Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы.
Влияние межклеточных сигнальных молекул на процесс программируемой гибели клеток путем апоптоза в головном мозге 9
1.1. Роль апоптоза в поддержании тканевого гомеостаза и его молекулярные механизмы 9
1.1.1. Молекулярные механизмы апоптоза 10
1.1.1.1. Семейство цистеиновых протеаз - каспаз 11
1.1.1.2. Семейство BCL-2-подобных белков 13
1.1.1.3. Запуск программы апоптоза 17
1.2. Значение апоптоза в развитии центральной нервной системы 19
1.2.1. Эффекты модуляции экспрессии ключевых белков апоптоза на программируемую гибель клеток ЦНС методами генетической
рекомбинации 20
1.3. Влияние межклеточных сигнальных молекул на процесс апоптоза в головном
мозге 22
1.3.1. Глюкокортикоидные гормоны, ЦНС и апоптоз 23
1.3.1.1. Эффекты глюкокортикоидов в раннем онтогенезе 25
1.3.1.2. Глюкокортикоиды и апоптоз 28
1.3.2. Межнейронная сигнализация и апоптоз 31
1.3.2.1. Норадреналин, ЦНС и апоптоз 34
1.3.2.2. Эффекты адренергических препаратов на апоптоз 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1. Животные и экспериментальные воздействия 44
2.1.1. Животные 44
2.1.2. Введение гидрокортизона 44
2.1.3. Инъекция клонидина 45
2.2. Выделение образцов ткани мозга 46
2.3. Определение содержания ДНК в ткани 46
2.4. Выделение РНК 46
2.5. Определение количества мРНК каспазы-3, Вах и Bcl-XL методом полуколичественной ревертивной полимеразной цепной реакции 47
2.6. Выделение ДНК 48
2.7. Анализ фрагментации ДНК 49
2.8. Определение плотности альфа2А-адренорецепторов в мозге 50
2.9. Реактивы 51
2.10. Статистическая обработка данных 51
ГЛАВА 3. Результаты 53
3.1. Разработка метода количественной оценки фрагментации ДНК 53
3.2. Экспрессия мРНК Вах, Bcl-XL и каспазы-3 в коре и стволе головного мозга крыс в онтогенезе 55
3.3. Изменение числа клеток и уровня мРНК каспазы-3 в коре и стволе головного мозга крыс в онтогенезе 57
3.4. Влияние гидрокортизона на вес тела, мозга и надпочечников крыс в перинатальный период развития 58
3.5. Эффекты гидрокортизона на уровень мРНК Вах, Bcl-XL, каспазы-3 и на фрагментацию ДНК в развивающемся головном мозге крыс 59
3.5.1. Внутриутробный период 59
3.5.2. Неонатальный период 60
3.5.2.1. Однократное введение гидрокортизона 60
3.5.2.2. Двукратное введение гидрокортизона 61
3.5.3. Эффекты гидрокортизона на фрагментацию ДНК в головном мозге в перинатальный период развития крыс 61
3.6. Эффекты клонидина на уровень мРНК каспазы-3 и фрагментацию ДНК в развивающемся головном мозге крыс 62
3.6.1. Число мест специфического связывания альфа2-адренергических лигандов 62
3.6.2. Уровень мРНК каспазы-3 63
3.6.3. Фрагментация ДНК 64
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 65
Выводы 81
Список литературы 83
- Роль апоптоза в поддержании тканевого гомеостаза и его молекулярные механизмы
- Животные и экспериментальные воздействия
- Экспрессия мРНК Вах, Bcl-XL и каспазы-3 в коре и стволе головного мозга крыс в онтогенезе
- Эффекты клонидина на уровень мРНК каспазы-3 и фрагментацию ДНК в развивающемся головном мозге крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы. Программируемая гибель клеток путем апоптоза является фундаментальным биологическим процессом, используемым организмом для ликвидации невостребованных, закончивших свой жизненный цикл и потенциально опасных клеток. Апоптоз является неотъемлемым компонентом нормального развития и нейродегенеративных процессов в нервной системе млекопитающих (Oppenheim, 1991; Yuan, Yankner, 2000). Основными внутриклеточными регуляторами апоптоза в головном мозге млекопитающих являются антиапоптозный белок Bcl-XL и проапоптозный белок Вах (Chao, Korsmeyer, 1998; Akhtar et al., 2004). Изменение уровней мРНК этих белков и их соотношения друг к другу может отражать степень готовности нервных клеток к запуску программы апоптоза. Ключевую роль в реализации молекулярных механизмов апоптоза нервных клеток играет каспаза-3 (Kuida et al., 1996; Yuan, Yankner, 2000). Влияние межклеточных сигнальных молекул, таких как гормоны или нейротрансмиттеры, на предрасположенность клетки к запуску программы самоуничтожения, остающиеся наименее изученным аспектом проблемы, является в месте с тем одним из наиболее актуальных. Интенсивность этих сигналов изменяется под влиянием разнообразных средовых или онтогенетических факторов, поэтому их модуляция может быть использована с терапевтическими целями.
Основные события нейрогенеза и элиминация избыточных клеточных элементов в ЦНС млекопитающих происходят в фетальном и раннем постнатальном онтогенезе (Будко и др., 1985; Oppenheim, 1991; Yuan, Yankner, 2000). Перинатальный период является критическим в развитии головного мозга, когда он наиболее чувствителен к действию повреждающих факторов. Стрессорные воздействия в раннем онтогенезе вызывают долговременные изменения поведения, что, по-видимому, связано с действием гормонов стресса — глюкокортикоидов, на формирование мозга (Naumenko, Dygalo, 1980; Дыгало, 1993; Edwards, Burnham, 2001; Andrews et al., 2004; Leret et al., 2004). He только гормоны, но и другие молекулы межклеточной сигнализации —
нейротрансмиттеры, влияют на развитие мозга (Gould et al., 1999; Cameron et al.,
1998; Contestabile, 2000). Действительно и гормоны, и нейротрансмиттеры влияют
на жизнеспособность клеток мозга, по крайней мере, в патологических состояниях.
На модели неонатальной гипоксии-ишемии продемонстрировано
нейропротекторное действие дексаметазона на клетки развивающегося мозга (Liu et al., 1995; Tuor et al., 1997), вместе с тем, есть данные и о противоположном эффекте этого препарата (Hassan et al., 1996; Matthews, 2000). Нейротрансмиттеры также влияют на жизнеспособность клеток мозга. Имитатор действия норадреналина, агонист альфа2-адренорецепторов - клонидин, уменьшает область поражения неонатального мозга при ишемии (Yuan et al., 2001) и при токсическом повреждении мозга (Laudenbach et al., 2002). Однако и антагонисты этих рецепторов также снижают постишемическое поражение нервной ткани (Gustafson et al., 1990; Martel et al., 1998; Bauer et al., 2003). Наряду с очевидной противоречивостью данных об эффектах стероидных гормонов стресса и адренергических препаратов, остается совершенно неясным связано ли действие этих сигнальных молекул на формирующийся мозг с их возможным, хотя и малоизученным, влиянием на предрасположенность клетки к запуску программы самоуничтожения.
Поиск ответов на эти вопросы необходим, поскольку сигнальные молекулы гормонов и нейротрансмиттеров потенциально способны вызвать чрезмерную активацию или, наоборот, остановку программы апоптоза в развивающемся мозге, а ее сбой в период развития ЦНС может привести к изменению формирования мозга, что, в свою очередь, может быть элементом программирования свойств взрослого организма.
Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы состояла в изучении влияния межклеточных сигнальных молекул стероидных гормонов стресса -глюкокортикоидов и стимулятора альфа2-адренорецепторов - клонидина, на процесс апоптоза в развивающемся мозге крыс. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
Изучить онтогенетическую динамику уровней мРНК ключевых белков апоптоза — Вах, Всі-Xl и каспазы-3 в стволовом и фронтальном отделах головного мозга крыс;
Исследовать действие глюкокортикоидного гормона - гидрокортизона на уровень мРНК Вах, Всі-Xl и каспазы-3 и на проявление классического признака апоптоза - фрагментацию ДНК в развивающемся головном мозге крыс;
Исследовать эффекты стимуляции альфа2-адренергических рецепторов клонидином на уровень мРНК каспазы-3 и фрагментацию ДНК в развивающемся головном мозге крыс.
Научная новизна. В работе впервые установлено влияние посредников межклеточной коммуникации глюкокортикоидных гормонов и адренергических рецепторов второго типа на уровни мРНК белков апоптоза и его ключевое проявление - фрагментацию ДНК в развивающемся головном мозге млекопитающих.
Разработан простой, воспроизводимый и чувствительный метод, позволяющий количественно оценить фрагментацию ДНК в тканях, клетки которых вступают в апоптоз не синхронно, а в соответствии с собственной программой развития.
Описаны региональные особенности онтогенетической динамики уровней мРНК белков апоптоза Вах, Всі-Xl и каспазы-3 в стволе и коре головного мозга крыс. Их уровень высок в мозге плодов. Далее, в стволовой части мозга мРНК Вах увеличивается к 40 дню жизни и затем снижается, мРНК Bcl-XL достигает взрослого уровня в течение месяца, содержание транскрипта каспазы-3 снижается в 2 раза к полуторамесячному возрасту. Во фронтальной коре концентрация мРНК Вах снижается с 8 по 90 день жизни, а мРНК Bcl-XL не меняется, как и остающейся
на высоком уровне мРНК каспазы-3. Характер изменения соотношения транскриптов анти- и проапоптозного белков Вс1-2 семейства, а также уровня мРНК каспазы-3 свидетельствует о снижении в ходе онтогенеза склонности клеток ствола головного мозга к запуску программы апоптоза, в то время как клетки коры, наоборот, имеют в раннем постнатальном периоде и сохраняют до взрослого состояния более высокую, чем клетки ствола мозга, готовность к самоуничтожению.
Установлено, что последствия 6-часового воздействия гидрокортизона зависят от отдела мозга. В коре и гиппокампе гормон формирует соотношение мРНК белков апоптоза, препятствующее гибели клеток. В этих структурах повышался уровень мРНК Bcl-Хц а в коре дополнительно снижалось и содержание мРНК каспазы-3. Напротив, в стволе мозга 6-часовое воздействие гидрокортизона, как у плодов, так и у неонатальных крысят оказало проапоптозное действие: увеличивало уровень мРНК каспазы-3 и повышало фрагментацию ДІЖ. Двукратное введение гидрокортизона за 3 и 5 дней до исследования смещало соотношение уровней мРНК регуляторов апоптоза в пользу проапоптозных белков, что способно повысить предрасположенность клеток развивающегося мозга к запуску программы апоптоза.
Показано, что агонист альфа2-адренорецепторов - клонидин, индуцирует увеличение уровня мРНК каспазы-3 и повышает фрагментацию ДНК в головном мозге плодов и новорожденных крысят. Эти эффекты не проявлялись в коре мозга крысят, имеющей низкую плотность рецепторов, но были отчетливыми в стволовом отделе мозга, в котором число этих рецепторов высоко. Влияние препарата на мРНК каспазы-3 зависело от его дозы. Проявление зависимого от дозы эффекта лишь в отделе мозга, демонстрирующем пик экспрессии рецепторов, а также способность йохимбина его блокировать свидетельствует о специфичности действия клонидина на исследованные показатели апоптоза через альфа2-адренорецепторы.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы расширяют теоретические представления о влиянии межклеточных сигнальных молекул стероидных гормонов стресса и стимуляторов мембранных рецепторов
неиротрансмиттеров на предрасположенность клеток развивающегося мозга к запуску программы самоуничтожения. Кроме того, полученные данные могут иметь и определенное практическое значение, поскольку как препараты глюкокортикоидов, так и клонидин применяются в перинатальной медицине.
Апробация работы. Материалы данной работы были доложены или представлены на XXXIV, XL и XLII Международных Студенческих конференциях (Новосибирск, 2001, 2002, 2004); IV Съезде Физиологов Сибири (Новосибирск, 2002), Международном симпозиуме «Neuron Differentiation and Plasticity - Regulation by Intercellular Signals» (Москва, 2003); Международной конференции «Targeting RNA: Artificial Ribonucleases, Conformational Traps and RNA interference» (Новосибирск, 2003); 6 конгрессе IBRO (Прага, 2003); 33-м собрании общества нейронаук США (Новый Орлеан, 2003); Всероссийском съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), VII всероссийской конференции «Нейроэндокринология - 2005» (Санкт-Петербург, 2005).
По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в отечественной и одна в зарубежной печати.
Роль апоптоза в поддержании тканевого гомеостаза и его молекулярные механизмы
Молекулярные механизмы апоптоза были открыты в исследованиях нематоды Caenorhabditis elegance (Ellis, Horvitz, 1986; Hengartner, 1997; Hengartner, 2000). В ходе развития С. elegance 131 из ее 1091 соматических клеток подвергается гибели путем апоптоза (Lossi, Merighi, 2003). Были установлены четыре группы генов, продукты которых принимают участие в регуляции и реализации программы апоптоза: ced-3, ced-4, ced-9, egl-1 (Hengartner, 1997; Liu, Hengartner, 1999). Позднее был открыт ген nuc-1. Продукты генов ced-З и ced-4 ответственны за реализацию программы апоптоза, a ced-9 является "негативным" регулятором ced-З и ced-4г, тем самым, проявляя антиапоптозную активность. Белок CED-З является ключевым ферментом апоптоза, он присутствует в цитоплазме клетки в неактивном состоянии. Для активации CED-З необходим белок CED-4. CED-4 в норме связан с продуктом гена ced-9, который блокирует его проапоптозную активность (Hengartner, 1997).
У млекопитающих реализация программы ПГК осуществляется структурными гомологами белков С. elegance. К ним относятся представители семейства каспаз — гомологи CED-3 (Nicholson et al., 1995), семейства Bcl-2-подобных белков — гомологи CED-9 (Hengartner, Horvitz, 1994) и EGL-1, фактор активирующий апоптозные протеазы - Apaf-1 (apoptotic protease-activating factor-1) - гомолог CED-4 (Zou et al., 1997) и активируемая каспазой ДНКаза CAD (Caspase-Activated DNAse) - гомолог NUC-1 (Wyllie, 1998; Reed, 2000; Adams, Cory, 2002; Lawen, 2003; Danial, Korsmeyer, 2004).
Семейство цистеиновых протеаз — каспаз
Ключевыми участниками программы апоптоза являются каспазы, представляющие собой цистеиновые протеазы, специфически расщепляющие белки после остатков аспарагиновой кислоты. Каспазы синтезируются в виде предшественников - прокаспаз, с молекулярной массой 30-50 кДа, которые располагаются в клеточных компартментах и обладают незначительной протеолитической активностью: 1-2% активности зрелой каспазы. Прокаспазы состоят из трех доменов: ЫНг-терминального домена (также называемого продоменом), большой субъединицы ( 20 кДа) и малой субъединицы ( 10 кДа). Прокаспазы превращаются в каспазы в результате протеолитического расщепления на субъединицы с последующей ассоциацией большой и малой субъединиц с образованием гетеродимера. Два гетеродимера образуют тетрамер - активный фермент, с двумя каталитическими центрами (Thornberry, Lazebnik, 1998; Nicholson, 1999; Zheng et al., 1999; Chang, Yang, 2000; Hengartner, 2000; Reed, 2000; Adams, Cory, 2002; Donepudi, Griitter, 2002; Shi, 2002; Degterev et al., 2003).
В настоящее время известно 14 представителей данного семейства, которые по их роли в ПГК разделены на инициирующие и исполнительные каспазы. Для первых характерно наличие длинного N-концевого продомена, а у вторых этот домен существенно короче. У инициирующих каспаз 8 и 10 структура этого домена сходна и названа "эффектором гибели" (Death Effector Domain - DED), а сходные между собой аналогичные домены каспаз 1, 2, 4, 5 и 9 называют ассоциированным с каспазой доменом взаимодействия (Caspase-Associated Recruitment Domain -CARD). К эффекторным относятся каспазы 3, 6 и 7. Первыми на специфический сигнал ПГК реагируют инициирующие ферменты, активирующие эффекторные каспазы, которые, в свою очередь, гидролизуют различные клеточные белки, осуществляя апоптоз (Cryns, Yuan, 1998; Thornberry, Lazebnik, 1998; Nicholson, 1999; Chang, Yang, 2000; Hengartner, 2000; Zimmermann et al., 2001; Borner, 2003; Degterev et al., 2003).
Одной из основных протеаз, принимающих участие в реализации программы апоптоза, является эффекторная каспаза-3 (CPP32/Yama/Apopain) (Fernandes-Alnemri et al., 1994; Armstrong et al., 1997; Yuan, Yankner, 2000; Yakovlev et al., 2001; Liu et al., 2002). Прокаспаза-3 состоит из 278 аминокислот с молекулярной массой 32 кДа (Nicholson et al., 1995; Xue et al., 1996; Liu et al., 1997; Wang, 2000). Каспаза-3 образуется в результате гидролиза прокаспазы по остаткам аспарагиновой кислоты в положениях Asp28-Ser29 и Aspl75-Serl76 на большую 20 кДа и малую 12 кДа субъединицы, с их последующей ассоциацией. Активная каспаза-3 представляет собой гетеротетрамер (Nicholson et al., 1995; Liu et al., 1996; Namura et al., 1998; Jeon et al., 1999; Clark et al., 2000). Ген каспазы-3 располагается у человека в длинном плече 4-й хромосомы (4q34) (Bullrich et al., 1996; Tiso et al., 1996), у мышей - в центральном регионе 8-й хромосомы (Juan et al., 1996), у крыс -в 16-й хромосоме (16qll) (Earnshaw et al., 1999). Ген каспазы-3 состоит из 7 экзонов и 6 интронов и занимает приблизительно 20 кб (Juan et al., 1996).
К клеточным субстратам, которые каспаза-3 расщепляет при запуске апоптоза, относятся поли(АДФ-рибозо)полимераза (Lazebnik et al., 1994; Nicholson et al., 1995; Liu et al., 1996; Liu et al., 1997), ДНК-зависимая протеинкиназа (Liu et al., 1997; D Mello et al., 2000), ингибитор активируемой каспазами ДНКазы - ICAD (Inhibitor of Caspase-Activated DNAse) (Raff, 1998; D Mello et al., 2000), Ul связывающий 70 кДа белок (Liu et al., 1997; D Mello et al., 2000), белок связывающий стерол-регуляторный элемент (Liu et al., 1996; Liu et al., 1997; D Mello et al., 2000), белки цитоскелета: актин, альфа-спектрин (Cryns, Yuan, 1998; Earnshaw et al., 1999; Clark et al., 2000; Nath et al., 2000), Bcl-XL (Basanez et al., 2001). Кроме того, каспаза-3 активирует другие эффекторные каспазы (Rehm et al., 2002).
Природными ингибиторами каспаз (в том числе и каспазы-3) являются белки семейства IAPs (Inhibitor of Apoptosis Proteins) (Deveraux, Reed, 1999; Verhagen et al., 2001; Prunell, Troy, 2004).
Животные и экспериментальные воздействия
Плоды. В работе использовали препарат глюкокортикоидного гормона «Гидрокортизон-Рихтер» («Hydrocortisone-Richter», «Гедеон Рихтер А.О.», Венгрия, серия № А2В125А). Препарат гормона в дозе 50 мг/кг, вводили подкожно самкам крыс либо двукратно на 16-й и 18-й дни, либо однократно на 20-й день беременности. Контрольным животным аналогичным образом вводили физиологический раствор или оставляли интактными. Экспериментальных животных, получавших инъекцию гидрокортизона на 16-й и 18-й дни, забивали путем быстрой декапитации на 21-й день беременности; животных, получавших инъекцию гормона на 20-й день беременности, забивали спустя 6 часов после инъекции препарата.
Неонатальные крысята. Препарат гормона в дозе 5 мг/кг в 0.02 мл физиологического раствора вводили подкожно либо двукратно на 3-й и 5-й дни жизни, либо однократно в той же дозе на 8-й день жизни за 6 часов до забоя. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили физиологический раствор или оставляли интактными. Представители 2-х из 3-х групп крысят присутствовали в помете каждой самки. Экспериментальных животных забивали путем быстрой декапитации на 8-й день жизни.
Уровень глюкокортикоидов в плазме крови животных определяли методом конкурентного белкового связывания (Тинников, Бажан, 1984). Определение проводилось совместно с сотрудницей ИЦиГ СО РАН Булыгиной В.В.
Плоды. Клонидин —1.5 мг/кг в 5 мкл физиологического раствора («Sigma») вводился in utero в стволовую часть головного мозга 18-дневных эмбрионов крыс. Для этого самкам в состоянии глубокого нембутал ового наркоза (35 мг/кг) делали кесарево сечение. Препарат вводили, не вынимая плоды из матки, непосредственно через стенку маточной трубы. Контрольным плодам вводили эквивалентное количество физиологического раствора, либо не делали каких-либо инъекций. Представители всех трех групп плодов присутствовали в рогах матки каждой самки: 2 эмбриона получали инъекцию клонидина, 2 - инъекцию физиологического раствора, 4-6 эмбрионов не получали инъекций. После операции самки вынашивали свои плоды до 21-го дня эмбриогенеза. Экспериментальных животных забивали путем быстрой декапитации на 21-й день беременности.
Неонаталъные крысята. Клонидин - 0.1 мг/кг или 1 мг/кг в 50 мкл физиологического раствора вводился подкожно на 5-й день жизни крысят. Контрольные животные в аналогичных условиях получали эквивалентное количество физиологического раствора, либо оставлялись интактными. Представители всех 3-х групп крысят присутствовали в помете каждой самки. Экспериментальных животных забивали путем быстрой декапитации на 8-й день жизни.
Инъекция клонидина после предварительной блокады альфа.2-адренорецепторов йохимбином. Клонидин - 0.4 мг/кг в 20 мкл физиологического раствора - вводили подкожно 5-дневным крысятам, которым за 20 мин до этого также подкожно вводили либо 2 мг/кг йохимбина в 20 мкл физиологического раствора, либо вводили эквивалентное количество физиологического раствора или оставляли интактными. Животные с введением йохимбина и крысята контрольных групп через 20 мин также получали инъекцию физиологического раствора, либо оставались без введения. Экспериментальных животных забивали путем быстрой декапитации на 6-й день жизни.
У животных определяли вес тела, головного мозга и надпочечников. Головной мозг выделяли на холоду. У плодов мозг рассекали по плоскости, проходящей от эпифиза к перекресту зрительных нервов, на фронтальную и стволовую части. У крысят, выделяли гиппокамп, мозжечок, ствол, включающий задний мозг и область моста - весь блок ткани каудальнее задних бугров четверохолмия и ростральнее овального отверстия без мозжечка, а также фронтальную кору, которая включала фронтальную половину верхней поверхности полушарий толщиной 1.5-3.0 мм. Оставаясь в постоянных для всех возрастов анатомических границах, блоки ткани ствола и фронтальной коры увеличивались в массе по мере роста мозга. Образцы ткани до выделения из них тотальной РНК и ДНК хранили в металлических контейнерах при температуре жидкого азота.
Ткань мозга после взвешивания гомогенизировали в охлажденном 2 М NaCl, приготовленном на 0.05 М фосфатном буфере (рН 7.4). Аликвоты гомогената использовали для флюорометрического определения ДНК. Для определения ДНК к образцам добавляли интеркалирующий флюоресцирующий краситель Hoechst 33258 до конечной конйентрации 1 мкг/мл (Labarca, Paigen, 1980). Флюоресценсию регистрировали на волне 458 нм при возбуждающем свете 356 нм. Концентрацию ДНК в образцах рассчитывали относительно содержания ДНК в стандарте -10 мкг/мл.
Выделение РНК
Выделение РНК проводили одноступенчатым гуанидин-изотиоционатным методом (Chomczynski, Sacchi, 1987). Ткань мозга гомогенизировали в 5 объемах (относительно веса образца) охлажденного лизирующего буфера, содержащего 4 М гуанидинизотиоционат, 0.7 М цитрат натрия (рН 7.0), 10% саркозил, 2-бета-меркаптоэтанол, 2 М NaAc (рН 4.32), водонасыщенный фенол (рН 4.0), хлороформ. После 3-х минутного встряхивания смесь охлаждали в течение 15 мин, а затем центрифугировали 15 мин (9.000 g, 4С; центрифуга «Centricon Т42К», Kontron Instruments, Франция). Осаждение РНК из водной фазы проводили изопропанолом (- 20С) в течение ночи с последующим центрифугированием в течение 20 минут (18.000 g, 4С). Полученный осадок дважды промывали 75% этанолом, высушивали 96% этанолом, после чего осадок растворяли автоклавированной деионизованной водой (mQ). Раствор суммарной РНК хранили при - 60С до получения кДНК. Концентрацию РНК и степень ее очистки от белков и компонентов лизирующего буфера определяли на спектрофотометре СФ-26 при соответствующих длинах волн: 230, 260 и 280 нм (Маниатис и соавт., 1984). Целостность выделенной РНК оценивали на 1.5% агарозном гель электрофорезе.
Экспрессия мРНК Вах, Bcl-XL и каспазы-3 в коре и стволе головного мозга крыс в онтогенезе
Развитие головного мозга млекопитающих имеет каудо-ростральный градиент, и процесс физиологического апоптоза в структурах мозга, различных по срокам созревания в онтогенезе, также идет асинхронно. Предрасположенность клеток к запуску программы самоуничтожения зависит от экспрессии в них белков апоптоза. Поэтому мы исследовали онтогенетические динамики уровней мРНК белков апоптоза Вах, ВСІ-XL ИЛИ каспазы-3 в стволе и коре головного мозга крыс -структурах мозга, характеризующихся гетерохранией в их дифференцировке и пролиферации.
Вах. Уровень мРНК проапоптозного белка Вах в головном мозге крыс значительно изменяется в ходе онтогенеза (Рис. 4А). В коре головного мозга 20-21-дневных плодов уровень этого транскрипта несколько выше, чем на 40-90 дни жизни, а в стволе мозга плодов уровень мРНК Вах практически такой же, как у взрослых животных. К 5 дню после рождения содержание мРНК Вах несколько понижается в обеих исследованных структурах мозга по сравнению с пренатальным периодом. Дальнейшая динамика возрастного изменения уровня мРНК Вах имеет специфичные для каждого из исследованных отделов мозга черты. В стволе мозга происходит нарастание количества мРНК Вах с максимумом на 40-й день жизни, затем, к 90 дню его уровень достоверно снижается (F(6,i9)= 3.8; р 0.01). В коре мозга содержание этого транскрипта к 8 дню увеличивается в 1.5 раза по сравнению с 5-м днем, после чего плавно снижается к 90 дню жизни (F(6,i8) = 2.4;р 0.07).
Bcl-XL. Уровень мРНК антиапоптозного белка Bcl-XL в коре и стволе головного мозга крыс в онтогенезе представлен на рисунке 4Б. В коре головного мозга 20-21-дневных плодов крыс уровень этого транскрипта практически такой же, как и у 90-дневных животных. Следует отметить, что достоверных изменений количества мРНК ВСІ-XL В этом отделе мозга не удалось выявить на протяжении всего исследованного периода онтогенеза ( 6,ы)= 1 24; р 0.35). В стволе головного мозга плодов уровень мРНК Bcl-XL составлял лишь около 75% от взрослого уровня этого транскрипта. После рождения содержание мРНК Bci-XL в стволе мозга к 5 дню жизни уменьшается по сравнению с эмбриональным периодом, после чего наблюдается нарастание вплоть до 40-го дня жизни и далее уровень этого транскрипта не изменяется, по крайней мере, до 3-х месячного возраста (F g) = 4.35;р 0.01).
Bcl-Xi/Bax. Соотношение уровней мРНК антиапоптозного белка Bcl-XL к проапоптозному белку Вах в коре и стволе головного мозга крыс в онтогенезе представлены на рисунке 4В. Соотношение мРНК Всі-Хь/Вах в стволе головного мозга составляло 0.5-0.8 у плодов и пятидневных крысят, с 8-го по 40-й день жизни оно было около единицы, а к 90-му дни жизни это соотношение увеличивалось до полутора. В коре головного мозга в период с конца внутриутробного развития и в течение первых 3-х недель жизни соотношение мРНК Bcl-XL/Bax составляло всего 0.1-0.5, и далее оно постепенно возрастало примерно до единицы к 90 дню жизни.
Каспаза-3. Уровень мРНК каспазы-3 в головном мозге крыс в раннем онтогенезе претерпевает значительные изменения (Рис. 5А). В перинатальный период, как в коре, так и в стволе головного мозга крысят, мРНК каспазы-3 находится на высоком уровне, однако дальнейшая ее динамика в этих структурах различна. В стволе головного мозга к окончанию периода вскармливания происходит снижение уровня этого транскрипта в 1.5, а к 40 дню жизни — более чем в 2 раза (F(5,28) = 5.64; р 0.001). В коре же головного мозга уровень мРНК каспазы-3 остается относительно высоким до 24-го дня жизни, более того, он практически не изменяется и к полуторамесячному возрасту (F(5 27) - 2.11; р 0.09). Таким образом, матричная РНК каспазы-3 на высоком уровне находится в головном мозге перинатальных крысят. В коре головного мозга высокий уровень мРНК каспазы-3 сохраняется и к полуторамесячному возрасту, в то время как в стволе ее уровень снижается по мере взросления крысят.
В стволе головного мозга крыс в период с 20-го дня эмбриогенеза до полуторамесячного возраста изменения числа клеток, судя по содержанию ДРІК в этой структуре, практически не происходит (Рис. 5Б, F(5,27)= 0.54; р 0.716). Однако уровень мРНК каспазы-3 в стволе мозга в течение первых 40 дней жизни животных снижается. Таким образом, снижение уровня мРНК каспазы-3 происходит на фоне практически постоянного количества клеток.
Эффекты клонидина на уровень мРНК каспазы-3 и фрагментацию ДНК в развивающемся головном мозге крыс
Апоптоз является неотъемлемым процессом нормального развития нервной системы млекопитающих (Oppenheim, 1991; Burek, Oppenheim, 1996; Mazarakis et al., 1997; D Sa-Eipper, Roth, 2000; Meier et al., 2000; Sastry, Rao, 2000; Yuan, Yankner, 2000; Heidenreich, 2003; Sun et al., 2003; Becker, Bonni, 2004). В ходе ее формирования апоптозу подвергается более половины закладывающихся нейронов головного мозга (Oppenheim, 1991; Mazarakis et al., 1997; Ham et al., 2000; Sendtner et al., 2000; Yuan, Yankner, 2000; Krajewska et al., 2002). Наиболее интенсивно элиминация клеток в нервной системе грызунов происходит в период эмбриогенеза и первую неделю жизни, завершаясь стабилизацией их числа и связей между ними (Oppenheim, 1991; D Sa-Eipper, Roth, 2000; Yuan, Yankner, 2000; D Sa-Eipper et al., 2001). Отличительной чертой клеток, реализующих программу апоптоза, является гидролиз геномной ДНК по межнуклеосомным сайтам на фрагменты кратные 180-200 пн (Wyllie, 1980; Wyllie et al, 1980; Schwartzman, Cidlowski, 1993; Roth, D Sa, 2001; Wang, 2001; Norbury, Zhivotovsky, 2004). Присутствие в ткани фрагментированной ДНК является надежным подтверждением программируемой гибели ее клеток и широко используется как качественный показатель апоптоза (Eldadah et al., 1996; Hacker, 2000).
В большинстве работ, посвященных изучению гибели нервных клеток, исследователи индуцируют массированный апоптоз, как правило, в системе in vitro, и обычно мощными стимулами, например, переносом культуры в среду, лишенную факторов роста (Deckwerth et al., 1996), ионизирующей радиацией (Michelin et al., 2004) или нарушением клеточного гомеостаза Са2+ (Nutt et al., 2002). Работы такого рода позволяют моделировать элементарные сигнальные события, приводящие большую часть исследуемой популяции гомогенных клеток к одновременной гибели. Фрагменты ДНК, возникающие при массированном апоптозе в системе in vitro, образуют на электрофорезе характерную лестницу, хорошо видимую после окраски геля бромистым этидием (Wyllie, 1980; Wyllie et al., 1980; Schwartzman, Cidlowski, 1993; Wyllie, 1998; Wang, 2001; Norbury, Zhivotovsky, 2004). В системе in vivo, для которой элиминация избыточных клеток является нормой, клетки вступают в апоптоз не одновременно, например, в развивающемся мозге (Yakovlev et al., 2001), поэтому определение интенсивности программируемой гибели клеток по присутствию фрагментированной ДНК затруднено, так как оно требует количественной оценки при низкой в каждый конкретный момент активности процесса. В пределах одного региона формирующегося мозга только 2-5% клеток реализуют программу гибели одновременно, хотя в день целых 25% клеточной популяции может погибнуть путем апоптоза (White, Вагопе, 2001).
Выявление физиологического апоптоза на гистологических срезах, основанное на детекции свободных гидроксильных концов, возникающих при гидролизе ДНК, путем включения в эти места специфическим ферментом -концевой дезоксинуклеотидилтрансферазой меченых нуклеотидов — TUNEL-анализ, обнаруживает всего несколько - три-пять меченых клеток на 100 немеченых (Machaalani, Waters, 2003). На срезе ткани представлено ограниченное количество клеток, при этом апоптозных клеток среди них может не быть. Такая частота даже при двукратном увеличении интенсивности апоптоза делает статистическую оценку эффекта проблематичной. Кроме того, концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза маркирует любые разрывы ДНК, в том числе и репарируемые, что при высокой интенсивности деления клеток развивающегося мозга также снижает точность TUNEL-анализа.
Для преодоления затруднений, связанных с количественным определением фрагментации ДНК гистологическими методами в системах с низкой интенсивностью процесса апоптоза, в работе предложен метод количественной оценки фрагментации ДНК, основанный на использовании всей популяции клеток исследуемой структуры мозга. Оценкой интенсивности программируемой гибели клеток в методе является индекс фрагментации ДНК. Содержание ДНК в клетке является постоянной величиной, следовательно, увеличение в образце ткани фрагментации ДНК свидетельствует об увеличении количества апоптозных клеток. Таким образом, индекс фрагментации ДНК отражает количество клеток, запустивших программу гибели. Этот показатель оказался достаточно чувствительным для оценки интенсивности физиологического апоптоза в ходе раннего развития в тканях, клетки которых вступают в процесс программируемой гибели асинхронно. Так, если в нормальных условиях у взрослых животных программируемая гибель клеток мозга практически не происходит (White, Вагопе, 2004) то закономерно, что и выделенные из их ткани образцы ДІЖ не содержат фрагментов. Напротив, выявленное предложенным методом наличие фрагментированной ДНК в мозге плодов, которых не подвергали каким-либо воздействиям, является очевидным следствием естественной физиологической гибели клеток в головном мозге крыс в пренатальный период (Oppenheim, 1991; D Sa-Eipper, Roth, 2000; Kuan et ah, 2000; Yuan, Yankner, 2000; D Sa-Eipper et ah, 2001). Предлагаемый метод оценки фрагментации ДНК обладает высокой чувствительностью (предел чувствительности данного метода составляет 2%) и позволяет обнаружить увеличение количества фрагментированной ДНК в мозге плодов крыс даже в результате относительно слабого стресса, перенесенного их матерями, или введения им гидрокортизона. Использование внутренней для каждого образца калибровки - расчет индекса фрагментации ведется относительно присутствующей в нем высокомолекулярной фракции ДНК, придает предлагаемому методу важное достоинство - независимость получаемой с его помощью оценки фрагментации ДНК от ее количества, взятой в анализ, в достаточно широком диапазоне. Коэффициент вариации, отражающий воспроизводимость этого метода, составляет 12-15%. Предложенный метод количественного определения фрагментации ДНК прост, чувствителен, дает воспроизводимые результаты, позволяет оценить фрагментацию ДНК в тканях, клетки которых вступают в апоптоз асинхронно, и, поэтому, делает возможной оценку фрагментации ДНК в формирующемся мозге при относительно слабых воздействиях, не вызывающих массированной гибели его клеток, и даже при физиологическом апоптозе.
