Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Структурная организация и связи гиппокампа 12
1.2. Роль гиппокампа в процессах памяти 26
1.3. Улучшение памяти фармакологическими
препаратами с ноотропным типом действия. 37
1.4. Изучение и поиск препаратов
с мнемотропным действием на основе
природных биологически активных веществ 44
Глава 2. Материалы и методы 52
2.1. Схема эксперимента 52
2.2. Поведенческие эксперименты 54
2.2.1. Тест «Открытое поле» 54
2.2.2. Условный рефлекс пассивного
избегания (УРПИ) 55
2.3. Методы гистологической обработки ткани мозга и морфометрического анализа 56
2.3.1. Электронно-микроскопическое исследование 56
2.3.2. Светооптическое исследование 59
Глава 3. Результаты поведенческих экспериментов 62
3.1. Тест «Открытое поле» 62
3.2. Условный рефлекс пассивного
избегания (УРПИ) 64
Глава 4. Результаты эл ектронно-микроскопич еского исследования 67
Глава 5. Результаты светооптического исследования 79
5.1. Анализ количества нейронов разных типов, отличающихся по интенсивности окрашивания ядра и цитоплазмы 79
5.1.1. Поле СА1 86
5.1.2. Поле САЗ 91
5.1.3. Зубчатая фасция 94
5.2. Анализ числа ядрышек в нейронах различных типов 104
5.2.1. Поле СА1 104
5.2.2. Поле САЗ 106
5.2.3. Зубчатая фасция 108
Глава 6. Обсуждение результатов J 15
Выводы л 24
Список литературы 126
- Структурная организация и связи гиппокампа
- Схема эксперимента
- Тест «Открытое поле»
- Анализ количества нейронов разных типов, отличающихся по интенсивности окрашивания ядра и цитоплазмы
Введение к работе
Известно, что многочисленные клинические синдромы, а также процессы старения, часто сопровождаются нарушениями памяти. Поэтому коррекция памяти является актуальной задачей при лечении этих патологий. Традиционным и эффективным подходом при коррекции нарушений памяти и обучения является использование различных психофармакологических соединений и биологически активных веществ (Бородкин, Зайцев, 1982; Izquierdo, 1984; Вальдман, 1989; Вальдман, Воронина, 1989; Buccafuso, Terry, 2000; Воронина, Серединин, 1998; Воронина, 2001 и др.).
В течение ряда лет в лаборатории эволюции механизмов памяти на Кафедре высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова проводятся исследования по изучению влияния различных биологически активных соединений на условнорефлекторную память у крыс (Прагина и др., 1990; Тушмалова и др., 1999; Прагина и др., 2003).
В основе этих исследований лежит синтез двух общебиологических подходов: эволюционно-физиологического и молекулярно-биологического (Тушмалова, Маракуева, 1986; Ашапкин и др., 1981). В результате этих комплексных исследований у животных, независимо от уровня структурной организации их нервной системы, было показано, что формирование памятного следа сопровождается однонаправленными внутриклеточными изменениями ультраструктур, свидетельствующими об активации белково-нуклеинового синтеза. К таким изменениям были отнесены агрегация рибосом в полисомы, повышение степени шероховатости эндоплазматического ретикулума, изменения в ядрышке, отражающие интенсификацию синтеза рибосомальной РНК и т.п. (Гуськова и др., 1977; Тушмалова, Маракуева, 1986). Кроме того, биохимически было обнаружено, что на фоне обучения животных условным рефлексам в различных структурах мозга, в частности, неокортексе и гиппокампе, повышается степень метилирования ДНК и индукция синтеза ДНК и РНК (Ванюшин и
7 др., 1974; Гуськова и др., 1977; Ашапкин и др., 1981). С этими результатами согласуются многочисленные электронно-микроскопические и биохимические исследования, указывающие на активацию белково-нуклеинового синтеза в мозге млекопитающих при обучении и памяти (Меерсон, 1975; Wenzel et al., 1975; Salganik et al., 1983; Levenson et al., 2006).
Индукция синтеза нуклеиновых кислот в мозге крыс обнаружена и без выработка условных рефлексов, но на фоне применения мнемотропных препаратов (пирацетама и лоразепама) (Тушмалова и др., 1991; Tewari et al., 1992). Эти данные позволили сформулировать гипотезу о влиянии различных психотропных препаратов на мозг. Согласно этой гипотезе, любые фармакологические препараты, которые усиливают процессы белково-нуклеинового синтеза в организме, могут оказывать активирующее влияние и на мозг и, таким образом, приводить к улучшению обучения и памяти (Тушмалова, 1994).
Данный подход позволяет прогнозировать ранее неизвестные мнемотропные свойства у ряда известных аптечных форм биологически активных соединений природного происхождения, используемых в медицинской практике для различных целей. Так, были спрогнозированы и подтверждены на нескольких условнорефлекторных моделях у крыс мнемотропные свойства таких препаратов, как пантогематоген, пиявит и полидан (Тушмалова, 1994; Прагина и др., 1998; Тушмалова и др., 1999; Тушмалова, Прагина, 2002). Основанием для прогноза мнемотропного действия полидана послужило то, что этот препарат является метаболитом молок осетровых рыб, который используется в онкологической практике, как стимулятор кроветворения. Полидан состоит из стандартизованной смеси натриевых солей полихлоралгидратов дериватов ДНК и РНК и проходит гематоэнцефалический барьер (Бычков и др., 1997).
В настоящей работе было проведено сопоставление влияния полидана и такого классического ноотропного препарата, как пирацетам, на память у крыс. Для этого была выбрана модель условного рефлекса пассивного
8 избегания (УРПИ), которая широко используется для доклинического изучения влияния различных веществ на процессы обучения и памяти у грызунов (Ковалев, 1990; Буреш и др., 1991; Воронина, Островская, 2000).
Известно, что гиппокамп является структурой мозга, играющей ключевую роль в механизмах обучения и памяти (Douglas, 1973; Виноградова, 1975; Пигарева, 1978; Архипов, 2004; Mizuno, Giese, 2005; и др.). Как влияет полидан на структурно-функциональное состояние нейронов в разных полях гиппокампа у животных без обучения и после выработки УРПИ - не известно. Не до конца ясен этот вопрос и в отношении пирацетама. Тем не менее, определение структурных коррелятов действия мнемотропных препаратов на мозг, и на гиппокамп в частности, является актуальной задачей как для современной нейробиологии при исследовании механизмов памяти, так и для практической медицины при лечении нарушений памяти.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в сравнительном исследовании структурно-функциональных показателей оптимизации памяти в гиппокампе крыс под влиянием препаратов с мнемотропными свойствами полидана и пирацетама. При этом ставились следующие задачи:
провести исследование влияния полидана и пирацетама на формирование у крыс условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) и поведение этих животных в открытом поле;
провести ультраструктурный анализ митохондрий и рибосомального аппарата нейронов поля САЗ гиппокампа необученных животных на фоне введения полидана и пирацетама;
изучить количественное соотношение (распределение) клеток выделенных нами типов с различной степенью метаболической активности среди пирамидных нейронов полей СА1, САЗ и клеток-зерен зубчатой фасции гиппокампа под влиянием полидана и пирацетама у обученных и
9 необученных УРПИ крыс и в соответствующих контрольных группах крыс;
4. исследовать количество ядрышек в тех же типах нейронов полей СА1,
САЗ гиппокампа и клеток-зерен зубчатой фасции в тех же группах
контрольных и экспериментальных животных.
Положения, выносимые на защиту.
Однократное введение полидана и пятикратное введение пирацетама оказывают сходное оптимизирующее влияние на сохранность памятного следа у крыс через сутки после выработки УРПИ.
Однократное введение полидана оказывает на рибосомальный аппарат и митохондрии нейронов поля САЗ дорзального гиппокампа активирующее влияние, сопоставимое с влиянием пятикратного введения пирацетама, а пятикратное введение полидана вызывает чрезмерную активацию рибосомального аппарата и митохондрий.
Изменение количественного соотношения типов нейронов, отличающихся
по интенсивности окрашивания ядра и цитоплазмы, и увеличение числа ядрышек в них отражают разную степень активации однородных популяций пирамидных нейронов в полях СА1, САЗ и клеток-зерен в зубчатой фасции гиппокампа на фоне обучения, мнемотропных препаратов и обучения на фоне мнемотропных препаратов.
5. На фоне полидана и пирацетама усиливаются синтетические процессы в
нейронах гиппокампа необученных крыс. Эти изменения являются тем
структурно-метаболическим фоном, на котором происходит улучшение
сохранения памятного следа после выработки УРПИ при применении этих
препаратов.
Научная новизна и практическая значимость. Впервые показано, что полидан, который используется в онкологической практике в качестве стимулятора кроветворения у больных после химеотерапии, оказывает активирующее воздействие на ткань головного мозга, в частности гиппокампа, и демонстрирует мнемотропный эффект, сопоставимый с
10 действием классического ноотропного препарата пирацетама. Эти данные могут послужить основой для расширения спектра терапевтического действия полидана в качестве активатора метаболизма мозга и мнемотропного препарата.
Впервые показано, что полидан активизирует синтетические процессы в цитоплазме нейронов поля САЗ гиппокампа, о чем свидетельствуют соответствующие изменения в рибосомальном аппарате и митохондриях. Однако, если при однократном введении полидана эти изменения функциональны и сопоставимы с изменениями на фоне пятикратного введения пирацетама, то пятикратное введение полидана вызывает чрезмерную активацию ультраструктур нейронов гиппокампа и, таким образом, может оказывать негативный эффект на мозг.
Разработан метод светооптического количественного анализа метаболического состояния однородных популяций нейронов в различных участках мозга. Этот метод заключается в исследовании количественного соотношения нейронов с разной интенсивностью окрашивания ядра и цитоплазмы по методу Ниссля, свидетельствующей о различной степени метаболической активности, и подсчете числа ядрышек, позволяющем оценить степень синтеза рибосомальной РНК в ядрах этих нейронов. Метод может быть использован для выявления структурных коррелятов функциональных состояний разных участков головного мозга при различных экспериментальных воздействиях.
При использовании разработанного метода впервые было показано, что, как при выработке УРПИ, так и под действием однократного введения полидана и пятикратного введения пирацетама у крыс без обучения и после выработки УРПИ в однородных популяциях пирамидных нейронов полей СА1 и САЗ гиппокампа, а также клеток-зерен зубчатой фасции, происходит усиление метаболических процессов. Степень этих изменений свидетельствует о том, что улучшение сохранности памятного следа после выработки УРПИ на фоне полидана и пирацетама связано с большим
усилением метаболической активности в поле САЗ, чем после выработки УРПИ без препаратов. В то же время, в поле СА1 и зубчатой фасции гиппокампа на фоне полидана и пирацетама наблюдается неспецифическое усиление синтетических процессов, не связанное с улучшением сохранности памятного следа.
Результаты работы могут быть использованы при чтении курса лекций в ВУЗах медицинского и биологического профиля по высшей нервной деятельности в разделах, посвященных механизмам обучения и памяти и участию в этих процессах гиппокампа.
Структурная организация и связи гиппокампа
Впервые в филогенетическом ряду животных гиппокамп появляется у круглоротых в виде primordium hippocampi, являющимся зачатком аммонова рога, который представляет собой небольшой участок в дорсомедиальной части верхнего края мозговой пластинки (Сепп, 1959). У амфибий primordium hippocampi уже составляет значительную часть мозга и образует дорсомедиальную полосу стенки полушария. Однако primordium hippocampi амфибий все еще остается малодифференцированным образованием. У рептилий область primordium hippocampi охватывает медиальную и дорсальную стенки полушария и дифференцируется на крупноклеточную и мелкоклеточную части. Крупноклеточное образование primordium hippocampi рептилий является прообразом аммонова рога, а мелкоклеточное образование - прообразом зубчатой фасции млекопитающих (Филимонов, 1959). У млекопитающих гиппокамп оказывается оттесненным на медиальную стенку полушария и вдавливается в полость бокового желудочка вследствие развития неокортекса.
Гиппокамп млекопитающих - парное образование, представляющее собой вдавливание гиппокамповой борозды в полость бокового желудочка височной области конечного мозга и являющееся центральной структурой лимбической системы мозга (Гамбарян, Коваль, 1973; Виноградова, 1975). Гиппокамп млекопитающих образует медиальную и отчасти нижнюю стенку нижнего рога бокового желудочка. Он является частью коры медиальной поверхности височной доли, изогнутой по форме нижнего рога бокового желудочка таким образом, что два его противоположных конца сближаются между собой, образуя незамкнутое кольцо (Гамбарян, Коваль, 1973).
Гиппокамп имеет слоистое строение и относится к корковым образованиям. Одни авторы причисляют его к архикортексу (Филимонов, 1949; Боголепова, 1980), другие - к палеокортексу (Brody, 1955). В настоящее время общепринятой является первая точка зрения.
Гиппокамп состоит из аммонова рога и зубчатой извилины (Резников, Назаревская, 1989). По Р. Кахалю, аммонов рог представляет собой упрощенную мозговую извилину, свободный край которой окаймлен другой более тонкой зубчатой извилиной. Плотный свободный в дорсальной части наружно-верхний край гиппокампа, спускаясь вниз, становится более диффузным, сливаясь с субикулумом, переходящим в другие участки коры головного мозга. Соответственно расположению дуги аммонова рога в нем выделяют верхнюю и нижнюю области: regio superior и regio inferior (Cajal, 1955). Более тонкие морфологические критерии позволили подразделить аммонов рог на четыре поля: СА1, СА2, САЗ и СА4 (Lorente de No, 1934). В литературе общепринято говорить о полях аммонова рога, как о полях гиппокампа. Поле СА1 соответствует большей части regio superior, поле СА2 лежит на перегибе дуги аммонова рога, поле САЗ занимает большую часть regio inferior, а поле СА4 находится внутри подковообразной дуги зубчатой извилины в районе её хилуса и рассматривается как её часть (Amaral, 1978). Поля СА1 и САЗ - наиболее обширны, и в них выделяют подполя: a, b и с. В свою очередь, зубчатая извилина подразделяется на зубчатую фасцию и хилус, включающий в себя поле СА4. На фронтальных срезах выделяют дорсальное и вентральное плечи или лимбы зубчатой извилины (Резников, Назаревская, 1989).
Структурная организация гиппокампа отличается высокой упорядоченностью. В аммоновом роге выделяют шесть слоев: stratum (str.) alveus, str. oriens, str. pyramidale, str. radiatum, str. lacunosum и str. moleculare. Str. alveus расположен на границе с эпендимой боковых желудочков. Этот слой в основном состоит из миелинизированных аксонов пирамидных нейронов гиппокампа, идущих в горизонтальном направлении. Str. oriens или восходящий слой, образован базальными дендритами пирамидных клеток аммонова рога. Также, здесь находятся начальные сегменты аксонов пирамидных клеток и несколько типов короткоаксонных нейронов. Str. pyramidale, пирамидный слой, образован телами пирамидных нейронов аммонова рога. В этом слое также встречаются корзинчатые короткоаксонные нейроны, образующие сплетения вокруг тел пирамидных клеток. Str. radiatum, лучистый или радиальный слой, образован преимущественно крупными стволами апикальных дендритов пирамидных нейронов и интернейронами. Str. lacunosum или лакунозный слой образован ветвями апикальных дендритов пирамидных нейронов и также содержит короткоаксонные интернейроны. Str. moleculare, молекулярный слой, аммонова рога образован терминальными разветвлениями апикальных дендритов пирамидных нейронов. Часто лакунозный и молекулярный слои объединяют, называя лакунозно-молекулярным слоем или str. lacunosum-moleculare (Гамбарян, Коваль, 1973; Резников, Назаревская, 1989).
Зубчатая извилина состоит из трех слоев: str. moleculare, str. granulare и str. polymorphe. Str. moleculare или молекулярный слой содержит дендриты нейронов зубчатой извилины. Str. granulare, гранулярный слой, состоит, в основном, из плотно упакованных тел гранулярных нейронов, а также содержит отростки гранулярных нейронов и интернейронов молекулярного и полиморфного слоев. Str. polymorphe или полиморфный слой содержит разнообразные типы коротко- и длинноаксонных интернейронов. Короткоаксонные нейроны либо образуют связи с другими нейронами полиморфного слоя, либо их аксоны заканчиваются на телах нейронов гранулярного слоя. Длинноаксонные нейроны формируют гомолатеральную и комиссуральную системы связей с молекулярным слоем зубчатой извилины (Резников, Назаревская, 1989).
Схема эксперимента
Тест «Открытое поле» применяли во второй серии эксперимента в следующих группах крыс: «Н+УР», «КІ+УР», «Пол1+УР», «К5+УР» и «Пир5+УР». Всех животных из этих групп за неделю до начала введения препаратов тестировали в «Открытом поле».
Повторное тестирование проводили в группе «Н+УР» - через неделю после первого тестирования, в группах «КІ+УР» и «Пол1+УР» - через час после первой и единственной инъекции, в группах «К5+УР» и «Пир5+УР» -через час после последней инъекции.
Тест проводили в квадратной камере (100x100 см) со стенками высотой 40 см. Полом служил лист черного пластика, на котором белой краской были нанесены перпендикулярные линии, делящие поле на 25 равных квадратов (20x20 см). В центре каждого квадрата было сделано отверстие (диаметр 3 см). Освещение производилось лампой 60 Вт, расположенной на высоте 150 см над центром поля. Тест проводили два экспериментатора, один наблюдал за поведением животных, второй регистрировал показатели в специальном протоколе. За поведением животного наблюдали в течение 5 минут.
В протоколе фиксировали количество пересеченных квадратов (периферических, медиальных и центральных), количество и общее время вертикальных стоек, количество и время норковых реакций, количество и время замираний животного, количество и время груминга. Тесты для всех групп проводили в одинаковое время суток.
Для статистического анализа данных использовали непараметрические критерии Манна-Уитни (сравнение разных групп) и Уилкоксона для разностей пар (внутригрупповые сравнения) с применением компьютерной программы STATISTICA. 2.2.2. Условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ)
УРПИ вырабатывали у крыс из следующих групп: «Н+УР», «К1+УР», «Пол 1+УР», «К5+УР» и «Пир5+УР». Выработку УРПИ проводили через два часа после последней инъекции препаратов и через час после повторного тестирования в «Открытом поле».
В эксперименте использовали челночную камеру (60x30x35 см), разделённую перегородкой с отверстием на два симметричных отсека. Один из отсеков был тёмный с электрифицированным решётчатым полом, а другой - прозрачный с дополнительным освещением. Процедуру выработки УРПИ проводили по стандартной методике (Любимов, 1965).
При обучении крысу помещали в светлый отсек спиной к отверстию тёмного отсека (стартовое положение). Регистрировали время (латентный период, сек) пребывания в светлом отсеке. Как только крыса переходила в темный отсек камеры, она получала электрокожное раздражение на лапы (ток 0,8 мА), заставлявшее крысу перебегать в светлый отсек. После этого крысу сразу удаляли из экспериментальной камеры.
Контрольное тестирование без подачи тока проводили через 24 часа после обучения. Животное помещали в светлый отсек установки в стартовое положение и регистрировали латентный период (сек) его пребывания в этом отсеке. Как только животное переходило в темный отсек, крысу сразу удаляли из экспериментальной камеры. Длительность латентного периода отражает степень сохранения памятного следа (Буреш и др., 1991). Если крыса не покидала светлый отсек в течение 180 сек, считали, что у нее наилучшее сохранение УРПИ.
Животных декапитировали под глубоким эфирным наркозом. Мозг быстро извлекали из черепа и разрезали по средней линии на две половины. Из правого полушария вырезали блоки дорзального гиппокампа, которые использовали для электронно-микроскопического исследования. Левое полушарие использовали для светооптического исследования.
Электронно-микроскопическое исследование
Электронно-микроскопическое исследование было проведено для групп необученных животных. Из правого полушария мозга каждой крысы иссекали фронтальный блок дорзального гиппокампа толщиной 1-2 мм, который обрабатывали по стандартной для электронной микроскопии методике (Саркисов, Боголепов, 1967). Блок фиксировали в 2,5% растворе глютарового альдегида на фосфатном буфере (рН=7,2-7,4) в течение 15 минут. Блок гиппокампа разрезали на 4-5 тонких пластин во фронтальной плоскости так, чтобы они содержали все поля и зубчатую фасцию гиппокампа. Полученные пластины погружали снова в 2,5% раствор глютарового альдегида на фосфатном буфере на 15 минут. Затем кусочки в течение 15 минут промывали в фосфатном буфере, после чего дофиксировали в течение трех часов в 1% растворе четырёхокиси осмия на фосфатном буфере по Палладу (Pallade, 1954). Блоки обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (25, 50, 70, 100) по 15 минут и контрастировали в 3% растворе уранил-ацетата на 100 спирте. Затем материал обезвоживали в течение 10 минут в 100% ацетоне. Материал погружали в аралдит (Araldit Harter HY964 и Araldit М фирмы Fluka в соотношении 1:1) без катализатора, и выдерживали в течение одних суток при температуре 37С. После этого на 3 часа образцы заливали в аралдит с добавлением катализатора (на каждые 20 мл смеси - 0,4 мл Araldit Beshleuniger 964 фирмы Fluka).
Тест «Открытое поле»
Тестированию в «Открытом поле» подвергали крыс, у которых впоследствии вырабатывали условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ). Первое тестирование проводили в группах «К1+УР», «Пол1+УР», «К5+УР» и «Пир5+УР» за неделю до начала введения препаратов. Повторное тестирование проводили через неделю после первого, причем в группах «К1+УР» и «ПолІ+УР» - через час после первой и единственной инъекции, а в группах «К5+УР» и «Пир5+УР» - через час после последней (пятой) инъекции. Первое и второе тестирование крыс из группы «Н+УР», которым не вводили препараты, проводили в те же сроки. Анализировали двигательную активность (общее количество пересеченных квадратов), исследовательскую активность (количество и время вертикальных стоек, количество и время норковых реакций), количество актов и время замираний, количество актов и время груминга.
Результаты обоих тестирований для каждой группы представлены в табл. 1. Согласно данным таблицы, во втором тестировании по сравнению с первым были отмечены следующие различия. Количество пересеченных квадратов уменьшалось во всех группах (р 0,05). Количество актов замирания увеличивалось в группах «Пол1+УР» и «Пир5+УР» (р 0,05). Время замираний увеличивалось во всех группах (р 0,05), в группе «К1+УР» р 0,1). Эти данные свидетельствовали о снижении уровня двигательной активности ко второму тестированию.
Время норковых реакций уменьшалось в группах «КІ+УР», «К5+УР» (р 0,05) и «Пол1+УР» (р 0,1 - тенденция). Количество норковых реакций также уменьшалось в группе «К1+УР» (р 0,05) и в группах «ПолНУР», «К5+УР» (р 0,1 - тенденция). Количество вертикальных стоек уменьшалось во всех группах (р 0,05), за исключением «К1+УР». Время вертикальных
Обозначения групп крыс см. в главе «Материалы и методы». стоек уменьшалось в группах «Пол1+УР» (р 0,05), «Н+УР» (р 0,05) и «Пир5+УР» (р 0,1). Таким образом, во время второго тестирования снижался и уровень исследовательской активности.
По количеству актов и времени груминга во всех группах крыс между первым и вторым тестированиями изменений не было обнаружено.
При сравнении экспериментальных групп «Пол1+УР», «Пир5+УР» с соответствующими контрольными («К1+УР», «К5+УР») статистически значимых отличий в поведении по всем исследованным параметрам не обнаружено ни в первом, ни во втором тестировании.
Таким образом, во время второго тестирования по сравнению с первым снижались показатели двигательной и исследовательской активности у всех групп животных, что свидетельствовало о привыкании крыс к обстановке в открытом поле. Введение полидана и пирацетама не оказывало влияния на изменение поведения крыс из экспериментальных групп по сравнению с соответствующими контролями.
УРПИ вырабатывали через два часа после последней инъекции препаратов у крыс из групп «Н+УР», «К1+УР», «К5+УР», «ПолІ+УР» и «Пир5+УР». Через 24 часа после выработки рефлекса у животных проверяли сохранность памятного следа. Данные по результатам тестирования представлены в табл. 2.
Согласно данным таблицы, при сравнении контрольных групп крыс «КІ+УР» и «К5+УР» с группой «Н+УР» статистически значимых отличий не обнаружено.
В группах крыс, у которых вырабатывали рефлекс на фоне введения препаратов («ПолІ+УР», «Пир5+УР») по сравнению с соответствующими контрольными группами («КІ+УР», «К5+УР») значительно увеличивалась длительность латентного периода (р 0,05), что свидетельствовало об улучшении сохранения памятного следа под влиянием полидана и пирацетама (табл.2, рис. 2).
При сравнении групп «ПолІ+УР» и «Пир5+УР» между собой статистически значимых различий не обнаружено.
Таким образом, однократное внутрибрюшинное введение стимулятора гемопоэза полидана оказывало на крыс мнемотропный эффект, что подтверждает ранее полученные данные об улучшении памяти на фоне применения этого препарата (Прагина и др., 1998; Тушмалова и др., 1999). Увеличение длительности латентного периода у крыс на фоне однократного введения полидана было сопоставимо с увеличением этого показателя на фоне пятикратного (общепринятая схема) введения классического ноотропного препарата пирацетама.
Анализ количества нейронов разных типов, отличающихся по интенсивности окрашивания ядра и цитоплазмы
Проводили количественный анализ соотношения числа нормальных нейронов различных типов (с различной интенсивностью окрашивания), а также патологически измененных (сморщенных и отечных) нейронов в полях СА1, САЗ и зубчатой фасции гиппокампа необученных и обученных УРПИ крыс из всех групп.
Среди однородных популяций нормальных пирамидных нейронов полей СА1, САЗ и гранулярных нейронов зубчатой фасции гиппокампа крыс было выделено пять типов клеток, отличающихся по интенсивности окрашивания ядра и цитоплазмы тионином с крезил-виолетом по методу Ниссля (рис. 10, 11, 12, 13, 14, 15). Различали следующие типы нейронов: с темно-синими ядром и цитоплазмой (1 тип), с синими ядром и цитоплазмой (2 тип), со светлым ядром и синей цитоплазмой (3 тип), со светлыми ядром и цитоплазмой (4 тип), с синим ядром и светлой цитоплазмой (5 тип). Нейроны 1-го типа резко выделялись насыщенным темно-синим окрашиванием ядра и цитоплазмы. Синее окрашивание ядра и/или цитоплазмы у нейронов 2, 3 и 5 типов отличалось более темным тоном по сравнению с окружающим межклеточным пространством. Рис. 10. Участок пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа крысы после однократного введения физиологического раствора (группа «К1»)
Видны нейроны разных типов с различной интенсивностью окрашивания ядра и цитоплазмы. В ядрах нейронов преимущественно по одному ядрышку (указаны стрелками). Отсутствует глия.
Типы нейронов: 1-е темно-синими ядром и цитоплазмой, 2-е синими ядром и цитоплазмой, 3 - со светлым ядром и синей цитоплазмой, 4 - со светлыми ядром и цитоплазмой. От - отечный нейрон, С - сморщенный нейрон.
Увеличение 1000. Масштаб 10 мкм. Окраска по Нисслю. Рис. 11. Участок пирамидного слоя поля СА1 гиппокампа крысы после выработки УРПИ на фоне пятикратного введения пирацетама (группа «Пир5+УР»)
Видны нейроны разных типов с различной интенсивностью окрашивания ядра и цитоплазмы. Встречаются нейроны 5 типа. В ядрах нейронов по два или три ядрышка (указаны стрелками). Много глиальных клеток (Г).
Типы нейронов: 2-е синими ядром и цитоплазмой, 3 - со светлым ядром и синей цитоплазмой, 5-е синим ядром и светлой цитоплазмой.
От - отечный нейрон, С - сморщенный нейрон. Г - глия. Увеличение 1000. Масштаб 10 мкм. Окраска по Нисслю. Рис. 12. Участок пирамидного слоя поля САЗ гиппокампа крысы после однократного введения физиологического раствора (группа «К1»)
Видны нейроны разных типов с различной интенсивностью окрашивания ядра и цитоплазмы. Много нейронов 3 типа. В ядрах нейронов преимущественно по одному ядрышку (указаны стрелками). Отсутствует глия.
Типы нейронов: 2-е синими ядром и цитоплазмой, 3 - со светлым ядром и синей цитоплазмой, 4 - со светлыми ядром и цитоплазмой. От - отечный нейрон, С - сморщенный нейрон.
Увеличение 1000. Масштаб 10 мкм. Окраска по Нисслю. Рис. 13. Участок пирамидного слоя поля САЗ гиппокампа крысы после выработки УРПИ на фоне однократного введения физиологического раствора (группа «К1+УР»)
Видны нейроны разных типов с различной интенсивностью окрашивания ядра и цитоплазмы. Много нейронов 3 типа. В ядрах нейронов - одно или два ядрышка (указаны стрелками). Наблюдаются клетки сателлитной глии (Г). Типы нейронов: 2-е синими ядром и цитоплазмой, 3 - со светлым ядром и синей цитоплазмой, 4 - со светлыми ядром и цитоплазмой. От - отечный нейрон, С - сморщенный нейрон. Увеличение 1000. Масштаб 10 мкм. Окраска по Нисслю. Видны нейроны с различной интенсивностью окрашивания ядра и цитоплазмы. Встречаются нейроны 3 и 4 типов с повышенной метаболической активностью. В ядрах многих нейронов - по нескольку ядрышек.
Типы нейронов: 2-е синими ядром и цитоплазмой, 3 - со светлым ядром и синей цитоплазмой, 4 - со светлыми ядром и цитоплазмой, 5-е синим ядром и светлой цитоплазмой. От - отечный нейрон.
Увеличение 1000. Масштаб 10 мкм. Окраска по Нисслю. Рис. 15. Участок гранулярного слоя зубчатой фасции гиппокампа крысы после выработки УРПИ на фоне однократного введения полидана (группа «Пол1+УР»)
Видны нейроны с различной интенсивностью окрашивания ядра и цитоплазмы. Большое количество нейронов 5 типа в состоянии утомления. В ядрах многих нейронов - по нескольку ядрышек. Встречаются глиальные клетки (Г). Типы нейронов: 1 - с темно-синими ядром и цитоплазмой, 2-е синими ядром и цитоплазмой, 4 - со светлыми ядром и цитоплазмой, 5-е синим ядром и светлой цитоплазмой. От - отечный нейрон.
Увеличение 1000. Масштаб 10 мкм. Окраска по Нисслю. Согласно литературным данным, типы нейронов, отличающиеся по интенсивности окрашивания, представляют собой структурно-функциональные состояния клеток с разной степенью интенсивности синтетических процессов в них (Аврущенко и др., 1990; Клещинов, 1990; Калимуллина, 2002). Сопоставляя нашу классификацию с литературными данными, можно заключить, что нейроны 1 типа являются наименее, а нейроны 3 и 4 типа - наиболее функционально активными клетками. Нейроны 2 типа находятся в состоянии относительного покоя. В результате длительных физиологических нагрузок или при адаптации нейроны 4 типа могут переходить в функционально покоящиеся нейроны 1 типа. Промежуточным состоянием такого перехода являются нейроны 5 типа.
