Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. Адренергические рецепторы головного мозга. Их функция в раннем онтогенезе
1.1. Структура норадренергической системы головного мозга 8
1.2. Строение, классификация и механизм действия адренергических рецепторов 8
1.3. Регуляция функции и числа адренорецепторов 11
1.4. а2-Адренорецепторы и поведение 14
1.5. Онтогенез норадренергической системы 21
1.6. Функция норадреналина и его рецепторов а2-типа в онтогенезе... 28
1.7 Антисмысловые олигодеоксинуклеотиды и механизм их
действия 32
ГЛАВА 2. Материалы и методы 35
2.1. Животные 35
2.2. Введение препаратов в мозг неонатальных крысят 35
2.3. Холодовая анестезия неонатальных крысят 35
2.4. Оценка общего развития животных 36
2.5. Исследование рефлекторно-моторного развития и поведения животных 36
2.5.1. Рефлекс возвращение в позу на 4-х лапах - Righting reflex... 36
2.5.2. Двигательная активность неонатальных крысят 36
2.5.3. Спонтанная двигательная активность 37
2.5.4. Рефлекс вздрагивания в ответ на звуковой стимул 37
2.6. Определение содержания норадреналина и дофамина 38
2.7. Определение адренергического связывания 39
2.8. Определение экспрессии мРНК альфа2А-адренорецепторов 40
2.9. Статистическая обработка результатов 41
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований.. 42
1 Острые эффекты воздействия антисенсом к мРНК а2А- адренорецептору головного мозга неонатальных крысят 42
3.1.1. Нейрохимические изменения норадренергической системы 42
3.1.2.Рост и развитие крысят в первые дни жизни 44
3.1.3. Рефлекторно-моторное поведение крысят 50
3.1.4. Время, необходимое для впадения в холодовой наркоз 53
2. Отсроченные эффекты неонатального подавления экспрессии мРНК а2А-адренорецептора головного мозга крысят
3.2.1. Нейрохимические изменения в головном мозге взрослых крыс 57
3.2.3. Рефлекторно-моторное поведение животных 59
ГЛАВА 4. Обсуждение результатов 72
Выводы 85
Список цитированной литературы 87
- Структура норадренергической системы головного мозга
- Онтогенез норадренергической системы
- Исследование рефлекторно-моторного развития и поведения животных
- Острые эффекты воздействия антисенсом к мРНК а2А- адренорецептору головного мозга неонатальных крысят
Введение к работе
Актуальность проблемы. Норадренергическая система головного мозга участвует в регуляции многих функций, таких как кардиоваскулярная и эндокринная, различных форм поведения, а также психоэмоциональных состояний среди которых депрессия и тревожность (Nunes, 1995; Lu, Ordway, 1997; Wang X.M. et.al., 2002; Maestroni, 2004). Норадреналин осуществляет свое действие через адренергические рецепторы, присутствующие во многих тканях, периферических органах и в центральной нервной системе (ЦНС) (Шишкина, Дыгало, 1997; Lacey et.al., 1996; Lu, Ordway, 1997). Формирование этой нейрохимической системы мозга млекопитающих и ее рецепторного звена начинается во второй половине эмбрионального развития, а созревание завершается уже после рождения, у крыс к 1,5-месячному возрасту. Раннее появление в онтогенезе, а также проявляющиеся в течение жизни функциональные и поведенческие нарушения после воздействия нейротоксинами на эту нейрохимическую систему в период ее развития, позволяют предполагать влияние системы на формирование ЦНС. (Lorton et al., 1988; Culmsee et.al., 1999). Однако, такое нейротропное действие медиатора и тип рецепторов, через которые оно может осуществляться, остаются неясными.
Альфа2А-адренорецепторы (а2А-АР) экспрессируются в головном мозге млекопитающих в ядрах ствола, содержащих тела норадренергических нейронов, а так же во всех отделах, где располагаются терминали этих нейронов (Шишкина, Дыгало, 2002; Lu, Ordway, 1997). Наибольший пиковый уровень экспрессии а2А-АР в стволе головного мозга приходится на перинатальный период развития крыс (Юшкова, Дыгало, 1995). Возможно, что именно эти рецепторы в критические сроки онтогенеза могут осуществлять «программирующую» функцию, определяя функцию ЦНС и поведение животных в последующие периоды жизни. Однако исследование функции а2А-АР сдерживалось отсутствием подтип-специфичных лигандов. Реальная возможность выяснения их функции возникла после разработки антисенс технологии, основанной на применении специфичных к мРНК антисмысловых олигодиоксинуклеотидов (антисенсов), способных избирательно снижать экспрессию отдельного гена (Gonzalez-Cabrera et al., 1998). Если рецепторы этого подтипа действительно влияют на формирование ЦНС, то можно ожидать, что изменение их экспрессии в раннем онтогенезе проявится изменениями в дальнейшем развитии животных, поскольку эти рецепторы прямо или косвенно участвуют в регуляции норадреналин-зависимых процессов. Поэтому планируемое в работе изучение функций а2А-АР в регуляции физиологических систем развивающегося организма и формировании его последующих свойств (программирующая функция) в критические сроки онтогенеза путем подавления их экспрессии антисмысловым олигонуклеотидом является актуальным.
Цель и задачи исследования. Основная цель работы состояла в исследовании регуляторной и «программирующей» функции а2А-АР головного мозга крыс в раннем онтогенезе. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1) определить эффект воздействия антисмысловым олигонуклеотидом к мРНК а2А-АРу/ на экспрессию этих рецепторов и нейрохимические показатели норадренергической системы головного мозга неонатальных крысят; оценить развитие, рефлекторно-моторные характеристики поведения и гипногенную функцию (Х2А-АР в осуществлении холодовой анестезии у новорожденных животных после блокады экспрессии а2А-АР головного мозга; изучить отсроченные эффекты подавления экспрессии а2А-АР в неонатальный период на норадренергическую систему и регулируемое этой системой поведение взрослых животных.
Научная новизна работы. Впервые продемонстрирована возможность подавления экспрессии гена а2А-АР на уровне его мРНК и кодируемого им белка в формирующемся головном мозге млекопитающих антисмысловым олигодеоксинуклеотидом, комплементарным к транскрипту гена-мишени.
Установлено, что подавление экспрессии гена а2А-АР приводит к повышению уровня норадреналина в стволовой части мозга неонатальных крысят и снижению плотности бета-адренорецепторов в их коре.
Впервые установлено, что, не оказывая существенного влияния на формирование моторных рефлексов, а2А-АР головного мозга угнетают двигательную активность и повышают склонность новорожденных крысят к гипногенному состоянию при холодовой анестезии.
Снижение экспрессии а2А-АР в неонатальном мозге изменяет функциональное состояние норадренергической системы в последующие периоды жизни, что проявляется совместным повышением как уровня норадреналина в стволовой части мозга, содержащей клеточные тела норадренергических нейронов, так и плотности а2А-АР в коре головного мозга, содержащей терминали этих нейронов. Эти нейрохимические эффекты сопровождались изменением поведения полуторамесячных животных: у них наблюдалось ускоренное снижение амплитуды реакции вздрагивания в ответ на повторяющийся акустический стимул.
Положения, выносимые на защиту
1) а 2А-АР влияют на нейрохимию мозга, поведение и гипногенное состояние неонатальных крысят. Их участие в регуляции перечисленных функций проявляется ростом уровня норадреналина (НА) в стволе, понижением плотности Р-адренорецепторов (|3-АР) в коре, повышением двигательной активности и увеличением времени, необходимого для впадения в холодовой наркоз после снижения экспрессии а2А-АР олигодеоксинуклеотидом, комплементарным к их мРНК.
2) Уровень экспрессии <х2А-АР в неонатальном мозге имеет программирующее значение для нейрохимических характеристик и поведения животных в последующие периоды жизни. Программирующая функция этих рецепторов проявлялась повышением их экспрессии в коре и уровня НА в стволе мозга 40-дневных крыс, а также быстрым снижением амплитуды рефлекторного вздрагивания при повторных предъявлениях звуковых стимулов после снижения экспрессии (х2А-АР в головном мозге в критический период его формирования.
Практическая значимость работы. Полученные данные вносят существенный вклад в понимание нейрохимических и поведенческих изменений, связанных с нарушением экспрессии а2А-АР в раннем онтогенезе. Кроме того, полученные результаты могут быть полезны для разработки новых препаратов для осуществления анестезии, лечения состояний, связанных с психо-эмоциональными нарушениями. Результаты данной работы используются в лекционном курсе «Гормоны в фило- и онтогенезе» и на практических занятиях студентов биологов Новосибирского государственного университета.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и обсуждены на Международной научной студенческой конференции (Новосибирск, 2000); XVIII Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001); IV Съезде Физиологов Сибири (Новосибирск, 2002); конференции «Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии» (Новосибирск, 2002); International symposium Genetic and Developmental Psychoneuroendocrinology (Novosibirsk, 1999); Seventh symposium on catecholamines and ather neurotransmitters in srtess (Slovakia, 1999); International Conferens "RNA as Therapeutic and genomics Target" (Novosibirsk, 2001); The 5-th International congress of Neuroendocrinology (Bristol, 2002).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 статьи -в ведущих российских и зарубежных журналах, 8- тезисы докладов.
Структура норадренергической системы головного мозга
Адренергические рецепторы относятся к суперсемейству G-белок -сопряженных рецепторов, которые встроены в плазматическую мембрану клетки. В своей структуре они содержат 7 гидрофобных альфа спиралей, по 20-25 аминокислотных остатков - трансмембранных доменов, формирующих каналоподобную структуру, связанных более гидрофильными вне- и внутриклеточными петлями (Guyer et al., 1990; Machida et al., 1990). N-концевая аминокислотная последовательность рецепторов этого суперсемейства расположена вне клетки, а С-концевой участок, который содержит большое количество сериновых и треониновых остатков, необходимых для взаимодействия с цАМФ, - внутри клетки. Эксперименты с удалением по очереди внеклеточных петель и участков трансмембранных доменов показали, что лиганд-связывающий сайт для агонистов и антагонистов находится внутри консервативной гидрофобной сердцевины рецептора. Третья внутриклеточная петля, соединяющая пятый и шестой трансмембранные домены, больше других петель по размерам и совместно с С-концевой последовательностью взаимодействует с G-белком. Этот белок состоит из трех субъединиц - а (39-46 кДа), Р (37 кДа) и у (8 кДа). Путь сигнального ответа инициируется связыванием агониста с рецептором, что приводит к его конформационным изменениям и ассоциированного с ним G-белка. Образуется высокоаффинный комплекс агонист - рецептор - G-белок. Активная форма G-белка регулирует работу ионных каналов, действует на разные эффекторные ферменты (аденилатциклаза, фосфолипаза-С). Активация G-белка приводит к замене связанного с ним ГДФ на ГТФ, его отсоединению от рецептора и диссоциации на а- и ру - субъединицы, что ведет к снижению аффинности рецептора к агонистам. а-Субъединица обладает ГТФазной активностью, Ру-димер оказывает ингибирующее действие на аденилатциклазу-1, активирует аденилатциклазы II и IV (Stone et al., 1987), стимулирует фосфолипазу-С, воздействует на К+каналы в наномолярных концентрациях (Weiner, Molinoff,1989; Birnbaumer,1992; Hepler, Gilman, 1992; Nijkamp et al., 1992; Strader et al.,1994; Insel, 1996; Шишкина, Дыгало, 1997). На периферии подтипы аденилатциклазы не чувствительны к ру-димеру, но в ЦНС регуляция их активности осуществляется как а - так и Ру-субъединицами G-белка. Подобно аденилатциклазе, семейство фосфолипазы-С состоит из нескольких классов, одни из которых регулируются Ру-димером, другие - нет (Hepler, 1992).
В 1948 году, по ответам на воздействие адренергическими препаратами, адренорецепторы были разделены на а- и Р-адренорецепторные. классы. Так а адренорецепторы опосредуют в основном возбуждение функции (сужение сосудов, сокращение неисчерченной мышцы матки, мочевого пузыря, зрачка) и в ряде случаев ингибирование функции (расслабление кишечника), в то время как Р-адренорецепторы оказывают в основном ингибирование функции (расширение Ш сосудов, релаксация неисчерченной мышц матки и бронхов) и в ряде случаев возбуждение функции (стимуляция миокарда) (Ahlquist, 1948; Раевский, 1991). В дальнейшем оказалось, что агонисты и антагонисты оказывают различное влияние на пре- и постсинаптические рецепторы сердца и легочной артерии кроликов и селезенки кошки (Starke К, 1981). Были проведены биохимические и молекулярные анализы а-адренорецепторов, на основании которых они разделены на cd- и а2- типы. а1-Адренорецепторы локализованы на постсинаптической мембране, а а2-адренорецепторы, находятся как на пост- так и на пресинаптической мембране, то есть могут являться и ауторецепторами, регулируя активность норадренергического нейрона (Limbird, Sweatt, 1985; Scheinin et al., 1994; Li et al., 2000; Devoto et al., 2002; Trendelenburg et al, 2003). По щ фармакологическим и функциональным свойствам Р-адренорецепторы были разделены на pi-, р2- и рЗ-подтипы (Шишкина, Дыгало, 1997). В настоящее время установлено, что каждый представитель млекопитающих имеет 9 отдельных генов и соответственно белковых молекул адренергических рецепторов: alA, alB, alD; a2A/D, a2B, a2C; pi, p2 и РЗ. Все подтипы адренергических рецепторов имеют сходную структуру, степень гомологии между ними колеблется от 60 до 98% (Mirmeman, 1988; Weiner, Molinoff, 1989; Nijkamp et al., 1992; Milligan et al.,1994;
Щ Шишкина, Дыгало, 1997). В органах и тканях присутствуют, как правило, адренорецепторы нескольких подтипов. На нейронах голубого пятна присутствуют как а2-, так и а 1-адренорецепторы. Но часто в конкретном органе или структуре отмечается преобладание какого-либо из подтипов, например, во фронтальной коре преобладающим из Р-адренорецепторов является pi-подтип, а в мозжечке - р2-подтип. Аналогично, в головном мозге экспрессируются все три подтипа а2-адренорецепторов, но в коре, гипоталамусе и голубом пятне ствола головного мозга преобладает а2А-подтип, в полосатом теле - а2С-подтип, а2В i
подтип преобладает только в таламусе. (Nakamura et al., 1988; McCune, Voigt, 1991; Scheinin et al., 1994; Lu, Ordway 1997; Wang, Lidow, 1997; Nicholas et al., 1996).
Каждый класс адренорецепторов преимущественно сопряжен со специфическим для него внутриклеточным каскадом трансдукции сигнала, что определяется сопряжением конкретного рецептора с определенным G-белком. Все известные G-белки разделены на 4 семейства, в соответствии с аминокислотной последовательностью их а-, р- и у-субъединиц: Gs, Gi, Gq, G12 (Hepler, 1999). Взаимодействие рецептора с медиатором, активирующее Gs-семейство приводит к увеличению активности аденилатциклазы и накоплению цАМФ в клетке. Активность аденилатциклазы в коре находится под контролем как а- так и Р-адренорецепторов, причем последние оказывают прямое активирующее действие на фермент, а а-рецепторы - действуют опосредованно, регулируя р-активность. Взаимодействие лиганда с а2-адренорецепторами уменьшает активность аденилатциклазы через Gi-белок. Снижение уровня мРНК а2С-адренорецепторов антисмысловым олигонуклеотидом в стриатуме приводит к увеличению накопления цАМФ в клетке, что свидетельствует о негативном сопряжении этих рецепторов с аденилатциклазой. Адренорецепторы al-подтипа посредством Go-или Gh- белка воздействуют на фосфолипазу-С через фосфатидилинозитольную систему, изменяя уровень внутриклеточного Са (Sigal et al., 1988; Ferguson et al.,1996; Insel, 1996; Шишкина, Дыгало, 1997).
Онтогенез норадренергической системы
Пре- и постсинаптические звенья системы и функциональные связи формируются в раннем онтогенезе. Функциональную активность отдельных звеньев норадренергическои иннервации можно обнаружить в ранние сроки онтогенеза. При этом в зависимости от использованного показателя зрелости системы мнения о сроках завершения ее формирования могут существенно варьировать. По одним показателям (формированию синапсов, электрофизиологическим свойствам нейронов) норадренергическая система созревает к моменту рождения. По другим (формированию рецепторов) - к третьей неделе постнатальной жизни, а по третьим (стабилизации взрослого уровня активности ферментативной системы и содержанию норадреналина) - более чем через месяц после рождения (Раевский, 1991).
Тирозингидроксилаза - ключевой фермент биосинтеза норадреналина, адреналина и дофамина. Этот фермент первым появляется в формирующихся норадренергических и дофаминергических нейронах и является их маркером. Белок и мРНК тирозингидроксилазы, с помощью антител к ферменту и гибридизации in situ, впервые определяются в вентральной части среднего мозга на 8,5-9 дни эмбриогенеза мышей, во время миграции нейронов от пролиферирующего слоя нервной трубки. С 9,5-10 до 10,5-11 дней эмбрионального развития число клеток в вентральной части среднего мозга, содержащих тирозингидроксилазу, увеличивается. Возможно, катехоламинергические клетки, которые появляются в раннем онтогенезе среднего мозга, могут играть нейротрофическую и/или морфогенетическую роль (Porsio et al., 1990).
В клетках обонятельных бугорков, которые в ходе онтогенеза станут дофаминергическими, тирозингидроксилаза появляется на 12 день пренатального развития, в вентромедиальной и некоторых дорсальных частях передних обонятельных ядер головного мозга - на 16-18 дни эмбрионального развития. Начиная с 18 дня эмбриогенеза, распределение мРНК тирозингидроксилазы в этом отделе ЦНС соответствует таковому у взрослых животных (гломерулярный и митральный слои обонятельных луковиц) (Guthrie, Leon, 1989). В последние дни пренатального развития происходит увеличение числа нейронов, содержащих тирозингидроксилазу, достигая максимума к 9-12 дням жизни. Затем происходит постепенное снижение количества фермента до 4 недели, а к 6 неделе оно становится минимальным (Nagatsu et al., 1990). Активность ферментов синтеза норадреналина максимальна у новорожденных крыс в мосту и в продолговатом мозге. Она достигает в этой части головного мозга 50% от уровня взрослых животных. В коре мозга и мозжечке активность биосинтеза медиатора значительно ниже, чем в стволе (Раевский, 1991).
В лимбической системе и гиппокампе крыс существенные изменения активности тирозингидроксилазы происходят с 10 по 40 дни жизни. В преоптической и супрахиазматической областях гипоталамуса активность фермента достигает максимума на 20 день и возвращается к базальному уровню на 25 день, однако, снова происходит увеличение активности в супрахиазматической области к 39 дню жизни. В миндалине - пики на 28 и 30 дни и снижение до базального уровня к 35 дню, в срединном возвышении активность тирозингидроксилазы увеличивается к 20 и возвращается к дефинитивному уровню к 39 дню. Временные увеличения уровня тирозингидроксилазы в лимбической системе и гиппокампе могут быть связаны, по мнению некоторых исследователей (Zimenez et al., 1984), с созреванием системы нейронального контроля систем, вовлеченных во взрослые репродуктивные функции.
Кроме экспрессии тирозингидроксилазы в дифференцирующихся катехоламинергических нейронах этот фермент транзиторно экспрессируется и в некоторых некатехоламинергических клетках ряда отделов головного мозга в различные периоды онтогенеза. Временная экспрессия мРНК тирозингидроксилазы наблюдается во фронтальной коре с 18 по 21 дни эмбриогенеза, исчезает к рождению и снова экспрессируется с 9 по 12 дни постнатального развития, в мозолистом теле - с 3 по 21 дни постнатального развития, а в дорсальной части переднего мозга - с 7 по 24 дни жизни (Guthrie, Leon, 1989; Nagatsu et al., 1990). Значение этой экспрессии для нейрогенеза остается неясным.
Исследование рефлекторно-моторного развития и поведения животных
На второй, третий, четвертый и пятый дни жизни животных оценивали их спонтанную двигательную активность в тесте открытого поля, адаптированного для новорожденных крысят. Животных помещали в центр открытой площадки размером 10 х 15 х 3 см, расчерченной на квадраты 1 х 1см, и в течение 60 секунд велся подсчет числа квадратов, границы которых они пересекали правой передней лапой (padlling).
В двадцатидневом возрасте у крыс оценивали спонтанную двигательную активность. Их помещали на 10 минут в актометр размером 30 х 30 см с двумя фотодиодами, расположенными в одной стенке установки на расстоянии 10 см. от боковых стенок и разделеными таким же расстоянием между собой. Пересечения этих лучей автоматически регистрируются, цифровые величины которых высвечиваются на панели прибора. Во время тестирования фиксировалось ежеминутное, а также суммарное (за 10 минут) число пересечений лучей.
На 22 или 34 дни постнатального развития животных тестировали на величину рефлекторной реакции вздрагивания в ответ на звуковые сигналы и привыкание к их повторным предъявлениям в тесте "Startle reflex". Крысят помещали в стандартную установку SR-Pilot (San Diego Instruments, USA). Аппарат представляет плексигласовую камеру размером 15 х 19 х 25 см. На дне камеры находится соединенная с пьезодатчиком высокочувствительная платформа, на потолке прикреплен микрофон. После включения прибора, в камеру начинает подаваться "белый шум" (65 дБ). Основной, вызывающий реакцию испуга и вздрагивание, звуковой стимул громкостью 115 дБ включается на 40 мс одновременно с регистрацией двигательной реакции животного на платформе. Колебания платформы автоматически регистрируется при помощи микропроцессора, цифровые величины высвечиваются на передней панели прибора. Крыс помещали в SR-Pilot аппарат на 3 минуты для адаптации (без предъявления основных звуковых сигналов). Затем подавались 4 звуковых сигнала с интервалом 15 секунд.
Содержание норадреналина и дофамина в ткани мозга определяли флюориметрическим методом (Jacobowitz, Richardson, 1978). Все реактивы готовили на дважды дистиллированной воде.
Животных каждой из экспериментальных групп забивали декапитацией на 5, 24 или на 40 день жизни. У крыс на холоду выделяли фронтальную кору и ствол головного мозга, включающий продолговатый мозг и область моста, которые замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -60С.
Замороженные образцы ткани взвешивали на торсионных весах с точностью ОД мг и гомогенизировали в 2 мл подкисленного бутанола (0.85 мл конц. НС1 на 1 л бутанола) на холоду. Гомогенат центрифугировали 10 мин (2000 об/мин, 0С). К 1.5 мл супернатанта, перенесенного в пробирку со шлифом, прибавляли 1 мл 0.1 М охлажденного натрий-фосфатного буфера рН=6.5, встряхивали 20 сек, центрифугировали 15 мин (2000 об/мин, 0С). Пустые пробы, для учета фоновой [ флюоресценции, содержали эквивалентный объем бутанола, стандарт - 0.1 мкг J норадреналина или 0.1 мкг. дофамина. Органическую фазу убирали водоструйным насосом, 0.7 мл водной фазы переносили в чистые пробирки. К каждой пробе приливали 0.17 мл 0.1М EDTA, рН = 6.5. Затем с интервалом в 2 минуты к образцам добавляли 0.13 мл йодного реактива (О.ЗМ KJ, О.ЗМ J2), 0.17 мл раствора щелочного сульфита (0.2М Na2S03 в 4н NaOH), 0.2 мл 5н уксусной кислоты, каждый раз хорошо встряхнув. В течение 5 минут пробы нагревали на кипящей водяной бане, охлаждали до комнатной температуры. Флюоресценцию измеряли на флюориметре ("Hitachi") на волне 485 нм, при возбуждающем свете 385 нм для норадреналина. Для дофамина длины волн составляли 385нм и 320 нм соответственно. Содержание нейромедиаторов в ткани рассчитывали по формуле:
X = 3A(EX-E0)/2V(ES-E0),
где X - содержание норадреналина/дофамина (мкг/г), А - содержание норадреналина/дофамина в стандарте (мкг), V - вес ткани (г), Е0 - интенсивность свечения пустой пробы, Es -интенсивность свечения стандарта, Ех - интенсивность свечения образца, 3/2 - коэффициент, учитывающий разбавления.
Следует отметить, что уровень норадреналина, например, в стволе головного мозга 5-дневных крысят, определенный описанным выше флюориметрическим методом, составлял в среднем 0,24±0,01 мкг/мг ткани и сопоставим с таковым, определяемым методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (0,25±0,05 мкг/мг ткани) (Дыгало и др, 2002). Следовательно, примененный в данной работе флюориметрический метод, позволяет адекватно оценить содержание катехоламинов в ткани головного мозга.
Острые эффекты воздействия антисенсом к мРНК а2А- адренорецептору головного мозга неонатальных крысят
Введение препаратов в область голубого пятна ствола головного мозга со 2 по 4 дни жизни крысят привело к изменениям уровня их мРНК в стволе (F2,9=12,5, р 0,05) головного мозга 5-дневных животных. Антисмысловой олигонуклеотид вызвал достоверное снижение уровня мРНК в стволе мозга 5-дневных крысят по сравнению с группой рэндома (t= 4,92, р 0,01), в то время как контрольный олигонуклеотид имел тенденцию к повышению в сравнении с группой, которой вводили физиологический раствор (t=2.04, р 0.1) (Рис. 1.). При сравнении уровня мРНК в стволе мозга животных групп антисенса и физиологического раствора достоверных различий не обнаружено (г=1,93, р 0,05).
В коре головного мозга 5-дневных животных, отмечена тенденция к изменению уровня мРНК а2А-адренорецепторов после неонатального воздействия (F 2,н = 3,69, р 0,1). У крысят, которым вводили антисенс, наблюдалось понижение уровня экспрессии гена а2А-подтипа адренорецепторов, причем достоверные различия (t=2,45, р 0,05) по этому показателю были при сравнении с группой рэндома (Рис. 1.), но не физиологического раствора (t=l,50, р 0,05). Введение рэндома не привело к достоверным изменениям уровня мРНК рецепторов в этом отделе мозга по сравнению с физиологическим раствором (t=l,29, р 0,05).
Плотность а2-адренорецепторов, которую оценивали по количеству сайтов связывания антагониста а2-адренорецепторов [3H]RX821002, также как и уровень мРНК а2А-адренорецепторов, достоверно снизился в стволе головного мозга после введения антисенса по сравнению с рэндомом (t=2,69, р 0,05), но достоверно не различался с группой физиологического раствора (t=l,59, р 0,05) (Рис. 2.). Число мест специфического связывания лиганда а2-адренорецепторов достоверно не различалось между группами рэндома и физиологического раствора (t=l,41, р 0,05).
В коре головного мозга введение препаратов также оказало влияние на количество а2-адренорецепторов. Так введение антисенса к а2-адренорецептору привело к достоверному снижению числа их белковых молекул по сравнению с группой рэндома (t=l,99, р 0,05), но не привело к достоверным различиям с группой физиологического раствора (t=0,95, р 0,05). Воздействие рэндомом привело к достоверному повышению числа рецепторов по сравнению с растворителем (t=2,40, р 0,05).
а2А-Адренорецепторы ствола головного мозга, где локализованы тела норадренргических нейронов, негативно влияют на их активность и синтез нейротрансмиттера. Поэтому, можно было ожидать, что снижение плотности этих рецепторов способно привести к увеличению уровня норадреналина. Такое действие антисенсом действительно было обнаружено (F 2,и 10,696, р 0,05).
В стволе головного мозга пятидневных крысят, которым вводили антисенс, уровень норадреналина был достоверно выше, по сравнению с обеими контрольными группами животных (Рис. 3). Межгрупповых различий уровня норадреналина в стволе головного мозга животных, которым вводили рэндом и физиологический раствор не обнаружено (t=0,29, р 0,05).
Воздействие фосфоротиоатами не привело к достоверным изменениям уровня норадреналина в коре головного мозга 5-дневных крысят, по сравнению с группой, которой вводили физиологический раствор (F 2,п = 2,487, р 0,05). (Рис. 3).
Введение антисмыслового олигонуклеотида в первые дни жизни крысят привело к достоверному повышению количества белковых молекул р-адренорецепторов в стволе головного мозга 5-дневных крысят по сравнению с группой физиологического раствора (t=2,15, р 0,05), но не с группой рэндома (t=l,82, р 0,05). Достоверных различий этого показателя между группами рэндома и физиологического раствора не обнаружено (t=0,ll, р 0,05). У животных, которым вводили рэндом, отмечено достоверное повышение числа мест специфического связывания лиганда р- адренорецепторов во фронтальной мозга по сравнению с физиологическим раствором (t=2,01, р 0,05) (Рис. 4). Число белковых молекул Р-рецепторов у группы с введением антисенса было достоверно ниже по сравнению с рэндомом (t=2,03, р 0,05), но не различалось по сравнению с физиологическим раствором (t=0,10, р 0,05).
Уровень дофамина в стволе головного мозга 5-дневных крысят после неонатального введения препаратов достоверно не различался во всех группах животных (F2,i4 = 0,88, р 0,05).
Во фронтальной коре введение препарата оказало влияние на концентрацию дофамина (F 2,із -5,45, р 0,05). После воздействия рэндомом отмечено достоверное снижение его содержания по сравнению с группой, которой вводили физиологический раствор (t=2,47, р 0,05). При сравнении уровня дофамина у животных групп антисенса и рэндома выявлено его достоверное повышение в группе антисенса (t=2,21, р 0,05). Его содержание было практически одинаково в группах физиологического раствора и антисенса (t=0,28, р 0,28) (Рис. 5).
Поскольку а2А-адренорецепторы ствола головного мозга, где локализованы тела норадренергических нейронов, регулируют синтез норадреналина в этом отделе мозга и его высвобождение из терминалей нейронов в коре и опосредованно влияют на плотность J3- адренорецепторов в зрелом мозге. Можно предположить, что снижение их экспрессии повлекут изменения в норадренергической системе, а также в функциях, регулируемых ими. - 3.1.2.Рост и развитие крысят в первые дни жизни.
Введение антисенса новорожденным животным не повлияло на рост животных в период введения препаратов (2-4 дни жизни). Пометы были выровнены по количеству и массе животных. Масса тела крысят в 2-дневном возрасте составляла в среднем 6,4 г. К 5 дню жизни масса животных в равной мере увеличилась во всех группах животных. Она составила 8,1±0,22 г, 8,34±0,22 г и 9,05±0,25 г у животных с введением физиологического раствора, рэндома и антисенса соответственно (Рис. 6).
