Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Каталепсия: механизмы регуляции и модели 11
1.1. Каталепсия - форма пассивно-оборонительного поведения: виды и способы вызывания 11
1.1.1 Формы каталепсии, встречающиеся в природе 12
1.1.2 Экспериментальные модели каталепсии 15
1.2 Механизмы регуляции каталепсии 20
1.3 Каталепсия какмоделъ психопатологии: 26
Глава 2. Материалы и методы 34
2.1 Экспериментальные животные 34
2.2 Экспериментальные воздействия 34
2.3 Измерение каталепсии 38
2.4 Определение функциональной активности 5-НТгл рецепторов 39
2.5 Определение экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов 40
2.5.1. Выделение РНК 40
2.5.2 Полуколичественный метод ОТ-ПЦР (Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция) 42
2.5.3 Количественный метод ОТ-ПЦР 46
2.6 Определение уровня общего тироксина крови 52
2.7 Препараты. 52
2.8 Статистическая обработка результатов 53
Глава 3. Результаты исследования 55
3.1 Влияние хронического введения ингибиторов синтеза тироксина на уровень общего тироксина крови и прирост массы тела у крыс линии Вистар. 55
3.2 Эффект экспериментального гипотиреоидизма и хронического введения тироксина на проявление реакции замирания у крыс 56
3.2.1 Влияние экспериментального гипотиреоидизма на проявление каталепсии у крыс линии Вистар 57
3.2.2 Воздействие хронического введения тироксина на выраженность каталепсии у крыс линии ГК 58
3.3 Эффект имипрамина на выраженность реакции замирания у крыс линий ГК и Вистар 60
3.4 Влияние хронического введения имипрамина на проявление каталепсии у крыс линии Вистар, длительно получавших пропилтиоурацил 64
3.5 Воздействие хронического введения имипрамина и пропилтиоурацила на 5-НТ2А рецепторы мозга у крыс 67
3.5.1 Влияние хронического введения имипрамина на экспрессию гена 5-НТ2А рецепторов во фронтальной коре мозга крыс линий ГК и Вистар 67
3.5.2 Влияние хронического введения пропилтиоурацила и имипрамина на 5-НТ2А серотониновые рецепторы мозга крыс Вистар 68
Глава 4. Обсуждение результатов 73
Выводы 82
Список цитируемой литературы 83
- Экспериментальные модели каталепсии
- Полуколичественный метод ОТ-ПЦР (Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция)
- Эффект имипрамина на выраженность реакции замирания у крыс линий ГК и Вистар
- Влияние хронического введения пропилтиоурацила и имипрамина на 5-НТ2А серотониновые рецепторы мозга крыс Вистар
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из фундаментальных задач биологических наук является понимание механизмов нормального и патологического поведения человека. В 2005 году ВОЗ назвала депрессию самым распространенным психическим заболеванием, которому подвержены в каждый момент времени 5-10% населения (The European health report, 2005). По данным ВОЗ, депрессивные расстройства являются одной из ведущих причин смерти и нетрудоспособности людей во всех странах и занимают второе место после сердечно-сосудистых заболеваний по количеству дней нетрудоспособности и инвалидизации пациентов. Несмотря на многочисленные исследования, механизмы развития депрессии до сих пор остаются неясны, так же как и механизмы терапевтического эффекта антидепрессантов.
Следует отметить, что большая часть моделей депрессии основывается - на вызывании депрессивно-подобного состояния у животных путем стрессорных воздействий (Willner, 1990; Willner, Mitchell, 2002). При этом игнорируется существование определенной изначальной предрасположенности к такому типу реагирования, хотя в патогенезе депрессивных расстройств показана значительная роль генетической компоненты (Allen, 1976; Robertson, 1987; Mendlewicz et al., 1992). Кроме того, многочисленные клинические наблюдения свидетельствуют, что тиреоидные дисфункции могут выступать как факторы риска возникновения депрессивных психозов (Joffe, Levitt, 1993; Cleare et al., 1995; Musselman, Nemeroff, 1996; Weissel, 1999; Sintzel et al., 2004). Известно, что тиреоидные гормоны играют нейротрофическую роль в зрелом мозге (Muller, Clos, 1997) и вовлечены в модуляцию нейротрансмиссии (Mason et al., 1993; Dratman, Gordon, 1996). Было выдвинуто предположение, что серотониновая система мозга может служить посредником между тиреоидными дисфункциями и депрессией (Kirkegaard, Faber, 1998; Duval et al., 1999). Особое внимание в этом отношении привлекают серотониновые рецепторы 5-НТ2д подтипа, т.к. изменения плотности и функциональной активности этих рецепторов обнаруживают при депрессии (Arora, Meltzer, 1989; Hrdina et al., 1993; Gleare et al., 1995; 1996) и после хронического введения антидепрессантов (McDonald et al., 1984; Lafaille et al., 1991; Burnet et al., 1994; Maj et al., 1996). Помимо того, у депрессивных пациентов, имеющих гипотиреоидизм, была выявлена пониженная функция 5-НТ2А рецепторов мозга (Cleare et al., 1995; 1996).
Считается, что некоторые элементы поведения животных могут упрощенно моделировать соответствующие психические функции и заболевания человека. Линия крыс FK была создана в Институте Цитологии и Генетики СО РАН г. Новосибирска в ходе многолетней селекции на предрасположенность к одному из видов пассивно-оборонительного; поведения, каталепсии, из крыс аутбредной популяции Вистар. Каталепсия или реакция замирания представляет собой обратимое непроизвольное обездвиживание с пластическим мышечным тонусом (Карманова, 1977), и у лабораторных животных определяется как невозможность скорректировать внешне приданную позу (Sanberg et al., 1988). В естественных условиях она связана со страхом и является пассивно-оборонительной реакцией (Gallup, 1977). Для человека каталепсия утратила свой изначальный оборонительный смысл, в чрезмерно выраженной форме она сохранилась как симптом ряда психических и нервных заболеваний, таких как шизофрения и депрессия (Abrams et al., 1979; Авруцкий, Недува, 1981; Singerman, Raheja, 1994).
Следует отметить, что хотя основная симптоматика депрессивного синдрома связана с нарушениями в эмоциональной сфере, в его основе предполагают нарушение защитного поведения, а именно усиление его пассивных элементов и стратегий (Dixon, 1998). У крыс селекция на предрасположенность к пассивно-оборонительному типу реагирования привела к появлению ряда черт, поведения и физиологических признаков, сходных с наблюдаемыми при депрессивных расстройствах: снижение спонтанной двигательной активности (Барыкина и др., 1983), понижение локомоторной и исследовательской активности в тесте открытого поля (Петрова, 1990; Barykina et al., 2002), увеличение времени неподвижности в тесте принудительного плавания (Nikulina et al., 1987), ухудшение обучения при выработке двухстороннего рефлекса избегания в челночной камере (Штильман и др., 1988) и пищевого ситуационного рефлекса (Петрова, 1990), дефицит дельта-сна (Карманова, Оганесян, 1994), снижение продукции тестостерона и альдостерона (Шульга и др., 1996). Все это дало основание предположить, что линия крыс ГК может явиться моделью депрессии. Однако оставался невыясненным существенный вопрос - реакция животных этой линии на препараты, обладающие антидепрессивной активностью, что рассматривается как принципиально важная характеристика экспериментальной модели депрессивных расстройств (Winner, 1990; Geyer, Markou, 1995; Willner, Mitchell, 2002):
Наряду с депрессивно-подобными чертами у крыс ГК наблюдались, изменения в тиреоидном статусе и на уровне 5-НТгА серотониновых рецепторов мозга. Крысы линии ГК отличались сниженным уровнем общего тироксина в крови по сравнению с крысами родоначальной линии Вистар (Барыкина и др., 2001; Barykina et al., 2002), а также пониженной плотностью в стриатуме (Popova, Kulikov, 1995) и ослабленной функциональной активностью (Kolpakov et al., 1996) 5-НТ2А рецепторов. В то же время, у крыс некаталептической линии Вистар тиреоидэктомия вызывала повышение предрасположенности к каталепсии (Барыкина и др., 2001; Barykina et al., 2002), с одной стороны, и снижение плотности (Kulikov et al:, 1999; Куликов, Жонингро, 2000) и экспрессии гена (Куликов и др., 2002) 5-НТ2д рецепторов во фронтальной коре, с другой.
Таким образом, модели генетически обусловленной и вызванной недостатком тиреоидных гормонов каталепсии у крыс представляются удобными для изучения влияния тиреоидных гормонов на поведение и участия 5-НТ2д серотониновых рецепторов в реализации этих эффектов.
Кроме того, они могут оказаться перспективными моделями для определения роли тиреоидных гормонов и 5-НТ2а рецепторов в механизмах развития депрессии и действия антидепрессантов. Для подтверждения этой возможности важно исследовать на этих моделях влияние препаратов, клинически эффективных при депрессии, на поведенческом и молекулярном уровнях.
Целью данной работы являлось изучение влияния тиреоидных гормонов и классического антидепрессанта имипрамина на каталепсию и роли 5-НТ2А серотониновых рецепторов мозга в механизмах регуляции реакции замирания у крыс.
В связи с этим были поставлены следующие задачи: 1". Изучить влияние хронического введения тироксина на выраженность реакции замирания у крыс линии ГК.
Исследовать воздействие хронического введения ингибиторов синтеза тироксина на проявление каталепсии у крыс линии Вистар.
Определить влияние острого эффекта и динамику ответа на хроническое введение трициклического антидепрессанта имипрамина у крыс линии ГК.
Исследовать исходный уровень мРНК 5-НТ2д рецепторов во фронтальной коре мозга и влияние хронического введения имипрамина на этот показатель у крыс линий ПС и Вистар.
Изучить влияние хронического введения ингибитора синтеза тироксина пропилтиоурацила на уровень мРНК 5-НТ2а рецепторов во фронтальной коре мозга и их функциональную активность у крыс линии Вистар.
Определить воздействие хронического введения имипрамина крысам Вистар, длительно получавшим пропилтиоурацил, на выраженность каталепсии и уровень экспрессии гена З-НТгд рецепторов во фронтальной коре мозга.
Научная новизна работы. В настоящей работе впервые: установлено, что гормон щитовидной железы тироксин влияет на каталепсию, уменьшая ее проявления, а ингибиторы его синтеза, пропилтиоурацил и мерказолил, обладают каталептогенным эффектом у крыс; изучено влияние трициклического антидепрессанта имипрамина на проявление реакции замирания у крыс, и выявлено, что хроническое, но не острое введение имипрамина снижает выраженность реакции замирания у крыс с генетической предрасположенностью к каталепсии, а также предотвращает проявление каталепсии, возникающей при длительном применении пропилтиоурацила; установлена связь генетически детерминированной каталепсии со снижением экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов во фронтальной коре мозга у крыс, и показано повышение уровня мРНК 5-НТ2Д рецепторов коры мозга у крыс линии ГК после хронического- введения имипрамина, но не у крыс линии Вистар, длительно получавших пропилтиоурацил; обнаружено, что хроническое введение пропилтиоурацила вызывает повышение функциональной активности б-НТгд рецепторов мозга без изменений на уровне экспрессии гена этого типа рецепторов во фронтальной коре.
Теоретическая и научно-практическая ценность работы. Реакция замирания у крыс линии ГК с генетически обусловленной предрасположенностью к каталепсии оказалась чувствительной к хроническому, но не острому введению имипрамина, а также к хроническому введению тироксина. Это согласуется с клиническими наблюдениями по динамике терапевтического эффекта антидепрессантов и тиреоидных гормонов, т.е. подтверждает «прогностическую достоверность» (predictive validity) этой модели как модели депрессии. Учитывая показанное ранее соответствие другим критериям модели депрессивных расстройств, данные настоящего исследования позволяют предложить линию крыс ГК как удобную и адекватную модель для изучения механизмов действия антидепрессантов и развития депрессии.
Полученные данные о влиянии тиреоидных гормонов на выраженность реакции замирания расширяют и уточняют существующие представления о механизмах контролирования каталепсии и роли тироксина в регуляции поведения. Исследование эффектов хронического введения ингибиторов синтеза тироксина привлекает внимание к влиянию этих препаратов на поведение и возможным механизмам этого воздействия.
Разработаны полуколичественная и количественная модификации метода ОТ-ГЩР, позволяющие воспроизводимо и точно определять уровень экспрессии генов серотониновых рецепторов в мозге.
Положения, выносимые на защиту:
Высокая выраженность каталепсии связана со снижением уровня общего тироксина в крови у крыс, а хроническое введение тироксина оказывает антикаталептическое действие.
Генетически детерминированная каталепсия у крыс чувствительна к хроническому, но не острому введению трициклического антидепрессанта имипрамина, что соответствует динамике клинического эффекта препаратов этой группы при лечении депрессии у человека.
Проявление наследственно обусловленной каталепсии, в отличие от каталепсии, вызванной введением пропилтиоурацила, ассоциировано с уровнем экспрессии гена 5-НТ2а рецепторов во фронтальной коре мозга у крыс.
Хроническое введение ингибитора синтеза тироксина пропилтиоурацила приводит к посттрансляционным изменениям 5-НТ2Д рецепторов мозга у крыс линии Вистар.
Апробация результатов. Полученные результаты были представлены и обсуждены на отчетной сессии Института цитологии и генетики в 2003 году, на XL международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2002), на IV съезде физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 2002), на 2-й научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии" (Новосибирск, 2002), на 7-й междисциплинарной конференции по биологической психиатрии «Стресс и поведение» (Москва, 2003), на 6-м Всемирном конгрессе IBRO по нейронаукам (Прага, 2003), на XIX съезде Российского физиологического Общества им. И.П; Павлова (Екатеринбург, 2004) и на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 6 статей в рецензируемых отечественных (4) и международных (2) журналах.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность соавторам опубликованных работ, сотрудникам Института цитологии и генетики СО РАН к.б.н. Н.Н. Барыкиной, н.с. В.Ф. Чугуй и к.б.н. Т.А. Алехиной, за обучение методикам, помощь в проведении ряда экспериментов и моральную поддержку. Особо автор благодарит идейных вдохновителей и руководителей работы д.м.н., проф. Н.К. Попову, д.б.н. В.Г. Колпакова и к.б.н. А.В. Куликова.
Экспериментальные модели каталепсии
Термин «экспериментальная каталепсия» ввели в обиход De Jong и Baruk в 1930 году, описав каталепсию, вызванную введением бульбокапнина (цит. по: Колпаков, 1990). И до настоящего времени состояние каталепсии в эксперименте чаще всего вызывают введением различных фармакологических препаратов. Наиболее известны и широко распространены модели каталепсии, индуцируемой введением нейролептиков ("нейролептическая" каталепсия) или веществ, изменяющих состояние опиатной системы мозга ("опиатная" каталепсия) (DeRyck et al., 1980; DeRyck, Teitelbaum, 1984).
Было показано, что каталептогенным эффектом также обладают препараты, влияющие на другие медиаторные системы мозга: агонисты ГАМКА (Young et al., 1995; Khisti et al., 1998; Mandhane et al:, 1999) и ГАМКВ рецепторов (Carter et al.,. 2005), агонисты аденозиновых Агл рецепторов (Khisti et al., 2000), ингибиторы синтеза NO (Del Bel et al;, 2005), агонисты Mi мускариновых рецепторов и ингибитор холинэстеразы физостигмин (Ushijima et al., 1997), гистамин (Nowak, Pile, 1975; Onodera, Shinoda, 1991). Кроме того, оказалось, что , многие вещества, модулирующие состояние неиромедиаторных систем, способны влиять на проявления каталепсии (Табл.1).
Описаны также случаи нефармакологической экспериментальной каталепсии. Многие ученые занимались опытами по,гипнотизированию птиц и более крупных животных, как с помощью метода Швентера, так и,применяя другие воздействия. В качестве каталептогенного фактора использовали одевание на глаза непроницаемых колпачков, равномерное поглаживание животного или давление на кожу, сильное сжатие хвоста или лапы пинцетом (Карманова, 1964). Было показано, что можно ввести взрослых крыс в состояние каталепсии, если отвести их передние лапы назад за задние лапы, которые сводят вместе и выдвигают одновременно вперед («поза Будды») (Boissier, Simon, 1963). Ornstein и Amir (1981) открыли метод вызывания каталепсии у мышей с помощью защипывания кожи загривка (pinch-induced catalepsy).
Оказалось, что не только тактильные и болевые ощущения могут вызвать состояние обездвиженности. Реакция замирания возникает и под действием других стимулов, если они монотонно повторяются. Примером может служить каталепсия, которую наблюдал И.П. Павлов у собак при выработке условных рефлексов. При многократном повторении одной и той, лее ситуации собаки переставали реагировать на условные сигналы, и у них появлялись признаки каталептоидной обездвиженности. Этот тип реакции замирания И.П. Павлов представлял как сильно увеличенные по продолжительности гипнотические переходные фазы, которые и в норме присутствуют у птиц и млекопитающих при переходе от. бодрствования ко сну, но в мимолетном, кратковременном виде (Павлов, 1951). И.Г. Карманова (1964) обнаружила особый вид каталепсии, названный ею «фотогенной каталепсией», который проявлялся у кур, морских свинок и лягушек под действием ритмического света..
Существует также тип каталепсии, имеющий вид вертикальной стойки, сходной с оборонительной позой, и называемый некоторыми авторами "псевдокаталепсией" (Ferre et ah, 1990). Особый вид каталептической обездвиженности развивается после аудиогенного судорожного припадка (Ornstein, Segal, 1980).
Большой интерес представляют модели генетической предрасположенности к каталепсии, позволяющие исследовать этот феномен на более глубоком, геномном уровне. Было выявлено существование определенной наследственной предрасположенности к реакции каталептического замирания у кур (Gallup, 1974; Gallup et al., 1976), перепелов (Benoff, Siegel, 1976; Mills, Faure, 1991), крыс (McGraw, Klemm, 1973; Kolpakov et al., 1981; Барыкина и др., 1983) и мышей (Куликов и др., 1989; Куликов, 2004). Остановимся подробнее на характеристике генетических моделей предрасположенности к каталепсии у крыс и мышей, являющихся наиболее распространенными лабораторными объектами. Результаты последних исследований этих моделей с помощью современных методик позволили значительно расширить представления о генетических, молекулярных и физиологических механизмах, лежащих в основе феномена каталептического замирания (Колпаков и др., 2004; Куликов, 2004).
У мышей инбредной линии СВА, поддерживаемой в виварии Института цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирска, была выявлена высокая предрасположенность к щипковой каталепсии (Куликов и др., 1989): у 54% мышей этой линии после 4-5 тестов (кратковременного раздражения рефлексогенной зоны шеи мыши с последующим ее помещением на разновысокие перекладины) развивалась стойкая и воспроизводимая каталепсия, длившаяся в течение нескольких минут (Рис.2А). Пенетрантность признака не менялась на протяжении 11 лет непрерывных наблюдений (Куликов, 2004). Было показано, что у мышей СВА высокая предрасположенность к каталепсии детерминируется одним рецессивным аутосомным локусом (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993).
Линия крыс ГК была получена в Институте Цитологии и Генетики СО РАН г.Новосибирска в ходе многолетней селекции на предрасположенность к каталепсии из крыс аутбредной популяции Вистар. Более чем у 50% животных этой линии развивается стойкая реакция замирания при приподнимании в вертикальное положение за передние лапки (Барыкина и др., 1983; Колпаков, 1990) (Рис.2Б). Наследование предрасположенности к каталепсии у крыс линии ГК может быть описано майоргенной моделью с пенетрантностью 50% (Колпаков и др., 1999).
Полуколичественный метод ОТ-ПЦР (Обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция)
Печень; мыши была отмыта от крови раствором А (0,25М сахарозы, 50мМ Трис-HCl (рН = 8,4), ббмМ ЭДТА и 25мМ КС1) и гомогенизирована в том же растворе. К гомогенату добавляли тритон Х-100 (до 1%). Полученную смесь перемешивали в течение 5 мин, после чего профильтровывали через капроновую сетку. После центрифугирования (5 мин при 2500 об/мин, 4С) смесь была вновь ресуспензирована в растворе А и центрифугирована в течение 5 мин при 1500 об/мин (4С). К полученному осадку ядер был добавлен раствор Б (16мМ Трис-HCl (рН=8,4), 66мМ ЭДТА и 0,1М NaCl) и SDS до концентрации 1% при тщательном; перемешивании. После лизиса клеток была добавлена протеиназа К до конечной концентрации 100 мкг/мл, и полученный раствор инкубировался при 45С в течение 18 ч. К прозрачному, вязкому раствору добавляли равный объем смеси фенола с хлороформом, насыщенной. 0,1М Трис-HCl буфером (рН = 8,0). Полученная смесь перемешивалась на встряхивателе в течение 30 мин. После центрифугирования (15 мин при 4000 об/мин, 20С) водную фазу переносили в чистую пробирку Эппендорф на 1,5 мл, где ДНК преципитировалась равным объемом изопропанола. После промывания 75% этанолом, осадок ДНК растворяли в стерильной воде. Концентрация ДНК определялась по ее оптической плотности, измеренной при 260 нм, а чистота - по соотношению оптических плотностей при 260 и 280 нм. Выделенную ДНК разводили стерильной водой до концентрации 10 и 100 иг/мкл и хранили при -20С. Поскольку размер генома мыши составляет 2,493x10 п.н. и весит, соответственно, около 5 пг, то использованные внешние ДНК-стандарты содержали 2000 и 20000 копий изучаемых генов в 1 мкл, соответственно.
Количественную оценку уровня экспрессии мРНК 5-НТ2А рецепторов проводили методом ОТ-ПЦР в модификации, разработанной в лаборатории при участии автора (Kulikov et ah, 2005), В работе использовали тот же набор реактивов, что и в полуколичественной модификации метода (за исключением праймеров для З-НТгд рецепторов), и амплификатор Mastercycler personal; Eppendorf. Праймеры для амплификации фрагмента гена 5-НТ2А рецепторов ("Биосан", Новосибирск, Россия) были подобраны в третьем экзоне гена (прямой 5 -agaagccaccttgtgtgtga и обратный 5 tgctcattgctgatggact; размер продукта амплификации - 170 п.н.) на основе опубликованных последовательностей (Julius et al., 1990; Charest et al., 1993) при помощи Oligo software и проверены на специфичность по базе данных Fasta3. Идентичность нуклеотиднои последовательности продукта амплификации была подтверждена рестрикционным анализом с использованием эндонуклеазы Foe I ("Сибэнзим", Новосибирск, Россия). Размеры рестрикционньгх фрагментов соответствовали предсказанным.
Для проведения обратной транскрипции в стерильной пробирке на 500 мкл смешивали 1 мкг суммарной РНК (8 мкл) с 8 мкл смеси, содержащей 180; нг рандомного праймера и 2,25 мкмолей стерильного КС1. Конечную смесь в объеме 16 мкл денатурировали при 94С в течение 5 мин, отжигали при 41С в течение 15 мин, а затем добавляли 15 мкл буфера, содержащего 200 е.а. обратной транскриптазы, 0,225 мкмолей Трис-НС1, 0,015 мкмолей каждого из четырех dNTP, 0,225 мкмолей ДТТ и 0,03 мкмолей МпС12. Смесь (в конечном объеме 31 мкл) инкубировали при 41 С в течение 60 мин. Полученную кДНК хранили при -20С.
Для проведения ГЩР в стерильной пробирке на 250 мкл смешивали аликвоту в 1 мкл кДНК с 5 мкл смеси специфичных праймеров (по 250 пикомолей каждого) для гена 5-НТ2А рецепторов или Р-актина и добавляли 14 мкл смеси, содержащей 1,0 е.а. Taq-полимеразы, 2 мкл буфера ПЦРхЮ, 1 мкл dNTP, 0,3 мкл 0,1M MgClj и стерильную воду до конечного объема. Пробирки с внешним стандартом содержали вместо кДНК такое же количество соответствующего ДНК-стандарта (100 нг/мкл для определения Р-актина или 10 нг/мкл для определения 5-НТгА рецепторов). Амплификацию проводили в режиме горячей крьппки. При определении уровня мРНК 5-НТ2А рецепторов схема амплификации была следующей: 1) 94С - 5 мин; 2) 94С -40 с, 58С - 40 с, 72С - 40 с, 32 цикла; 3) 72С - 4 мин. Определение уровня экспрессии гена Р-актина проводили по следующей схеме амплификации: 1) 94С - 5 мин; 2) 94С - 40 с, 61С - 40 с, 72С - 40 с, 23 циклов; 3) 72С - 4 мин.
Было показано, что кривые зависимости интенсивности флуоресценции обоих продуктов ПЦР от числа циклов амплификации были линейны в пределах 21-28 циклов для р-актина и 28-32 циклов для 5-НТ2А рецепторов (Рис.6). Сходные кинетические кривые были получены, когда кДНК в образце заменялась 200 нг (для Р-актина) или 20 нг (для 5-НТ2А рецепторов) геномной ДНК внешнего стандарта. В подобранных условиях зависимость интенсивности флуоресценции обоих продуктов амплификации от количества раствора кДНК, добавленного в пробирку, была линейна в диапазоне от 0,125 до 1 мкл раствора кДНК (Рис.7). Возрастание флуоресценции продуктов ПЦР также бьшо линейно при использовании 1,25-20 и 12,5-200 нг геномной ДНК для 5-НТ2А рецепторов и Р-актина, соответственно. Таким образом, разработанный количественный метод оценки экспрессии позволял определять уровень мРНК в пределах 240-4000 копий для 5-НТ2Л рецепторов и 2400-40000 копий для р-актина. Было показано, что нижняя граница чувствительности количественного метода ОТ-ПЦР составляет примерно 40 копий геномной ДНК (Шумейко, Куликов, 2005). Следовательно, отсутствие отцифровываемых полос амплификатов после проведения ПЦР с препаратами РНК образцов на 32 циклах говорит, что погрешность измерения уровня мРНК 5-НТ2А рецепторов за счет возможного влияния примесей геномной ДНК составляет менее 10% от полученных значений.
Эффект имипрамина на выраженность реакции замирания у крыс линий ГК и Вистар
Было выявлено достоверное влияние фактора «ПТУ» (Fi,79 = 5,5, р 0,05) на время каталептического замирания у крыс линии Вистар. Хроническое введение имипрамина не меняло выраженность каталепсии (6,4 ±2,2 си 4,0 ± 2,8 у контрольных и получавших имипрамин в средней суточной дозе 15 мг/кг животных, соответственно, р 0,05) и процент каталептиков (19,2% в группе «Контроль» и 6,7% в группе «Имипрамин») у нормотиреоидных крыс линии Вистар. Напротив, введение имипрамина предотвращало проявление высокой предрасположенности к каталепсии у крыс Вистар, получавших хронически пропилтиоурацил. Действительно, крысы, которым давали пропилурацил совместно с имипрамином, характеризовались низкой продолжительностью замирания (10,5 ± 5,3 с, р 0,05) и процентом каталептиков (26,7%; % = 4,1, р 0,05) по сравнению с животными, получавшими только пропилтиоурацил в течение того же периода (длительность неподвижности - 37,6 ± 11,1 с; процент каталептиков - 59,3%), при этом они не отличались по данным параметрам от крыс, получавших только имипрамин в средней суточной дозе 15 мг/кг (Рис.1 ЗБ и 13В).
В то время как был выявлен эффект имипрамина на поведение крыс Вистар, длительно получавших пропилтиоурацил, достоверного влияния хронического введения препарата на соматические характеристики найдено не было. Было обнаружено значимое влияние фактора «ПТУ» (FIi79 = 106,9; р 0,001), но не фактора «имипрамин» (Fi;79 = 3,5; р 0,05) или взаимодействия этих факторов (Flj79 - 0,01; р 0,05) на прирост массы тела.
Эффект пропилтиоурацила и имипрамина на прирост массы тела (А), время замирания (Б) и процент животных, проявляющих каталепсию (В), у крыс линии Вистар.
Крысы получали воду (28 дней) (Контроль, п=26), раствор имипрамина (15 мг/кг; 21 день) (Имипрамин; п=15), раствор пропилтиоурацила (50 мг/л; 28 дней) (ПТУ; п=27) или в первую неделю раствор пропилтиоурацила (50 мг/л), а затем раствор, содержащий пропилтиоурацил и имипрамин (15 мг/кг), в течение 21 дня (ПТУ+Имипрамин; п=15). Данные представлены в виде М±т. р 0,05, р 0,01, р 0,001 по сравнению с «Контроль»; + + + р 0,001 по сравнению с «Имипрамин»; #р 0,05 по сравнению с «ПТУ».
Этот показатель был достоверно ниже в группах, подвергшихся хроническому воздействию пропилтиоурацила, чем в контрольных: он составил 43,2 ± 2,5 г в группе «ПТУ» против 84,6 ± 4,3 г в группе «Контроль» (р 0,001), а в группе «ПТУ+Имипрамин» - 51,0 + 2,9 г против 91,7 + 5,2 г в группе «Имипрамин» (р 0,001). Хроническое введение имипрамина не изменяло прирост массы тела ни у нормотиреоидных крыс линии Вистар (р 0,05), ни у крыс Вистар, хронически получавших пропилтиоурацил (р 0,05)(Рис.13А).
Таким образом, было показано, что хроническое, но не острое введение трициклического антидепрессанта имипрамина крысам линии ПС обладает антикаталептическим влиянием. Хроническое введение имипрамина также предотвращало проявление каталепсии у крыс Вистар, длительно получавших пропилтиоурацил, но не влияло на слабо выраженную реакцию замирания у крыс Вистар, не подвергавшихся другим воздействиям. Возникает закономерный вопрос о молекулярных механизмах, обуславливающих наблюдаемые изменения поведения.
Интересным представляется исследование влияния ингибиторов синтеза тироксина и имипрамина на серотониновые рецепторы 5-НТ2А подтипа, поскольку были обнаружены изменения плотности во фронтальной коре и функциональной активности этих рецепторов при депрессии (Агога, Meltzer, 1989; Hrdina et al„ 1993; Cleare et al., 1995; 1996) и после хронического введения антидепрессантов (McDonald et al., 1984; Lafaille et al., 1991; Bumet et al., 1994; Maj et al., 1996). Кроме того, ранее было показано, что крысы линии ГК отличаются более низкой функциональной активностью этих рецепторов по сравнению с крысами Вистар (Kolpakov et al., 1996), а гипотиреоидизм, вызванный тиреоидэктомией, у крыс Вистар сопровождается снижением плотности (Kulikov et al., 1999; Куликов, Жонингро, 2000) и экспрессии гена (Куликов и др., 2002) 5-НТ2д рецепторов во фронтальной коре мозга.
Обнаружены существенные различия в исходном уровне экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов у контрольных животных линий Вистар и ГК (2,19 ± 0,1 у Вистар и 1,73 ± 0,12 у ГК, Fuo = 7,1, р 0,05) (Рис.14).
Данные по экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов представляют отношение интенсивности флуоресценции полосы S-HTJA рецептора к интенсивности флуоресценции полосы В-актина и выражены как М±т. р 0,05 по сравнению с Вистар; Шр 0,01 по сравнению с ГК. В группах по 6-7 животных.
Выявлены достоверные влияния фактора "имипрамин" (Fi,2o = 7,0, р 0,05) и взаимодействия между факторами "генотип" и "имипрамин" (Fj o = 13,5, р 0,01) на уровень мРНК 5-НТ2А рецепторов во фронтальной коре мозга крыс. Хроническое введение имипрамина не меняло экспрессию мРНК 5-НТ2А рецепторов в коре мозга крыс линии Вистар (1,91 + 0,32 и 2,19 ± 0,1 (р 0,05) у животных, получавших имипрамин в средней суточной дозе 15 мг/кг, и контрольных, соответственно). В то же время, имипрамин существенно, почти вдвое увеличивал экспрессию 5-НТ2А серотониновых рецепторов в мозге крыс линии ГК (до 3,44 ± 0,39, р 0,01) (Рис.14).
Влияние хронического введения пропилтиоурацила и имипрамина на 5-НТ2А серотониновые рецепторы мозга крыс Вистар
Сходство воздействия имипрамина на каталепсию с клиническими наблюдениями говорит в пользу «прогностической достоверности» модели наследственно обусловленной каталепсии у крыс как модели депрессии. Еще одним свидетельством «прогностической достоверности» модели является антикаталептический эффект хронического введения тироксина, поскольку применение препаратов тиреоидных гормонов в терапии депрессии уменьшает ее проявления (Bauer, Whybrow, 1990; Cleare et al., 1996; Prange, 1996). Следовательно, учитывая показанное ранее соответствие другим критериям модели депрессивных расстройств, модель генетически обусловленной каталепсии, у крыс удовлетворяет всем необходимым критериям модели депрессии и может быть использована в качестве таковой. Поскольку в патогенезе депрессивных расстройств отводят значительную роль генетической компоненте (Allen, 1976; Robertson, 1987; Mendlewicz et al., 1992), то особая ценность данной модели заключается в наличии генетической предрасположенности к депрессивно-подобному поведению, что дает возможность изучать механизмы этих процессов на геномном уровне.
Возникает закономерный вопрос, каков же молекулярный механизм, обуславливающий эффект хронического введения имипрамина у крыс ГК, но не у крыс Вистар. Как было отмечено выше, имипрамин при хроническом воздействии изменяет плотность 5-НТ2Д рецепторов в коре головного мозга (Lafaille et al., 1991; Klimek et al., 1994). Ранее было показано, что крысы линий Вистар и ГК различаются по функциональной активности и плотности этих рецепторов в мозге (Popova, Kulikov, 1995; Kolpakov et al., 1996). В настоящей работе было обнаружено достоверное снижение уровня экспрессии гена 5-НТЗА рецепторов в коре мозга контрольных крыс ГК по сравнению с крысами Вистар. Похожее снижение экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов было найдено в коре мозга крыс FSL (Osterlund et al., 1999), селекционированных на высокую чувствительность к ингибитору холинэстеразы и отвечающих критериям модели депрессии (Overstreet, 1993;, Willner, Mitchell, 2002). Вероятно, именно уменьшение экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов и является причиной сниженной функции этих рецепторов в коре крыс линии ГК.
Можно было ожидать, что крысы линий ГК и Вистар будут отличаться и по воздействию имипрамина на 5-НТ2А рецепторы. Мы не выявили существенного влияния имипрамина на уровень экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов в коре мозга у крыс Вистар. Но были получены интригующие данные о почти двухкратном повышении экспрессии мРНК 5-НТ2А рецепторов у крыс ГК после хронического введения имипрамина в средней суточной дозе 15 мг/кг. Кажется, что полученные нами результаты не согласуются с имеющимися представлениями об угнетающем действии имипрамина на 5-НТ2А рецепторы. Однако, в отличие от понижающего влияния антидепрессантов на плотность 5-НТгл рецепторов коры мозга (Lafaille et al., 1991; Burnet et al., 1994), изменений уровня мРНК 5-HT2A рецепторов в коре у крыс при длительном введении имипрамина обнаружено не было (Burnet et al., 1994; Spurlock et al., 1994). Нами также показано, что хроническое введение имипрамина не вызывает существенного изменения экспрессии мРНК гена 5-НТ2Л рецепторов во фронтальной коре головного мозга у крыс Вистар. По-видимому, у обычных крыс изменения происходят на посттрансляционном уровне (Burnet et al., 1994).
В настоящем исследовании, используя крыс каталептической линии ГК, впервые было показано, что имипрамин способен при хроническом воздействии усиливать экспрессию мРНК 5-НТ2А рецепторов. Это является первой демонстрацией влияния имипрамина на регуляцию 5-НТ2Д рецепторов на геномном уровне. Усиление экспрессии мРНК рецепторов является устойчивым и длится, по крайней мере, 72 ч после прекращения введения препарата. Полученные результаты логически согласуются с данными о связи между низкой экспрессией гена 5-НТ2д рецепторов и. наследственной каталепсией. Действительно, наследственная предрасположенность к каталепсии у крыс ГК сочетается с низким уровнем мРНК 5-НТ2Л рецепторов,, имипрамин повышает уровень мРНК и одновременно снижает выраженность каталепсии. Таким образом, нами выявлены "атипичность" крыс ГК, их. отличие от "нормальных" крыс Вистар по реакции на хроническое введение имипрамина как на поведенческом, так и на молекулярном уровне.
Модель обусловленной экспериментальным гипотиреоидизмом каталепсии расширяет и дополняет сведения, полученные на крысах с генетической предрасположенностью к реакции замирания. Каталепсия, вызванная пропилтиоурацилом, у крыс линии Вистар оказалась чувствительной к введению имипрамина так же, как и генетически обусловленная реакция замирания у крыс ГК. Однако были обнаружены различия между этими двумя моделями на уровне экспрессии гена 5-НТ2Д рецепторов коры мозга. Если наследственная каталепсия сочеталась со сниженным уровнем мРНК 5-НТгд рецепторов, то каталептогенный эффект блокады синтеза тироксина не сопровождался подобными изменениями. Аналогично, хроническое введение имипрамина, оказывавшее антикаталептическое действие в обеих моделях, нормализовало уровень экспрессии гена 5-НТ2А рецепторов во фронтальной коре у крыс линии ГК, но не влияло на уровень мРНК 5-НТ2Д рецепторов у гипотиреоидных крыс Вистар. Это указывает на различие механизмов развития каталепсии и антикаталептического действия имипрамина у животных с генетически обусловленной и вызванной недостаточностью щитовидной железы предрасположенностью к каталепсии.
Таким образом, крысы линии ГК с генетически обусловленной предрасположенностью к каталепсии и крысы линии Вистар с экспериментально вызванным гипотиреоидизмом могут быть предложены как удобные и адекватные взаимодополняющие модели для дальнейшего изучения воздействия тиреоидных гормонов и антидепрессантов на поведение, механизмов этих эффектов на молекулярном уровне и генетических аспектов этих процессов, что необходимо для понимания патогенетических механизмов депрессивных расстройств и поиска новых, более эффективных путей их лечения.
