Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 11
1. Неиротензин и его функциональное значение в ЦНС 11
1.1. Нейротензип 11
1.2. Рецепторы нейротензина 12
1.3. Механизм действия нейротензина 14
1.4. Функциональное значение нейротензина в среднем мозге 16
1.5. Функциональное значение нейротензина в стриатуме 20
1.6. Влияние нейротензина на поведение и двигательную активность 23
2. Серотонин и его функциональное значение в ЦНС 27
2.1. Серотонин 27
2.2. Рецепторы серотонина 30
2.3. Функциональные особенности серотонинергических нейронов 33
2.4. Поведенческие эффекты серотонина 36
2.5. Участие серотонина в психоэмоциональных расстройствах 39
2.6. Функциональное значение взаимодействия серотонинергических и нейротензинергических структур мозга 42
3. Механизмы стресса 48
3.1. Стадии развития стресса 48
3.2. Формирование стресс-реакции 51
3.3. Некоторые аспекты стрессовых ситуаций 56
Структура и методы исследования 63
1. Изучение поведенческих реакций 63
2. Хирургические операции вживления направляющих канюль в мозг крыс 64
3. Повреждение серотонинергических нейронов дорсального ядра шва 65
4. Изучение влияния внутримозговых микроинъекций нейротензина на поведение крыс после иммобилизации 65
5. Изучение влияния введения 5-окситриптофана на
Поведение крыс после иммобилизации 67
6. Болевая электрическая стимуляция, как стрессогенный фактор 67
7. Биохимическое исследование содержания биогенных аминов и их метаболитов в структурах мозга 68
8. Морфологический контроль 69
9. Статистическая обработка результатов 73
1. Поведенческие эффекты иммобилизации и их коррекция 73
1.1. Влияние введения nt в ncdмозга крыс па поведенческие эффекты иммобилизации 73
1.2. Влияние введения nt в sn мозга крыс на поведенческие эффекты иммобилизации 83
1.3. Влияние инъекций 5-нтр на поведенческие эффекты иммобилизации 92
2. Поведенческие эффекты болевой стимуляции и их коррекция 95
2.1. Двигательные реакции пассивного избегания у контрольных крыс и крыс с повреждением 5-нт нейронов drn 95
2.2. Влияние микроинъекций nt на двигательные реакции пассивного избегания и поведение крыс в «открытом поле» 96
3. Содержание серотонина и его метаболита, 5-Оксииндолуксусной кислоты в хвостатых ядрах и Гипоталамусе 100
Обсуждение результатов 107
1. Роль 5-нт структур мозга в механизмах последействия иммобилизационного и болевого стресса 107
2. Роль в нормализации поведения крыс после иммобилизационного стресса 110
3. Влияние введения неиротензина на поведение крыс после болевой стимуляции 115
Выводы 118
Литература 120
- Неиротензин и его функциональное значение в ЦНС
- Функциональное значение нейротензина в среднем мозге
- Функциональные особенности серотонинергических нейронов
- Повреждение серотонинергических нейронов дорсального ядра шва
Введение к работе
Актуальность исследования
В последние годы интенсивно исследуются нейрофизиологические механизмы, лежащие в основе индивидуальной устойчивости и предрасположенности к развитию патологических последствий стресса. Для изучения механизмов эмоционального стресса и поиска возможности направленной коррекции стрессорных расстройств используют методы индукции стрессорных состояний у животных. Наличие эмоционального фактора практически при всех нарушениях гомеостаза позволяет исследователям использовать физические (часто болевые) воздействия при индукции острого эмоционального стресса у животных. Иммобилизация также является одним из стрессогенных факторов. При резком ограничении двигательной активности обнаружены глубокие морфологические и функциональные изменения в структурах головного мозга (Семенченко, 1989), биохимические изменения в ЦНС (Венков и др., 1984; Панушева, Доведова, 1985). Воздействие стрессовой ситуации на индивид часто зависит от того, можно ли контролировать стрессорный фактор. Показано, что неуправляемые стрессоры имеют большее отрицательное воздействие на поведение по сравнению с управляемыми (Maier et al, 1993). В результате многих исследований, направленных на понимание нейронной основы поведенческих и физиологических эффектов неконтролируемых стрессоров, стала очевидной роль ряда нейромедиаторов, в том числе дофамина и серотонина в развитии и выражении такого рода эффектов. Показана также важность участия в этих процессах таких областей мозга, как дорзальное ядро шва, гипоталамус, кора и др. (Maswood et al, 1998).
Одним из негативных синдромов, возникающих в условиях эмоционально-стрессовых состояний, является тревожность. К настоящему моменту, потенциальная роль серотонина в развитии тревожности является предметом множества исследований. Существует гипотеза о двойственной роли
серотонина, согласно которой он увеличивает тревожность, действуя на структуры переднего мозга, но подавляет аверсию через действие в дорзальном околоводопроводном сером веществе (dPAG) (Graeff, 2002). Большой интерес к роли серотонина в формировании и развитии тревожности связан также с тем, что препараты, которые усиливают 5-НТ функцию, действительно эффективны при лечении тревожных расстройств (Argyropoulos et al. 2000).
Особая роль отводится серотонину дорзального ядра шва (DRN). Maier и др. (1993) получили важные данные о том, что предъявление животным неконтролируемого стрессора, в частности, неизбегаемого болевого воздействия, резко увеличивает активность серотонинергических нейронов в DRN. Дальнейшие исследования показали, что повышенная активность серотонинергических нейронов DRN, по-видимому, необходима и достаточна, чтобы вызвать поведенческие и физиологические эффекты неконтролируемых стрессоров. В то же время, показано (Dilts, 1996), что увеличение обмена серотонина, вызванное предъявлением крысам вызывающих стресс стимулов, блокируется введением регуляторного нейропептида нейротензина. Эти данные указывают на возможную роль эндогенного нейротензина в регуляции активности серотонинергических нейронов.
Неиротензин привлекает внимание исследователей в связи со своими нейролептическими свойствами, схожими со свойствами атипичных нейролептиков (Sharma et al., 1997). Он обладает способностью оказывать влияние на различные аспекты адаптивного поведения: на мотивационные, эмоциональные, двигательные, а также участвует в механизмах подкрепления. В последнее время высказывается предположение об анксиолитических свойствах нейротензина (Шугалёв с соавт., 2003)
Приведённые данные позволяют сделать предположение о том, что взаимодействие неиротензин- и серотонинергическои систем мозга имеет важное значение для повышения адаптивной функции мозга в условиях стрессовой ситуации. Изучение механизмов этого взаимодействия будет
способствовать созданию новых стресс-протекторных средств, структурно близких к биохимическим регуляторам организма.
Цель исследования
Основной целью исследования являлось выяснение значения взаимодействия неиротензин- и серотонинергических систем мозга для обеспечения различных форм адаптивного поведения после перенесённых животными стрессорных воздействий. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
изучить влияние иммобилизационного и болевого стресса на поведение крыс с повреждением и без повреждения серотонинергических нейронов дорзального ядра шва;
выявить влияние локального введения нейротензина в образования нигростриатной системы мозга (хвостатые ядра и чёрную субстанцию) на поведенческие эффекты стрессорных воздействий у крыс с повреждением и без повреждения серотонинергических нейронов дорзального ядра шва;
провести сравнительный анализ влияния нейротензина на уровне чёрной субстанции и дорзального ядра шва мозга на поведенческие эффекты болевого воздействия;
4) провести биохимический анализ содержания серотонина и его
метаболита, 5-оксииндолуксусной кислоты (5-НІАА), а также
катехоламинов в хвостатых ядрах и гипоталамусе мозга крыс после
инъекций нейротоксина и нейротензина.
Научная новизна работы
Впервые показано нормализующее влияние микроинъекций нейротензина в хвостатые ядра и чёрную субстанцию мозга крыс с повреждением серотонинергических нейронов на поведение животных в условиях последействия стрессорных факторов. Проведено определение содержания серотонина, его метаболита (5-НІАА), а также катехоламинов в хвостатых ядрах и гипоталамусе мозга крыс после внутримозговых инъекций NT и нейротоксина, 5,7-дигидрокситриптамина (5,7-DOT).
Теоретическое значение работы
Полученные данные дополняют сведения о действии нейротензина, как регуляторного пептида. Обнаружена важное значение нейротензина на уровне образований нигростриатной системы мозга для механизмов адаптации животного к неблагоприятным воздействиям в условиях дефицита функции серотонинергических нейронов. Установлено, что регуляторное действие нейротензина в значительной степени связано с нормализацией мотивационно-эмоционального состояния животных.
Практическое значение работы
Изучение механизмов взаимодействия нейротензин- и
серотонинергических систем мозга в условиях последействия стрессорных факторов может иметь важное значение для разработки новых стресс-протекторных средств, структурно близких к биохимическим регуляторам организма человека. Поведение животных с повреждением серотонинергических нейронов дорзального ядра шва в указанных условиях может служить экспериментальной моделью для тестирования новых психотропных, в частности, анксиолитических препаратов.
Положения, выносимые на защиту
Дефицит функции серотонинергических нейронов приводит к усилению стрессорного воздействия иммобилизации и болевой стимуляции.
На уровне образований нигростриатной системы мозга нейротензин оказывает протекторное действие на животных с дефицитом функции серотонинергических нейронов в условиях эмоционального стресса.
Поведенческие эффекты нейротензина в значительной степени объясняются его нормализующим влиянием на мотивационно-эмоциональное состояние животных.
4. Разнонаправленный характер влияния нейротензина на разных
уровнях мозга обеспечивает поддержание баланса взаимодействия
дофамин- и серотонинергических систем мозга в механизмах регуляции адаптивного поведения. Апробация диссертации Основные результаты были доложены на Всероссийской конференции «Пластичность и структурно-функциональная взаимосвязь коры и подкорковых образований мозга» ГУ НИИ мозга РАМН,Москва, 2003; международных чтениях, посвященных 100-летию Э.А.Асратяна «Фундаментальные и клинические аспекты интегративной деятельности мозга», ИВНД и НФ РАН, Москва, 2003; XIX съезде физиологического общества им. И.П.Павлова, Екатеринбург, 2004; Всероссийской конференции «Механизмы синаптической передачи» ГУ НИИ мозга РАМН, Москва, 2004; The 8th ECNP Regional Meeting Moscow, Russia, April 14-16, 2005; Первом Международном Междисциплинарном конгрессе «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии», Судак, 2005; научной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты», ГУ ИБХ РАН им. М.В.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва, 2005; Учёном Совете ГУ НИИ мозга РАМН, Москва, 2005; научной конференции ГУ НИИ мозга РАМН, 2005; 4-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 2006.
Объём и структура диссертации
Работа изложена на 138 страницах и содержит 29 иллюстраций, 2 таблицы. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов исследования, полученных результатов и их обсуждения, выводов. Список литературы содержит 174 источника.
Неиротензин и его функциональное значение в ЦНС
Нейротензин взаимодействует с моноаминергическими системами на анатомическом, физиологическом и поведенческом уровнях (Kasckow, Nemeroff, 1991). Возможное влияние нейротензина на дофаминергическую (DA) передачу в нигростриатных и мезокортикальных проводящих путях и NT-DA взаимодействия были темой многих исследований, которые предполагали роль NT в патофизиологии некоторых расстройств центральной нервной системы, включая болезнь Паркинсона и шизофрению (Rostene et al, 1992; Lambert et al, 1995). Тесные анатомические и функциональные связи нейротензин- и DA структур инициировали исследования роли NT системы в злоупотреблении лекарственными препаратами. 1.1. Нейротензин
Нейротензин - эндогенный тридекапептид (pGlu-Leuyr-Glu-Asn-Lys-Pro-Arg-Arg-Prory-Ile-Leu-OH), был обнаружен Carraway и Leeman в гипоталамусе быка в начале 1970-ых, в 1988 был выделен ген NT у крысы и определена его последовательность. Ген кодирует 170-аминокислотный белок-предшественник, содержащий как тридекапептид NT, так и тесно связанный с ним гексапептид нейромедин N (NN). Очень важным для дальнейших исследований явилось обнаружение того факта, что только последние шесть аминокислот нейротензина, а именно NT (8-13) (Arg8-Arg9-Prol0yrll-Ilel2-Leul3), необходимы и существенны для биологической активности. Это тем более удивительно, что NT (8-13) не является одним из фрагментов, получаемых in vivo при распаде NT (Tyler-McMahon et al, 2000). С тех пор этот пептид был предметом множества работ, детализирующих сведения, связанные с его активностью, рецепторами, локализацией, синтезом и взаимодействием с другими системами. NT обнаружен в центральной нервной системе (ЦНС), а также в желудочно-кишечном тракте. NT демонстрирует мощные центральные эффекты, включая гипотермию, антиноцицепцию, модуляцию нейротрансмиссии дофамина и стимуляцию секреции гормонов переднего гипофиза. Периферически NT действует как паракринный и эндокринный пептид и в пищеварительной, и в сердечно-сосудистой системах. К тому же есть свидетельство, подтверждающее роль NT в росте нормальных и злокачественных клеток.
Для того, чтобы проявить свои эффекты в ЦНС, NT должен быть введён непосредственно в мозг. Это вызвано тем, что при системном введении он быстро разлагается протеазой и, кроме того, нейротензин не проходит через гематоэнцефалический барьер.
В одном из первых сообщений об эффектах прямого введения NT в мозг был описан его сильный гипотермический эффект у разных млекопитающих. Затем появились данные том, что NT был единственным из 48 протестированных нейропептидов, который потенциировал гипотермию и наркоз, вызванный фенобарбиталом. Следующим значимым эффектом центрально введённого NT является его сильное антиноцицептивное действие. Важно, что NT-индуцированная антиноцицепция не опосредована через опиоидную систему. Многие физиологические эффекты NT подобны эффектам атипичных нейролептиков (Kinkead, Binder et al, 1999). В нейронах NT хранится в плотных внутренних везикулах и высвобождается в Са - зависимой манере. NT-трансмиссия заканчивается, в первую очередь, расщеплением NT несколькими пептидазами, включая нейтральную эндопептидазу. В тканях мозга период полураспада нейротензина составляет приблизительно 15 минут (Chekler et al, 1986).
В настоящее время известны и охарактеризованы три рецептора для NT в ЦНС: рецептор с низким сродством к NT (NTRL или Nb), который также связывает антагонист гистаминового Нг рецептора левокабастин (Chalon et al, 1996; Vita et al, 1998), левокабастин-нечувствительный рецептор с высоким сродством к NT (NTRH или NTi) (Tanaka et al, 1990; Vita et al, 1993), и третий рецептор NT (NTR; NT3), который расположен внутриклеточно и был идентифицирован как gp95/copiHH (Mazella et al, 1998; Zsurger et al, 1994). Несмотря на то, что есть выраженная гомологичность и идентичность между NTi и NT2, существуют также значительные межвидовые различия. У крыс были идентифицированы видоспецифичные модифицированные агонисты пептида со 100-кратно более высокой аффинностью к NTi, чем у человека.
Заслуживает внимания тот факт, что NT может действовать и как агонист и как антагонист NT2. В тех случаях, когда NT действует как антагонист, и левокабастин и SR4869 (низкомолекулярный NTi антагонист) действуют как агонисты рецептора (Yamada et al, 1998), а в других случаях NT, NN и левокабастин действуют как антагонисты, a NTR антагонисты SR142948A и SR48692 действуют как агонисты (Bono et al, 1998; Vita et al, 1998).
И NTi и NT2 являются G-протеин связанными рецепторами с типичной 7-трансмембранной конфигурацией. Хотя не до конца ясно, с какими системами вторичных посредников NTRs ассоциируются in vivo, активация NTR не только приводит к активации путей вторичных посредников, но также изменяет аффинность DA рецепторов посредством аллостерических рецептор/рецептор взаимодействий и модулирует экспрессию гена через интернализированный NT-NTR комплекс.
NT3 является аминокислотным рецептором 1-го типа с единственной трансмембранно-связывающей областью (Mazella et al, 1998). NT3 расположен на клетках глии, нейронах и адипоцитах (Morris et al, 1998). NT3 возможно вовлечен в модуляцию сигнала прекращения NT, способствуя его захвату и деградации (Mazella et al, 1998,2001; Navarro et al, 2001).
Функциональное значение нейротензина в среднем мозге
Как отмечено выше, NT наиболее тесно связан с DA нейронами. От 80 до 90% всех DA нейронов обнаружены в среднем мозге (рис. 1). Существуют три DA ядра среднего мозга: substantia nigra pars compacta (SNc) и pars lateralis (SNl) (=A9), ventral tegmental area (VTA) (=A10) и retrorubral field (RRF) (=A8). Эти нейроны дают начало нигростриатной и мезокортиколимбической DA-проекционным системам. Тела клеток нигростриатной DA системы расположены в SNc и RRF и проецируются в стриатум - caudate/putamen (CdPu). Тела DA клеток в SNI проецируются прежде всего к миндалине. DA нейроны среднего мозга отличаются не только своими проекционными полями, но также и входами, которые они получают, рецепторами, которые они экспрессируют и неиропептидами, с которыми они колокализуются. Тела NT клеток в среднем мозге неравномерно распределены между SNc и VTA DA системами. В отличие от большого числа NT-позитивных клеток в VTA, в SNc, SN1, и RRF обнаружено совсем немного NT-позитивных клеток (обнаруженные NT нейроны в SNc расположены главным образом в его медиальных отделах). Интересно, что малочисленные NT нейроны, обнаруженные в SNc не колокализуют ТН (Seroogy et al, 1988). В подавляющем большинстве NT-позитивных клеток в VTA колокализуются ТН и нейропептид холецистокинин (ССК), однако, NT/DA/CCK нейроны представляют лишь небольшую фракцию DA-ергических клеток. Было показано, что эти смешанные NT/DA нейроны проецируются в префронтальную кору (PFC), энторинальную кору (ERC), NAcc, базолатеральное ядро миндалины и латеральную перегородку (LS). NT/DA проекции накладываются на мезокортиколимбические DA проекции, за исключением центрального ядра миндалины и центральной части NAcc, где вообще нет смешанных проекций (Asan, 1998).
Подавляющее большинство DA нейронов в VTA и SNc экспрессирует NTRs, с преобладанием NTi-подтипа, и от 80 до 95% NTRs среднего мозга экспрессируются на DA-ергических нейронах (Nicot et al, 1995; Fassio et al, 2000). Оставшиеся NTRs найдены на He-DA-ергических аксонных терминалях, таких как GABA-ергические стриатонигральные проекции, и на глиальных клетках (Boudin et al, 1998). NTi иммунореактивные нейроны также расположены в RRF, ретикулярной части SN и, в меньшей степени, в SNI (Fassio et al, 2000).
Из NT терминален, контактирующих с DA-ергическими, не-DA-ергическими и смешанными DA/NT клетками в среднем мозге, фактически только небольшая часть проявляет синаптическую специализацию. Тем не менее, 60% NT терминалей находятся в пределах 5 мкМ DA клеток, что позволяет NT действовать на DA клетки посредством паракринной трансмиссии. Эти рецепторы не сгруппированы напротив нервных терминалей, а более или менее равномерно распределены по перикарию и дендритам DA клеток (Fassio et ai, 2000), поддерживая паракринную передачу сигналов и/или высвобождение на дендритах, как главный способ NT нейротрансмиссии в мезенцефалоне.
В пределах физиологических концентраций, NT противодействует DA аутоторможению и вызывает медленную, длительную деполяризацию (Wu et al, 1995; Chien et al, 1996; Farkas et al, 1996). В слегка повышенных концентрациях, NT увеличивает и длительность, и скорость спонтанного разряда DA нейронов среднего мозга, увеличивая, таким образом, общую возбудимость DA нейронов. В значительно более высоких, потенциально патологических или терапевтических концентрациях, NT вызывает инактивацию деполяризации. Следовательно, физиологически NT, возможно, действует преобладающе как нейромодулятор, способствуя эффектам тех нейромедиаторов, которые возбуждают DA нейроны (например, глутамат и ССК) и противодействуя DA аутоторможению. В действительности, данные in vitro и in vivo исследований заставляют думать, что NT ответ зависит от влияния внешних афферентов.
DA нейроны в VTA и SN показывают различные пороги NT-индуцированной деполяризации (Werkman et al, 2000) и инактивации деполяризации; NT имеет больший эффект в VTA чем в SN. Различная чувствительность DA проекций среднего мозга к NT возможно отражается в количественных различиях высвобождаемого DA в подобластях NAcc. Однако, в основном, в пределах VTA NT увеличивает высвобождение DA и/или концентрации основных DA метаболитов HVA и DOPAC (Ford, Marsden, 1990; Sony et al, 1998, 2000). По разным данным, NT введенный в SN либо увеличивает DA, DOPAC и HVA и в хвостатом ядре, и в бледном шаре, либо не действует на стриатный DOPAC (Ford, Marsden, 1990). Эти противоречивые результаты, возможно, объясняются сходным региональным градиентом ответа на NT в SN.
Функциональные особенности серотонинергических нейронов
Как известно, 5-НТ ингибирует первичные сенсорные нейроны в переднем мозге. К настоящему моменту изучена большая часть основной нейрофизиологии 5-НТ нейронов в различных ядрах шва ствола мозга -dorsalis (DRN), medianus (NRM), magnus (MRN) и pallidus (NRPa). Нейроны являются аутоактивными, разряжающимися в стереотипной, почти точной, как часы, манере, со частотой 1-5 в сек. Описаны мембранные свойства нейрона, которые сопровождают эту медленную правильную активность наличие ионных токов и опосредующих её каналов. Эти основные нейрональные свойства, по крайней мере у крыс, проявляются в раннем развитии (3-4 пренатальные дни). Наконец, существует механизм отрицательной обратной связи, который ограничивает 5-НТ нейрональную активность. Когда активность увеличивается и 5-НТ высвобождается локально из дендритов или аксонных колатералеи, этот механизм действует на соматодендритные 5-НТ "ауторецепторы", чтобы затормозить нейрональную активность. Механизм функционирует только при физиологических условиях в том смысле, что он не действует при низких уровнях нейронной активности, но становится все более и более задействованным, когда нейронная активности возрастает (Jacobs, Fornal, 1991). Дисфункция этого регуляторного механизма может проявляться в некоторых формах патологии человека, и поэтому лекарственные препараты, нацеленные на эти ауторецепторы, обеспечивают потенциально важный момент терапевтического вмешательства.
Одним из первых значительных открытий о 5-НТ нейронах мозга было то, что их активность резко изменяется во время цикла сон-пробуждение-бодрствование. От устойчивого, медленного и регулярного паттерна разряда, например, 3 потенциала действия/сек во время спокойного бодрствования, нейронная активность постепенное снижается, по мере того, как животное засыпает и вступает в медленный сон. Полное замедление нейронной активности во время сна сопровождается снижением регулярности разряда. Во время быстрого (REM) сна, 5-НТ нейронная активность затихает, но перед пробуждением возвращается к своему исходному уровню, или превышает его, за несколько секунд до конца эпохи REM сна. Во время пробуждения или состояния активного бодрствования, скорость разряда может увеличиться до 4 или 5 потенциалов действия/сек.
Однако, активность 5-НТ нейронов нелегко поднять выше уровня, наблюдаемого во время исходного спокойного активного бодрствования. И это, несмотря на то, что в исследованиях использовались стимулы, вызывающие разнообразие форм поведенческой активации и сильной симпатической активации. Например, двигательное ограничение животных в течение 15 минут вызывало сильную симпатическую активацию. Дополнительными поведенческими свидетельствами стрессовой природы этого стимула были борьба и вокализации в течение иммобилизации. Но, несмотря на поведенческую и физиологическую активацию, произведенную иммобилизацией, активность серотонинергических нейронов DRN незначительно отличалась от наблюдаемой до стрессового состояния.
Как и применение внешних стрессоров, физиологические воздействия на животных (увеличения температуры среды, вызываемая пирогеном лихорадка и др.) также не в состоянии значительно активизировать 5-НТ нейроны мозга выше уровня, существующего в течение спокойного активного бодрствования, несмотря на то, что и эти манипуляции производят поведенческую активацию, а так же активизируют симпатическую нервную систему организма.
Хотя те же самые стимулы и внешние и физиологические, эффективны для сильного активирования соседней нейрохимической стволовой системы, норадренергических нейронов locus coenileus (LC). По мнению J. Mann и соавторов (1999), норадренергаческая реакция отражает воздействие факторов среды, в то время как состояние серотониновой системы генетически обусловлено и отражает личностный фон, на который накладывается средовое воздействие.
Данные, полученные при изучении животных в свободном поведении, приводят к следующим заключениям: есть основное соотношение между уровнем тонической моторной активности и 5-НТ нейронной активности и, в добавок, в некоторых нейронах существует дополнительное соотношение, при котором наблюдается дальнейшая, часто резкая, нейронная активация в ассоциации с повторяющимися формами поведения. По-видимому, обработка сенсорной информации тормозится во время активации тонической или повторяющейся моторной активности, но растормаживается во время супрессии других видов моторной активности.
Повреждение серотонинергических нейронов дорсального ядра шва
Процедура эксперимента была следующей: за 10 минут до начала иммобилизации половине животных без повреждения 5-НТ нейронов DRN и половине животных с повреждением 5-НТ нейронов DRN с помощью способа, описанного выше, билатерально вводили в nCd или SN нейротензин (SIGMA) в дозе 2.5 мкг в 1.0 мкл физиологического раствора, остальным (контрольным) животным был введён физиологический раствор в том же объёме. Затем проводили иммобилизацию животных, помещая их в индивидуальные клетки-пеналы на 90 минут. После извлечения крыс из пенала, проводили поведенческий тест в установке "открытое поле", который позволял оценивать двигательную активность и эмоциональное состояние животных. Тестирование проводили в течение 3-х минут, описанным выше способом. После этого крыс помещали в Т-образный лабиринт для тестирования условного пищедобывательного рефлекса. В последующие двое суток повторяли эти поведенческие тесты.
Для выяснения влияния предшественника серотонина на поведение животных в условиях иммобилизационного стресса, 15 крысам, обученным в Т-образном лабиринте внутрибрюшинно вводили 5-окситриптофан (5-НТР) в дозе 5 мг/кг. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Далее процедура эксперимента была аналогичной той, что описана выше.
В серии экспериментов изучали влияние болевой стимуляции на поведение животных. Экспериментальная установка представляла собой прямоугольную камеру с металлическим полом, разделённую на два отсека (тёмный и ярко освещенный) вертикальной перегородкой с отверстием возле пола. Животное помещалось в освещенный отсек. При переходе в тёмный отсек, крыса подвергалась неизбегаемому болевому воздействию, которое заключалось в нанесении удара электрическим током (2 мА, 3 с). После этого тестировали поведение животных в «открытом поле». Эффективность пассивного оборонительного поведения оценивали по величине латентного периода перехода крыс из ярко освещенного отсека в тёмный, где животные накануне получали неизбегаемое болевое воздействие.Условный рефлекс пассивного избегания тестировали также в последующие четверо суток. В первой серии экспериментов животным с повреждением серотонинергических нейронов DRN за 10 минут до помещения в камеру вводили NT в SN, во второй - за 10 минут до помещения в камеру вводили NT в DRN.
После окончания экспериментов производилась декапитация крыс и немедленное замораживание извлечённого мозга под струёй сжатого углекислого газа. Затем мозг помещался в холодильник, поддерживающий температуру-70 С.
Определение концентраций моноаминов проводили методом высоко эффективной жидкостной хроматографии (HPLC) с помощью стандартных наборов на хроматографе Waters 464 (США) с электрохимическим детектором.
Для исследований брали образцы ткани хвостатых ядер и гипоталамуса, массой приблизительно 20 мг. При анализе содержания катехоламинов (норадреналина, адреналина и дофамина) образцы тканей гомогенизировали на льду с 1,4 мл 0,01 N НС1, центрифугировали 5 минут при 9000 об/мин. 0,5 мл экстракционного буфера наносили на предколонку, энергично встряхивали, прибавляли 1,0 мл гомогената и 50 мкл внутреннего стандарта. Перемешивали в течение 10 минут. Снимали крышку в нижней части колонки и собирали эффлюент, затем трижды промывали колонку 1 мкл промывочного буфера, собирали эффлюент. Затем прибавляли 120 мкл элюационного буфера, встряхивали и две минуты ждали. Перемешивали в течение 30 секунд (Vortex), центрифугировали 1 минуту при 2000 об/мин, тщательно перемешивали элюат. Объём инъекции в хроматограф составлял 20мкл.
При анализе содержания серотонина к 200 мкл гомогената прибавляли 100 мкл внутреннего стандарта и 50 мкл осаждающего реагента и встряхивали. Центрифугировали 5 минут при 9000 об/мин. Супернатант использовали для анализа. Объём пробы - 20 мкл.
HPLC параметры: Объём введения: 20 мкл Скорость потока: 1 мл/мин Потенциал: 500 мВ
