Эффекты Альфа2-адренергических препаратов на уровень мРНК генов апоптоза в онтогенезе головного мозга крыс в норме и при гипоксии Ильиных Филипп Александрович

Введение к работе

Актуальность проблемы Апоптоз, или программируемая гибель клеток, направлен на сохранение нормального функционирования биологических систем и является непременным участником формирования органов и тканей в онтогенезе (Meier et al, 2000, Roth, D'Sa, 2001, Мартынова, 2003) Основными регуляторами апоптоза, участвующими в развитии головного мозга млекопитающих, являются члены семейства BCL-2 - проапоптозный белок В АХ и антиапоптозный белок BCL-X_L (Chao, Korsmeyer, 1998, Akhtar et al, 2004) Наиболее важная роль в осуществлении клеточной гибели принадлежит каспазам Ключевым медиатором и конечным эффектором апоптоза в клетках нервной ткани является каспаза-3 (Hengartner, 2000, Yuan, Yankner, 2000, Degterev et al, 2003)

Основные события нейрогенеза и элиминации избыточных клеточных элементов в ЦНС млекопитающих происходят в пренатальном и раннем постнатальном онтогенезе (Будко и др, 1985, Oppenheim, 1991, Yuan, Yankner, 2000) Перинатальный период является критическим в развитии головного мозга, когда он наиболее чувствителен к действию повреждающих факторов Развитие мозга находится под контролем ряда эндогенных соединений, например, сигнальных молекул нейротрансмиттеров (Cameron et al, 1998, Gould et al, 1999, Contestable, 2000) Влияние внеклеточных сигналов на предрасположенность клеток к самоуничтожению в процессе нормального развития головного мозга и при различных нарушениях регуляции апоптоза под действием стрессорных факторов, таких, как гипоксия, является одной из малоизученных проблем Нейротрансмиттеры, в частности, стимуляторы а₂-адренергических рецепторов (а₂-АР), а также имитирующие их действие вещества, способны вызывать чрезмерную активацию или, наоборот, торможение гибели клеток в развивающемся мозге

Описано нейропротекторное действие как агонистов а₂-АР (Laudenbach et al, 2002, Engelhard et al, 2003, Zhang, 2004), так и антагонистов этих рецепторов (Gustafson et al, 1990, Martel et al, 1998, Bauer et al, 2003) при ишемии и токсическом повреждении мозга у взрослых животных. Возможные причины такого действия этих препаратов во многом остаются неясными Кроме того, подобные исследования посвящены, главным образом, оценке масштабов повреждения на морфологическом уровне Роль же белков семейства BCL-2 и каспаз в процессах, опосредуемых а₂-АР, на сегодняшний день не определена

Показано, что стимулятор а₂-АР клонидин, производное имидазолина, повышает экспрессию гена каспазы-3 и индекс фрагментации ДНК в стволе мозга 21-дневных эмбрионов крыс и 8-дневных животных, обладая, следовательно, проапоптозными свойствами (Dygalo et al, 2004) Вместе с

тем, остается неясным, связаны ли эти эффекты со способностью клонидина активировать а₂-АР, или же они являются следствием его неспецифического действия

Таким образом, вопрос об участии а₂-АР в регуляции интенсивности программируемой клеточной гибели в раннем постнатальном периоде развития ЦНС млекопитающих в норме и под влиянием гипоксии путем модуляции экспрессии генов ключевых участников этого процесса остается открытым Выяснение этого вопроса представляется важным, поскольку сбой апоптозной программы в период становления ЦНС потенциально способен изменить формирование головного мозга, что, в свою очередь, представляет собой элемент программирования последующего физического развития, проявлений высшей нервной деятельности и других свойств взрослого организма

Цель и задачи исследования. Основная цель данной работы состояла в изучении роли а₂-АР в регуляции процесса апоптоза, сопровождающего развитие ЦНС млекопитающих Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1. Изучить онтогенетическую динамику уровней мРНК ключевых генов апоптоза {box, bcl-x и каспазы-3) в стволовом и фронтальном отделах головного мозга крыс,

2. Исследовать эффекты фармакологической блокады а₂-АР иохимбином и стимуляции рецепторов клонидином на уровень мРНК ВАХ, BCL-X_L и каспазы-3 в стволе, коре, гиппокампе и мозжечке развивающеюся головного мозга крыс,

3. Проанализировать эффекты подавления экспрессии гена а_2А-АР, являющегося основным подтипом адренорецепторов в ЦНС млекопитающих, антисмысловым олигонуклеотидом на уровень мРНК каспазы-3 в коре мозга неонатальных крысят,

4. Оценить способность умеренной гипоксии, являющейся наиболее распространенным из возможных стрессорных воздействий в период развития ЦНС млекопитающих, влиять на уровень мРНК апоптозных белков, а также изменять эффекты адренолигандов на данный показатель в различных отделах формирующегося мозга неонатальных крысят

Научная новизна. В работе впервые установлено влияние посредников межклеточной коммуникации АР второго типа на уровни мРНК белков апоптоза в головном мозге млекопитающих в условиях естественного постнатального формирования, а также после кратковременной гипоксии

Описаны региональные особенности онтогенетической динамики уровней мРНК белков апоптоза ВАХ, BCL-X_L и каспазы-3 в стволе и коре головного мозга крыс с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР Уровень

экспрессии генов высок в мозге плодов Далее, в стволовой части мозга мРНК ВАХ увеличивается к 40-му дню жизни и затем снижается, мРНК BCL-Xi достигает взрослого уровня в течение месяца, содержание транскрипта каспазы-3 снижается в 2 раза к полуторамесячному возрасту Во фронтальной коре содержание мРНК ВАХ снижается с 8-го по 90-й день жизни, а мРНК BCL-X_L не меняется, как и остающейся на высоком уровне м РНК каспазы-3

Впервые продемонстрировано, что блокада а₂-АР иохимбином приводит к проявлению антиапоптозных свойств в отделах формирующегося мозга крыс на 6-й день постнатального развития Агонист а₂-АР клонидин отменяет некоторые эффекты иохимбина, что свидетельствует о специфичности его действия на показатели апоптоза через сс₂-АР Введение в мозг новорожденных крысят антисмыслового олигонуклеотида к сс_2А-АР повышает количество транскрипта каспазы-3 в коре Стимулятор АР клонидин снижает повышенный в результате воздействия антисенсом уровень мРНК фермента, что также подтверждает роль взаимодействия клонидина с а₂-АР в реализации данных эффектов

Впервые показано, что последствия гипоксии зависят от отдела мозга в мозжечке увеличивается содержание мРНК проапоптозного белка ВАХ, тогда как в гиппокампе уровень мРНК ключевого фермента апоптоза каспазы-3, напротив, снижается Через сутки после воздействия адренергическими препаратами в коре мозга неонатальных животных происходит уменьшение количества транскрипта белка ВАХ Последующее гипоксическое воздействие изменяет эффект блокады а₂-АР иохимбином, совместное действие которого с гипоксией приводит к повышению концентрации мРНК-предшественника ВАХ Спустя 5 дней после воздействия адренергическими препаратами в ряде структур развивающегося мозга выявлены антиапоптозные эффекты Гипоксия, примененная совместно с адренергическими препаратами, не оказывала существенного влияния на их эффекты, наблюдаемые через 5 суток после воздействия

Теоретическая и практическая значимость Результаты работы расширяют теоретические представления о влиянии межклеточных сигнальных молекул стимуляторов мембранных рецепторов нейротрансмиттеров на предрасположенность клеток развивающегося мозга к запуску программы самоуничтожения Продемонстрирована возможность участия а₂-АР, а также их эндогенных лигандов, в регуляции апоптоза, сопровождающего развитие ЦНС в норме и при гипоксии, путем модуляции экспрессии генов ключевых участников этого процесса Установленные в работе факты свидетельствуют, что применение адренергических препаратов приводит к нарушению регуляции клеточной гибели Поскольку а₂-адренергические лиганды

широко используются в клинической практике для перинатальной анестезии и терапии гипертонии (Kamibayashi, Maze, 2000), полученные данные имеют и определенное практическое значение Свойства аг-адренергических лигандов модифицировать процесс гибели клеток должны учитываться при их использовании в клинической перинатальной практике

Основные положения, выносимые на зашиту.

1. Онтогенетические динамики уровней мРНК проапоптозных белков ВАХ и каспазы-3, а также антиапоптозного белка BCL-X_L, имеют характерные для каждого из них и отдела головного мозга особенности В стволовой части мозга уровень транскриптов проапоптозных генов в ходе онтогенеза значительно снижается, а в коре остается на высоком уровне

2. оь-АР участвуют в регуляции экспрессии генов белков апоптоза ВАХ, BCL-X_L и каспазы-3 в формирующемся головном мозге Через сутки после введения блокатор ссг-АР иохимбин увеличивал соотношение мРНК BCL-X_L/BAX в мозжечке, коре и гиппокампе, а стимулятор этих рецепторов клонидин снижал уровень мРНК BCL-X_L в гиппокампе неонатальных крысят Через 5 дней после введения иохимбин и клонидин снижали уровни мРНК проапоптозных белков в гиппокампе, а клонидин, кроме того, повышал в стволе мозга уровень мРНК BCL-X_L Эти рецепторы участвуют в регуляции экспрессии гена каспазы-3 и при их взаимодействии с эндогенным норадреналином, поскольку подавление экспрессии а^-АР в мозге антисмысловым олигонуклеотидом приводило к повышению уровня мРНК этой протеазы в коре, а компенсирующая стимуляция сниженного антисмысловым олигонуклеотидом числа а₂-АР клонидином снимала это повышение

3. Кратковременная умеренная гипоксия вызывает проявляющиеся через сугки и исчезающие уже на 5 день после воздействия изменения в уровне мРНК генов апоптоза в головном мозге неонатальных животных Эффект гипоксии зависит от отдела мозга в мозжечке он проапоптозный, а в коре и гиппокампе - антиапоптозный На фоне гипоксии, в период ее влияния на экспрессию генов апоптоза, иохимбин утрачивал способность снижать уровень мРНК ВАХ в коре головного мозга крысят

Апробация работы Материалы данной работы были доложены или представлены на XLIII Международной сіуденческой конференции (Новосибирск, 2005), V Съезде физиологов Сибири (Томск, 2005), Международной школе-конференции для молодых ученых «International summer school m behavioural neurogenetics» (Москва, 2005), Международной конференции «Basic Science for Biotechnology and Medicine» (Новосибирск, 2006)

Вклад автора. Автор полностью овладел всеми методами и приемами,

необходимыми для выполнения представленной работы Он внес

определяющий вклад в получение экспериментальных данных, их

статистическую и теоретическую обработку, описание и представление
результатов

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 работ, из них 4 статьи в отечественных журналах, рекомендуемых ВАК

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков и 3 таблицы Список литературы включает 334 источника, в том числе 302 иностранных

Похожие диссертации на Эффекты Альфа2-адренергических препаратов на уровень мРНК генов апоптоза в онтогенезе головного мозга крыс в норме и при гипоксии

Влияние буфотина и убихинона-10 на функции ЦНС крыс в норме и при гипобарической гипоксииТихобразова Ольга Павловна

Влияние прерывистой гипобарической гипоксии на морфофункциональные изменения щитовидной железы у крыс в норме и при экспериментальной дисфункцииВасильева Евгения Владимировна

Эндокринная функция дофаминергических нейронов целостного мозга в онтогенезе крысСайфетярова, Юлия Юрьевна

Анализ функции альфа 2-адренергических рецепторов головного мозга крыс в раннем онтогенезеМаснавиева Людмила Борисовна

Секреторная активность катехоламинергических и гонадотропин-рилизинг гормон-продуцирующих нейронов мозга у крыс в онтогенезе Лаврентьева Антонина Валериевна

Развивающийся мозг как эндокринный источник серотонина у крыс в онтогенезеНасырова Диана Ильдаровна

Изучение поведенческих эффектов введения нейротензина в хвостатое ядро и черную субстанцию мозга крыс в норме и с повреждением серотонинергических нейроновОльшанский Артем Сергеевич

Сравнительные особенности адаптивных реакций организма человека к гипоксии в норме и при артериальной гипертензии.БИЛЛО Евгений Евгеньевич

Сократительная активность гладких мышц коронарных сосудов в норме и при гипоксииШатохина Татьяна Андреевна

Разработка методов выявления взаимосвязи между показателями сердечной деятельности, дыхания и газообмена у человека в норме и в условиях гипоксии и гиперкапнииНефедьев Владимир Валентинович