессах научения и формирования долговременной памяти. В 1962 г. было впервые показано, что ингибиторы синтеза белка эукариот не влияют на процесс научения, но нарушают формирование долговременной памяти (Flexner et al., 1963). Этот факт послужил ещё одним подтверждением того, что существует, по меньшей мере, две стадии формирования памяти, в основе которых лежат разные молекулярные механизмы.
Позднее появились теории, предполагающие существование нескольких этапов формирования памяти, которые развиваются независимо и параллельно. Первый шаг в этом направлении был сделан Мэри Гиббс. На основании изучения воздействия ингибиторов натриевой и калиевой проводимости, а также ингибиторов синтеза белка на научение и память у цыплят она выделила четыре фазы формирования памяти: (1) кратковременная память длительностью до 10 мин, зависящая от статуса калиевой проводимости; (2) кратковременная намять длительностью до 30 мин, зависящая от работы Na/K-ЛТФазы плазматической мембраны нейрона; (3) промежуточная память длительностью до 50 мин, не нарушаемая ингибиторами синтеза белка; (4) долговременная память, опосредованная активацией синтеза белка (Gibbs, Ng, 1976; 1977; 1984).
Ингибиторы синтеза белка в изучении механизмов формирования долговременной памяти
Антибиотики эукариот, такие как циклогексимид, ацетоксициклогексимид, анизомицин, пуромицин, представляют собой ингибиторы процесса трансляции матричных РНК. Механизмы воздействия антибиотиков на трансляционный аппарат эукариотической клетки различны. Некоторые из них, например пуромицин, подавляют реакцию транспеитидации посредством встраивания в растущую полипептидную цепочку. Другие, например анизомицин, нарушают синтез белка за счет ковалентного взаимодействия с некоторыми факторами трансляции или субъединицами рибосом (Ашмарин, Ключарев, 1975; Dawson et al., 1986).
В наших исследованиях мы использовали циклогексимид. Этот ингибитор относится к классу глутарамидных антибиотиков (Yeh & Shils, 1969; Obrig, 1974; Dawson et al., 1986). Показано, что в зависимости от концентрации циклогексимид нарушает многие реакции инициации, элонгации и терминации синтеза полипептидной цепи. Основным механизмом его действия является нарушение специфических реакций присоединения молекул тРНК к аминокислотам за счет подавления активности аминоацил-тРНК-синтетазы. Помимо этого, он может непосредственно связываться с большой и малой субъединицами SOS-рибосом, подавляя как сборку или диссоциацию отдельных рибосом, так и образование полисом (Sisler & Siegel, 1967; Obrig, 1974; Dawon et al., 1986). Наибольшей чувствительностью к циклогексимиду отличается пептидил-тРНК-связывающий (донорный) центр 608-субъединицы. Следствием взаимодействия антибиотика с этим центром является подавление реакции транслокации пептидил-тРНК из А-участка 608-субъединицы рибосом в П-участок путем задержки освобождения деацетилировашюй тРПК из допорного участка. В высоких концентрациях циклогексимид ковалентно связывается с донорным участком, вызывая его необратимое повреждение (McDonald & Ellis, 1969; Obrig, 1974; Ашмарин, Ключарев, 1975). В сублетальных дозах циклогексимид вызывает деградацию 18S и 28S рибосомных РНК в цитоплазме (Чирков, 19836). Также, его действие на синтез белка может быть связано с прямой инактивацией пептидилтрансферазы (Scwartz et al., 1971).
Циклогексимид является одним из наиболее эффективных ингибиторов эукариотической рибосомалыюй системы. В соответствующей концентрации он практически полностью подавляет не только тотальный (в цитоплазме и шероховатом эндоплазматическом ретикулуме), но и локальный синтез белка в ядре (Бойков, 1981, 1984; Cosson & Philippe, 2003; Не et al„ 2003) и удаленных компартментах клетки (например, в дендритных шипиках, аксонах и синаптических окончаниях нейронов) (Corbaton et al., 1991; Alvarez, 2000).
В гораздо меньшей степени циклогексимид подавляет активность митохондриального (708-рибосомалыюго) трансляционного аппарата (Ашмарин, Ключарев, 1975; Irwin, 1995; Corbaton et al., 1991; Rao & Steward, 1991). Но, поскольку большинство митохондриальных белков синтезируется в цитоплазме, циклогексимид значительно угнетает функциональную активность митохондрий и энергетический обмен клетки. Помимо этого, циклогексимид, по-видимому, может непосредственно влиять на процесс окислительного фосфорилироваиия посредством нарушения ионного обмена в мембранных кристах митохондрий (McDonald & Ellis, 1969).
В высоких концентрациях циклогексимид подавляет активность ДНК-полимеразы I, репаразы и РНК-полимераз, участвующих в синтезе рРНК и тРНК (Чирков, 1983а; Hendricks et al., 1969). Однако по мере снижения его концентрации в клетке наблюдается обратный эффект стимуляции синтеза ДНК (Алесенко, 1989).
Таким образом, циклогексимид, как и другие антибиотики, подавляя синтез белка, приводит к нарушению белкового гомеостаза клетки. Следствием этого являются существенные изменения многих биохимических процессов. Степень воздействия возрастает с увеличением дозы антибиотика.
Одним из таких эффектов являются изменения липидного обмена клетки. Подавляя синтез ферментов распада лииидов, циклогексимид вызывает их накопление в цитоплазме и, особенно, в ядре. Наибольшие изменения наблюдаются в метаболизме фосфолипидов, таких как фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, сфингомиелин, церамиды (Алесенко, 1989; 1994; Xu et al., 1998). Многие липиды чувствительные к подавлению синтеза белка, такие как диацилглицерол и фосфатидилинозитол, являются мессенджерами внутриклеточной передачи сигналов. Вследствие изменения их концентрации происходит активация/инактивация некоторых сигнальных молекул, таких как протеинкиназа С, казеинкиназа II и фосфатидилинозитол-киназа (Алесенко, 1984, 1994).
Подавление синтеза белка вызывает значительные нарушения обмена липопротеинов низкой и высокой плотности. Снижение их концентрации, в свою очередь, вызывает активацию мессенджерных киназ, таких как р46/р54 (JNK), р38 (МАРК), Raf-l/MEK-l/p42/44(MAPK) (Dhawan et al., 1999).
Блокада синтеза структурных ядерных белков, гистонов и негистоновых белков хроматина приводит к его значительным структурным изменениям. В ходе таких перестроек наблюдается замещение гистонов на слабосвязанные негистоновые белки (HMG1, IIMG2 и др.), следствием чего является деконденсация хроматина, усиление/подавление транскрипционной активности РНК полимераз I, II и III (за счет изменения доступности того или иного участка ДНК) и увеличение тотального количества транскриптов мРНК (Бойков, 1976, 1981; Шевченко, 1990; 1992; Тереньтев, 1998; Soininen et al., 1996; Cesari et al., 1998; Borisova et al., 2003).
Подавление синтеза белка в структурах головного мозга после двустороннего введения циклогексимида в хвостатое ядро
При двустороннем внутрижелудочковом введении циклогекимида в дозе 200 мкг/15-25 мкл/канюля в течение первых суток после инъекции погибло около 20% животных. В случае двукратного введения (первое - в дозе 200 мкг/25 мкл/канюля, второе (через 7 ч после первого) — 100 мкг/10 мкл/канюля) количество летальных исходов достигло примерно 40%. Однократное введение циклогексимида в дозе 400 мкг/15 мкл/канюля вызывало гибель всех животных. Подавление синтеза белка в структурах головного мозга после двустороннего введения циклогексимида в хвостатое ядро В предварительных экспериментах было обнаружено, что при использовании в качестве контроля контралатерального полушария значимого различия в счете радиоактивности между структурами двух полушарий не наблюдалось (данные не приводятся). Очевидно, это связано с тем, что в течение 1 ч молекулы ингибитора (100 мкг, 3.6 х 10"7 М) успевают проникнуть во все структуры ипси- и контралатерального полушария. В связи с этим, в дальнейших экспериментах в качестве контроля использовали другое животное того же пола, возраста и массы, которому билатерально вводили 0.9% NaCl.
Через 1 ч после двустороннего введения циклогексимида в хвостатое ядро (100 мкг/3 мкл/полушарие) во всех отделах головного мозга наблюдалось подавление синтеза белка более чем на 75% (табл. 3.1).
Несмотря на то, что наибольшее подавление синтеза белка наблюдалось в хвостатом ядре, различия между структурами были незначительными. Наряду с результатами предварительных экспериментов этот факт отражает крайне высокую диффузионную способность циклогексимида в дозах 100-200 мкг/мозг.
Подавление синтеза белка в ЦНС и печени после двустороннего введения циклогексимида в боковые желудочки
Через 2 ч после билатерального введения циклогексимида в боковые желудочки (200 мкг/15 мкл/канюля) во всех отделах головного мозга подавление достигало более 95%. При этом статистически значимых различий между структурами не наблюдалось (табл. 3.2). Учитывая этот факт и результаты предыдущих экспериментов с интрапаренхимальным введением антибиотика, демонстрирующих быстрое и широкое распространение циклогексимида в независимости от участка введения, в дальнейших экспериментах подавление синтеза белка определялось в целом головном мозге. Кроме того, с целью равномерного подавления синтеза белка не только в головном, но и в спинном мозге, объем растворителя был увеличен с 15 до 25 мкл.
Через 3 ч после двустороннего введения циклогексимида в дозе 100 мкг/25 мкл/полушарие во всех исследуемых отделах ЦНС подавление синтеза белка достигало примерно 75% (табл. 2.3). Через 3 ч после введения вдвое большей дозы (200 мкг/25 мкл/канюля) подавление превышало 95% (табл. 3.3). двустороннего введения циклогекимида в боковые желудочки в доза 100 и 200 мкг/25 мкл/канюля (среднее ± стандартная ошибка). Примечание, n = 2-3 - для опыта и контроля. - различия по двум дозам статистически значимы при р 0.001.
На рис. 3.1 представлена кинетика подавления синтеза белка в ЦНС после однократного двустороннего введения циклогексимида в дозе 200 мкг/25 мкл/канюля. В связи с результатами предыдущих экспериментов, показавшими, что при введении высоких доз антибиотика подавление синтеза белка в головном и спинном мозге значимо не различается (табл. 3.2, 3.3), данные измерений в различных отделах ЦНС были объединены. Уже через 1 ч после введения подавление синтеза белка превышало 90%. Этот уровень сохранялся в течение 4 ч. Затем наблюдалось практически линейное снижение эффекта, и через 10 ч подавление составляло примерно 40 %.
Навигационное научение в упрощенном лабиринте Морриса при постоянном и случайном положении платформы
Упрощенный лабиринт Морриса представлял собой циркулярный (диаметр 75 см) или прямоугольный (75x50 см) бассейн. Научение проводили по модифицированной процедуре (см. раздел 4.3) в одном сеансе из 6 проб. Через 48 ч проводили второй сеанс (тест на сохранение информации). Первая группа животных (n = 10) обучалась в условиях постоянного положения платформы и постоянного места погружения в бассейн. Для второй группы (n = 17) положение платформы и место погружения случайно варьировались от пробы к пробе. В связи с тем, различий между группами, обучаемыми в циркулярном и прямоугольном бассейнах, не наблюдались (данные не приводятся) данные были объединены.
Как при постоянном, так и при случайном положении платформы наблюдалось очень быстрое научение (фактически с одной пробы) и дальнейшее сокращение времени решения задачи через 48 ч (рис. 4.6). При этом по сравнению с научением в стандартном лабиринте были обнаружены следующие отличия. Во-первых, крысы находили скрытую платформу значительно быстрее. Во-вторых, различия в динамике научения между двумя группами были выражены в значительно меньшей степени (значимые различия средних значений латентных периодов между группами наблюдались только в пятой и шестой пробах первого сеанса, р 0.05).
Таким образом, при упрощении задачи за счет уменьшения диаметра бассейна как пространственная, так и непространственная стратегии, используемые животными в зависимости от условий обучения, обеспечивают практически одинаково успешное решение задачи.
Обозначения такие же, как на рис.4.1.
Предварительные исследования показали, что двустороннее внутрижелудочковое введение циклогексимида в дозе 100 мкг/15-25 мкл/канюля за 1-3 ч до научения не нарушает формирование долговременной памяти ни в тесте «выученного выпрыгивания из воды», ни при научении в стандартном лабиринте Морриса (данные не приводятся).
В связи с этим, в данной серии экспериментов мы исследовали влияние инъекции вдвое большей дозы антибиотика (200 мкг/25 мкл/канюля) за 3 ч до обучения. Здесь и далее в контроле вводили эквивалентный объем изотонического раствора NaCl. При таком режиме введения подавление синтеза белка в головном и спинном мозге превышало 90 % в течение как минимум одного часа после обучения (см. рис. 5.1). 5././. Стандартный лабиринт Морриса
Научение проводили в одном сеансе из 6 проб по разработанной нами модификации протокола (см. раздел 4.3) при постоянном положении платформы. Через 48 ч сеанс повторяли (тест на сохранение следов памяти). В контроле (n = 13) в первом сеансе наблюдалась типичная динамика научения. В сеансе сохранения происходило дальнейшее сокращение времени нахождения платформы (различия между первым и вторым сеансом в 1-й пробе статистически значимы при рО.0001, во 2-й, 4-й, 6-й пробах - при рО.01, в 3-й и 5-й пробах - при р 0.05, рис. 5.1. А). Следует отметить, что в этой группе по сравнению с интактными животными (см. рис. 4.5) соответствующие средние значения латентных периодов в первых четырех пробах сеанса обучения и первой пробе сеанса сохранения были значимо выше. Дополнительные исследования на канюлированных животных без введения физиологического раствора показали, что, скорее всего, этот факт связан только с травматическим действием самой процедуры вживления канюль (данные не приводятся).
При введении циклогексимида (п = 11) в первом сеансе по мере повторения проб время решения задачи также сокращалось (различия между 1-й и 6-й пробами статистически значимы при р 0.001). Однако, в отличие от контроля, в сеансе сохранения значимых различий значений латентных периодов по сравнению с сеансом обучения не наблюдалось (рис. 5.1. Б).
Таким образом, при научении поиску невидимой платформы в стандартном лабиринте Морриса блокада синтеза белка в ЦНС в течение одного часа после научения грубо нарушала формирование долговременной памяти, не влияя на процесс научения.
Научение проводили в уменьшенном прямоугольном лабиринте Морриса по модифицированной процедуре (см. раздел 4.4.) при постоянном положении платформы.Таким образом, при упрощении задачи в лабиринте Морриса за счет уменьшения размеров бассейна блокада синтеза белка в течение одного часа после научения перестает воздействовать на процесс формирования долговременной памяти и, как следствие, не вызывает амнезии.
В контроле (п = 14) в первой пробе (обучение) крысы после помещения в бак с водой вскоре доставали дно задними лапами и принимали вертикальное положение. Вслед за этим они начинали сканировать стенки бака, предпринимали безуспешные попытки вылезти и иногда совершали «холостые» прыжки вверх. Спустя некоторое время они решали задачу, выпрыгивая на «берег». Через 48 ч во второй пробе (тест на сохранение приобретенной информации) латентный период снижался более чем в три раза за счет значительного сокращения времени, занимаемого неэффективными движениями (ныряние, лазание вверх по гладким стенам и т.д.). Кроме того, дополнительные исследования показали, что во второй время выпрыгивания из воды на «берег» сокращается в полтора-два раза (данные не приводятся). В первой пробе среднее значение времени решения задачи составляло 71.57 ± 12.8 с, во второй пробе - 21.9 ± 3.0 с (различия статистически значимы при р 0.001, рис. 5.3. Л). В опытной группе (n = 11) в первой пробе латентный период составлял 87,18 ± 18,58, во второй пробе - 31,6 ± 13,32 (различия статистически значимы при р 0.05, рис. 5.3. Б). Между группами значимых различий не наблюдалось. Следует также отметить, что по сравнению с интактными животными (Подольский, 1996, 1997) как в контрольной, так и в экспериментальной группе значимых различий также не наблюдалось.
Таким образом, в тесте «выученного выпрыгивания из воды» блокада синтеза белка в ЦНС в течение как минимум одного часа после обучения не влияла на выработку двигательного навыка и не нарушала сохранения приобретенной информации через 48 ч.
