Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Роль тиреоидных гормонов (ТГ) в регуляции поведения и серотониновой системы головного мозга 10
1.1. Роль ТГ в зрелой нервной системе 10
1.1.1. Метаболизм ТГ в организме 10
1.1.2. Гомеостаз ТГ в головном мозге 13
1.1.3. Рецепторы ТГ 15
1.1.4. Функции ТГ в развивающемся и зрелом мозге 17
1.2. Роль ТГ в регуляции поведения 20
1.2.1. Клинические данные. Роль ТГ в психических заболеваниях 20
1.2.2. Способы экспериментального изменения тиреоидного статуса 22
1.2.3. Экспериментальные данные по влиянию ТГна поведение 24
1.3. Роль ТГ в регуляции серотониновой системы мозга 29
1.3.1. Структура серотониновой системы мозга 29
1.3.1.1. 5-НТіА рецептор 31
1.3.1.2. 5-НТ2Арецептор
1.3.2. Влияние избытка и недостатка ТГна серотониновую систему мозга 34
1.3.3. Гипотеза о роли серотониновой системы мозга в механизме
индивидуальной чувствительности к ТГ 36
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1. Экспериментальные животные 38
2.2. Экспериментальные серии 39
2.3. Поведенческие методики
2.3.1. Тестирование каталепсии 41
2.3.2. Тест «открытое поле» 41
2.3.3. Тест «свет/темнота» 42
2.3.4. Тест принудительного плавания (тест Порсолта) 43
2.3.5. Тестирование социального интереса з
2.4. Фармакологические эксперименты 44
2.4.1. Измерение функциональной активности 5-HT2A рецепторов 44
2.4.2. Измерение функциональной активности 5-HJ)А рецепторов
2.5. Определение общего тироксина крови 44
2.6. Определение экспрессии генов
2.6.1. Выделение общей РНК из структур мозга 45
2.6.2. Обратная транскрипция 46
2.6.3. Реакция ПЦР 48
2.6.4. Электрофорез 49
2.7. Статистика 49
Глава 3. Результаты исследования 50
3.1. Первая экспериментальная серия. Отсроченное действие тироксина (Т4) .50
3.1.1. Измерение уровня Т4 в крови 50
3.1.2. Влияние Т4 на каталепсию 51
3.1.3. Влияние Т4 на поведение в тесте «открытое поле» 52
3.1.4. Влияние Т4 на поведение в тесте «свет/темнота» 53
3.1.5. Влияние Т4 на поведение в тесте принудительного плавания 54
3.1.6. Отсроченное действие Т4 на активность и экспрессию 5-НТ2А рецепторов во фронтальной коре 55
3.1.7. Отсроченное действие Т4 на активность и экспрессию 5-HTJA рецепторов во фронтальной коре мозга, гиппокампе и среднем мозге 57
3.2. Вторая экспериментальная серия. Влияние фрагмента 13й хромосомы на
чувствительность к гипертиреоидному статусу 59
3.2.1. Измерение уровня Т4 в крови 59
3.2.2. Поведение в тесте «открытое поле» 59
3.2.3. Поведение в тесте «свет/темнота» 60
3.2.4. Поведение в тесте принудительного плавания 61
3.2.5. Поведение в тесте социального интереса 61
3.2.6. Экспрессия 5-НТ2А рецепторов во фронтальной коре мозга 62
3.2.7. Экспрессия 5-НТ1А рецепторов во фронтальной коре мозга, гиппокампе и среднем мозге 63
Глава 4. Обсуждение результатов 65
Выводы 76
Список цитируемой литературы
- Роль ТГ в регуляции поведения
- Тестирование каталепсии
- Влияние Т4 на каталепсию
- Поведение в тесте социального интереса
Введение к работе
Актуальность проблемы
Тиреоидные гормоны (ТГ) играют ключевую роль в онтогенезе центральной нервной системы и поведении. Имеются многочисленные клинические наблюдения о связи нарушений тиреоидной функции с психическими расстройствами. Однако данные об участии ТГ в регуляции поведения и психики противоречивы и мало изучены. Одни авторы связывают риск депрессии с гипертиреоидизмом (Joffe, Levitt, 1993; Musselman, Nemeroff, 1996), в то же время другие – с гипотиреоидизмом (Baumgathner et al., 1994; Bauer et al., 2002). В ряде случаев ТГ используются для лечения некоторых форм депрессивных расстройств и для усиления действия трициклических антидепрессантов (Joffe, Levitt, 1993; Musselman, Nemeroff, 1996; Kelly, Lieberman, 2009). Более того, тироксин (Т4) широко используется для лечения различных форм нарушения тиреоидной функции. Однако эффекты хронического употребления ТГ на нервную систему и психику не изучены. Более того, не выяснены механизмы индивидуальной чувствительности к ТГ (Bauer et al., 2003).
Согласно наиболее распространенной гипотезе, ТГ осуществляют регуляцию поведения через изменение функции серотониновой системы мозга (Kirkegaard, Faber, 1998; Bauer et al., 2002). Действительно, было установлено участие ТГ в регуляции 5-HT2A рецепторов в головном мозге: тиреоидэктомия уменьшает плотность (Kulikov et al., 1999) и уровень мРНК (Куликов и др., 2002) 5-НТ2А рецепторов в коре мозга крыс Wistar, а высокие дозы Т4 увеличивают плотность (Mason et al., 1987) и функциональную активность 5-НТ2А рецепторов у крыс (Tikhonova et al., 2005).
Показана ассоциация между реакцией замирания (каталепсией), 5-HT1A, 5-HT2A рецепторами и ТГ (Kulikov, Popova, 2007). У крыс каталепсия сопровождается снижением Т4 в крови (Barykina et al., 2002; Tikhonova et al., 2005), в то время как хроническое введение Т4 оказывает антикаталептическое действие (Kulikov et al., 2002). С другой стороны, каталепсия связана с серотониновой системой мозга (Popova, 1999): крысы каталептической линии ГК имеют сниженную плотность 5-НТ2А рецепторов в стриатуме по сравнению с животными устойчивой к каталепсии линии Wistar (Kulikov et al., 1995). Агонист 5-НТ1А рецепторов 8-OH-DPAT ингибирует каталепсию (Kulikov et al., 1994; Попова и др., 1994; Prinssen et al., 2002).
Другой разновидностью наследственной каталепсии является «щипковая каталепсия» (pinch-induced catalepsy) мышей (Ornstein, Amir, 1981). В настоящее время изучен генетический контроль наследственной каталепсии мышей и показана локализация главного гена каталепсии в терминальном фрагменте хромосомы 13 (Куликов и др., 2003; Kondaurova et al., 2006; Kulikov et al., 2008). Выявлена связь наследственной каталепсии с 5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторами (Попова и др., 1994; Kulikov et al., 1995) и ее сцепление с геном 5-НТ1А рецептора (Kondaurova et al., 2006). Наследственная каталепсия мышей CBA была значительно усилена длительной селекцией и получена линия мышей ASC (Antidepressant Sensitive Catalepsy), в которой доля каталептиков достигала 85%. Мыши этой линии характеризуются депрессивно-подобными чертами поведения (Базовкина и др., 2005). Ассоциация между поведением, ТГ и серотониновыми рецепторами у мышей исследована не была.
Целью данной работы было сравнение хронического воздействия Т4 на поведение и серотониновые рецепторы головного мозга половозрелых мышей, различающихся по генетически детерминированной предрасположенности к каталепсии.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Сравнение эффектов хронического введения Т4 на каталепсию, поведение в тестах открытого поля, свет/темнота, принудительного плавания, а также на активность и экспрессию 5-HT1A и 5-HT2A рецепторов в структурах головного мозга у мышей каталептической линии ASC и устойчивой к каталепсии мышей линии AKR.
-
Изучение влияния терминального фрагмента 13й хромосомы линии мышей CBA, перенесенного в геном мышей AKR, на эффекты хронического введения Т4 в тестах открытого поля, свет/темнота, принудительного плавания, социального интереса, а также на экспрессию 5-HT1A и 5-HT2A рецепторов в структурах головного мозга у мышей каталептической линии AKR.CBA-D13Mit76 и устойчивой к каталепсии мышей линии AKR.
Научная новизна работы
В настоящей работе впервые:
показан каталептогенный эффект Т4 у мышей линии AKR;
установлено, что Т4 оказывает антидепрессантный эффект на мышей линии ASC, и это не связано с его влиянием на общую двигательную активность;
показано, что хроническое введение Т4 увеличивает у мышей AKR активность и экспрессию мРНК 5-HT2A рецепторов во фронтальной коре головного мозга;
показано, что эффекты хронического введения Т4 на выраженность каталепсии, двигательную активность в тесте «открытое поле», неподвижность в тесте принудительного плавания, агрессию в тесте социального интереса и функцию 5-HT1A и 5-HT2A рецепторов мозга зависят от генетически детерминированной предрасположенности к каталепсии у мышей;
установлено, что перенос терминального фрагмента хромосомы 13 от мышей линии СВА в геном мышей AKR подавляет вызванное Т4 увеличение двигательной активности и уровня мРНК 5-HT2A рецепторов у мышей конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76.
Теоретическая и научно-практическая ценность работы
Результаты настоящего исследования позволяют глубже понять физиологические и молекулярные механизмы воздействия ТГ на поведение, а также подтверждают предположение о связи между серотониновой системой мозга, нарушениями поведения и ТГ.
Мыши, различающиеся по генетически детерминированной предрасположенности к каталепсии, могут быть предложены в качестве моделей для изучения механизмов чувствительности к изменениям тиреоидного статуса: мыши линии AKR – для изучения нарушений поведения, вызванных ТГ; мыши линии ASC могут быть предложены как модель антидепрессантного действия ТГ; линия мышей AKR.CBA-D13Mit76 – моделью изучения взаимодействия цитокиновой и тиреоидной систем.
Результаты работы используются при чтении курса лекций «Молекулярные механизмы регуляции поведения» для студентов 4го курса факультета естественных наук Новосибирского государственного университета.
Положения, выносимые на защиту
-
Генетическая предрасположенность к каталепсии является биологическим предиктором эффектов хронического действия Т4.
-
Изменения в поведении, 5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторах мозга, наблюдаемые у животных AKR и ASC в первой экспериментальной серии, скорее всего являются следствием отсроченного действия Т4.
-
Хроническое действие Т4 вызывает у мышей линии AKR каталептогенный эффект, повышение горизонтальной двигательной активности, усиление агрессии на ювенильного самца, активацию и повышение экспрессии гена 5-НТ2А рецептора во фронтальной коре головного мозга.
-
Хроническое действие Т4 вызывает у мышей линии ASC: антикаталептический и антидепрессантный эффект, а также десенситизацию 5-НТ1А рецепторов мозга.
-
Концевой фрагмент 13й хромосомы от мышей линии CBA, перенесенный в геном мышей AKR, блокирует эффекты хронического введения Т4, наблюдаемые у мышей линии AKR.
Апробация результатов
Полученные результаты были представлены и обсуждены на XLIII и XLIV международных научных студенческих конференциях “Студент и научно-технический прогресс” (Новосибирск, 2005, 2006) и на III Съезде фармакологов России «Фармакология – практическому здравоохранению».
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них три статьи в рецензируемых отечественных (2) и международных (1) журналах и трое тезисов на конференциях.
Структура и объем работы
Роль ТГ в регуляции поведения
Два дийодированных остатка тирозина на одной молекуле тиреоглобулина коньюгируют с образованием остатков тироксина. Этот процесс катализируется ферментом пероксидазой. Фаза выведения состоит из резорбции зрелого тиреоглобулина пиноцитозом из коллоида, его гидролиза протеазами и выведения гормонов тироксина и трийодтиронина через базальную мембрану в кровь.
Основным продуктом щитовидной железы является тироксин или 3,5,3 ,5 -тетрайодтиронин (Т4). Не менее 90% содержащегося в крови йода приходится на его долю. Около 0,05% Т4 циркулирует в свободной форме, 75% связывается тироксинсвязывающим глобулином, 15-20% связано тироксинсвязывающим преальбумином или транстиретином. Период полураспада Т4 - 7-9 дней, латентный период - 72 часа.
Другим продуктом тиреоида является 3,5 ,3 -трийодтиронин (ТЗ). Его физиологическая активность в 3-10 раз выше, чем у Т4. В щитовидной железе образуется лишь 15% ТЗ. В основном он синтезируется в тканях при монодейодировании наружного кольца Т4. Время полураспада ТЗ - 2 дня, латентный период — 12 часов. Из-за такой разности в физиологических активностях Т4 иногда рассматривается как прогормон или транспортная форма ТЗ (Семененя, 2004).
У человека не обнаружено суточного ритма концентрации ТГ: у здорового человека базальный уровень йодтиронинов в крови поддерживается постоянным изо дня в день и даже из года в год. Но могут происходить большие изменения потребности в гормоне, как ответ на изменения условий жизни: потребление углеводов, физические нагрузки, недосыпание, изменение светового периода, пребывание на холоде. В норме щитовидная железа синтезирует у взрослого человека около 70 мкг Т4 в сутки. Нормальная концентрация в крови для ТГ составляет 100-130 нМ (Т4) и 2-3 нМ (ТЗ) для человека (Dratman, 1993) и 40-50 нМ (Т4) и 0,65-1,2 нМ (ТЗ) для крысы (Mason et al., 1987; Escobar-Morreale et al, 1996; Kulikov et al., 1997; 1999). Значительные отклонения концентрации ТГ от этих значений являются признаками дисфункции щитовидной железы и систем гомеостаза: снижение — признак гипотиреоидизма, увеличение - гипертиреоидизма.
Стабильность уровня циркулирующих в крови ТГ обеспечивается механизмом обратной связи, включающем гипоталамус, гипофиз и щитовидную железу. Факторами, определяющими концентрацию ТГ в организме, являются секреторная активность щитовидной железы, тканевый захват, метаболизм, рециркуляция и невосполнимые потери ТГ. Синтез ТГ непосредственно регулируется гормоном аденогипофиза - тиреотропином, который является гликопротеином, состоящим из двух субъединиц. Секреция тиреотропина в свою очередь регулируется трипептидным гормоном медиобазального гипоталамуса - тиреолиберином. Уровень секреции тиреолиберина регулируется ТЗ и Т4 по принципу отрицательной обратной связи. Повышение концентрации ТГ в крови снижает секрецию тиреолиберина, концентрацию тиреотропина и функцию щитовидной железы. Противоположные изменения наблюдаются при снижении концентрации ТГ. Такая тесная функциональная связь между тиреолиберином гипоталамуса, тиреотропином гипофиза и ТГ щитовидной железы является физиологическим основанием объединения их в гипоталамо-гипофизарно-тиреоидную систему (ГГТС) организма.
Основная масса ТГ в крови связана с белками-переносчиками. Этот пул связанных гормонов вместе с гормонами в коллоиде фолликулов являются буфером для поддержания гомеостаза ТГ в организме. Секретированные ТГ попадают в кровь, где связываются со специфическими белками-носителями -тиреосвязывающим глобулином (70%), транстиретином (20%) и альбумином (10%). Незначительное количество ТЗ (0.2-0.4%)) и Т4 (0.02-0.04%) находится в свободной (активной) форме. Связанные белками и запасенные в тканях гормоны составляют пул ТГ организма, который служит долгое время их источником после удаления щитовидной железы. Проникать в клетку, взаимодействовать со специфическими рецепторами, оказывать биологические эффекты могут только свободные гормоны. Поэтому белки-переносчики, регулируя концентрацию свободного гормона, могут контролировать эффекты ТГ в тканях (Dratman, 1993; Bartalena, 1990).
Транстиретин (ТТР) играет важную роль в транспорте и распределении тиреоидных гормонов в ЦНС, осуществляя активный транспорт Т4 через гематоэнцефалический барьер (Lechan, Топі, 2002). Нарушения функций этого транспортного белка могут вызвать гипотиреоидизм мозга при нормальных концентрациях ТГ в крови (Sullivan et al., 1999; Robbins, 2002).
ТГ из кровотока захватываются различными тканями: мышцами, печенью, мозгом, где подвергаются дальнейшему метаболизму с помощью монодейодиназ до ТЗ, гТЗ и Т2. В нормальных физиологических условиях 80% ТЗ образуется в результате внутриклеточного монодейодинирования в тканях. Известны дейодиназы первого, второго и третьего типа (5 DI, 5 D1I и 5 Dili). 5 DI и 5 DII осуществляют превращение Т4 в ТЗ в мозге у крыс, а в мозге у человека найдена только 5 DII (Campos-Barros et al., 1996). 5 DI экспрессируется, главным образом, в печени, которая является основным органом метаболизма ТГ в организме. Печень обеспечивает поддержание уровня гормонов в нормальных условиях, а также при отклонениях их концентрации в крови от физиологических величин.
Тестирование каталепсии
Были проведены две последовательные экспериментальные серии по изучению хронического влияния тиреоидных гормонов на взрослых мышей.
Цель первой экспериментальной серии - выяснение отсроченного действия тиреоидных гормонов на выраженность поведения, активность и экспрессию 5-НТ!Л и 5-НТ2А рецепторов у мышей родственных линий, различающихся по генетической предрасположенности к каталепсии и выраженности депрессивноподобного поведения. Для этой серии были взяты 40 мышей линии AKR/J и 36 ASC/Icg. Половина животных обеих линий в течение 60 дней получали воду, содержащую тироксин (Берлин-Хеми, Германия) в концентрации 2 мг/л (экспериментальная группа). Воду меняли через два дня. Другая половина служила контролем и получала обычную воду. На 6 Г1 день с начала эксперимента животным экспериментальной группы перестали добавлять Т4 в питьевую воду, чтобы у них нормализовался уровень тироксина в крови. На 63й день животных контрольной и экспериментальной групп изолировали в индивидуальных клетки для снятия группового эффекта, и содержались так до окончания экспериментального периода. Измерения поведения начинались на следующий день после изоляции. Поведенческие тесты проводились в следующем порядке: (1) тест на каталепсию, (2) тест открытого поля, (3) тест «свет/темнота», (4) тест принудительного плавания. С интервалами в один — два дня между тестами. Затем половину животных забивали для определения уровня Т4 в крови и экспрессии генов 5-НТ]Л и 5-НТ2д рецепторов, а другую половину использовали для определения активности 5-HTIA И 5-НТ2Л рецепторов (между фармакологическим экспериментами был перерыв в один день). Для проверки тиреоидного статуса животных в течение эксперимента 7 самцов AKR и 7 самцов ASC того же возраста и веса получали Т4 в течение 14 дней, а другие 7 самцов AKR и 7 самцов ASC — воду в течение этого периода. Этих 28 животных забивали на 15й день для определения уровня Т4 в плазме крови.
Цель второй экспериментальной серии - выяснить влияние фрагмента 13й хромосомы мышей линии CBA/LacJ, определяющего предрасположенность к каталепсии, на чувствительность к гипертиреоидному статусу. Для этой серии были взяты 25 мышей линии AKR/J и 21 AKR.CBA-D13Mit76. 11 мышей линии AKR/J и 8 AKR.CBA-D13Mit76 получали воду, содержащую тироксин (Берлин-Хеми, Германия) в концентрации 2 мг/л, в течение 60 дней и продолжали получать ее на протяжении всех поведенческих тестов вплоть до забоя. Воду меняли через два дня. Оставшиеся мыши (14 AKR/J и 13 AKR.CBA-D13Mit76) получали обычную воду. За два дня до поведенческих тестов животных изолировали в индивидуальные клетки для снятия группового эффекта, и содержались так до окончания экспериментального периода. Поведенческие тесты проводились с интервалом в один - два дня. Поведенческие тесты проводились в следующем порядке: (1) тест открытого поля, (2) тест «свет/темнота», (3) тест принудительного плавания, (4) тестирование социального интереса. Затем мышей забивали для определения уровня тироксина в крови и измерения экспрессии генов 5-НТіл рецептора, 5-НТ2л рецептора.
Все поведенческие тесты проводили в дневное время. Через день после окончания серии тестов животных декапитировали, собирали кровь в обработанные гепарином пробирки эппендорф, пробирки центрифугировали 3 000 g и сыворотку переливали в отдельные пробирки эппендорф и хранили при -20 С до определения Т4. На холоду вынимали мозг, выделяли переднюю кору, гиппокамп, средний мозг и помещали структуры в пробирки Эппендорф на 1.5 мл, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре —66С до выделения общей РНК для последующего определения экспрессии генов.
Каталепсию вызывали, зажимая в течение 5 с кожу загривка, затем животное помещали на две параллельные, разновысокие перекладины, расположенные под углом 45 градусов. Тест считался положительным, если период, в течение которого мышь сохраняла приданное ей неестественное положение, был не менее 20 секунд. Время теста ограничивали 120 с, после чего животное возвращали в домашнюю клетку. Каждый из последовательных 10 тестов проводили с интервалом в 1-2 мин. Животное, дающее 3 положительных теста из 10, рассматривалось, как каталептик (Куликов и др., 1989;Kulikovetal., 1993).
Этот тест разработан для изучения локомоторной и исследовательской активности в условиях слабого стресса, вызванного ярким светом и открытым пространством (Denenberg, 1969). В первой экспериментальной серии тест проводился на арене размером 80x80x20 см., сделанной из белого пластика и освещаемой лампой 200 Вт. Арена виртуально была разделен на 64 квадратика (10x10 см) и выделена центральная область 40x40 см (центр). Животное помещали на арену около стенки на одинаковом расстоянии между двумя углами и его движение регистрировали с помощью цифровой видеокамеры, расположенной на расстоянии 180 см от арены. Двигательная активность и время нахождения в центре арены измерялись автоматически с помощью первой версии компьютерной программы EthoStudio (Куликов и др., 2005). Чтобы программа могла распознать белых мышей линии AKR/J, на их спине ставили пятно черным маркером за несколько дней до измерения.
Во второй серии тест проводили в круглой арене диаметром 40 см из серого пластика и дном, изготовленным из полупрозрачного пластика. Для увеличения контраста освещение проводилось через полупрозрачный пол арены (Куликов и др., 2007). Мышь помещали у стенки арены и ее перемещение регистрировали с помощью цифровой видеокамеры, расположенной на расстоянии 120 см от поверхности арены. Трассировку животного в проходящем свете проводили с помощью оригинальной программы EthoStudio (http://www.ethostudio.com). Двигательную активность оценивали по длине пути, пройденному мышью (см). Также определяли вероятность нахождения мыши в центре (диаметром 20 см) (Kulikov et al., 2008b).
В обеих сериях тестирование длилось 300 с. Число вертикальных стоек определяли визуально.
Данный тест предназначен для изучения тревожности и основан на противодействии естественного страха животного перед открытым, освещенным пространством и ориентировочно-исследовательской реакции. Мышь предпочитает находиться в темном отсеке. Считается, что чем больше времени животное проводит в темном отсеке, тем выше ее тревожность (Crawley, 1985). В первой экспериментальной серии установка представляла камеру, состоявшую из двух отсеков: открытого (27x27x27см), покрашенного белой краской и освещенного лампой 200 Вт, и закрытого (27x18x27 см.), покрашенного черной краской и закрытого крышкой. Отсеки соединялись между собой с помощью квадратного отверстия (7x7 см).
Во второй серии использовалась установка, состоящая из открытого (20x20x25 см) и закрытого (20x20x25 см) отсеков, соединенных квадратным отверстием (7x7 см). Дно открытого отсека было сделано из полупрозрачного пластика для регистрации движения в проходящим светом. Перемещение мыши в открытом пространстве регистрировали цифровой видеокамерой, расположенной на расстоянии 120 см от поверхности светлого отсека.
Мышь помещали в центр открытого отсека мордой к закрытому, и в течение 300 с регистрировали: число переходов между камерами и время, проведенное в темной камере.
Был предложен как модель некоторых аспектов человеческой депрессии, а именно чувства безысходности. Животное, вынужденное плавать в ограниченном пространстве, быстро прекращает активные попытки выбраться и принимает состояние относительной неподвижности. Большинство клинически эффективных антидепрессантов увеличивают время активного сопротивления и, соответственно, уменьшают время неподвижности (Porsolt et al., 1977; 1978). Мышь помещали в пластиковую коробку (18 х 18 х 23 см.), заполненную водой при температуре 25 С на 3/4. После 40 секунд адаптации в течение 3 мин регистрировали время неподвижности (с), в течение которого мышь не пыталась выбраться из сосуда (Базовкина и др., 2005). Мышь считалась неподвижной, когда скорость ее перемещения в воде была меньше 2 см/с (Crowley et al., 2004).
В домашнюю клетку экспериментального самца подсаживали беспородного ювенильного самца (возраст 3-4 недели). Социальные и агрессивные элементы поведения были оценены с точки зрения их количества и продолжительности в течение 10 мин. Социальное взаимодействие включает обнюхивание головы партнера, обнюхивание тела, гениталий и хвоста, груминг и следование. Агрессию оценивали по проценту животных, проявляющих агрессивное поведение (Vishnivetskaya et al., 2007).
Влияние Т4 на каталепсию
Существование гомеостатического механизма, поддерживающего концентрацию ТГ в мозге в физиологических пределах вне зависимости от колебаний их концентрации в крови (Dratman, 1993), вызывает сомнения в адекватности использования кратковременного введения умеренных доз ТГ для изучения их роли в регуляции функции мозга и поведения. Введение же больших доз Т4 и ТЗ увеличивает риск токсикоза. Напротив, хроническое введение умеренных доз Т4 в течение 4-8 недель имеет больше шансов нарушить гомеостаз и вызвать увеличение ТГ в мозге. Поэтому в данной работе было использовано именно хроническое введение Т4 в течение 60 дней. Препарат вводили с питьевой водой в концентрации 2 мг/л. Такой способ введения исключает развитие хронического стресса, неизбежного при внутрибрюшинном воздействии или при использовании катетера для введения гормона внутрь желудка. Более того, он наиболее близок к клиническому способу введения гормона. Введение Т4 через питьевую воду неоднократно использовали в экспериментах по изучению роли ТГ в регуляции поведения и серотониновой системы мозга, и оно показало высокую эффективность (Kulikov et al., 1997; 1999; 2002; Barykina et al., 2002; Tikhonova et al., 2005). Основным возражением против введения гормона через питьевую воду является трудность учета количества выпитой воды. Наши исследования показали, что одна мышь (весом 25 г) в сутки выпивает около 5 мл воды, содержащей Т4. Следовательно, суточная доза Т4, получаемая одним животным, составляет около 400 мкг/кг. Показано, что эта доза достаточна для создания высокого уровня Т4 в крови в течение всего периода введения (Табл.4 и 7) и вызывает изменения в серотониновой системе мозга и поведении мышей (Kulikov, Zubkov, 2007; Зубков и др., 2008; Зубков, Куликов, 2009).
В данных экспериментах были использованы две разные модели хронического введения Т4: первая модель создана для исследования отсроченных эффектов гормона, вторая модель была направлена на изучение эффектов хронического гипертиреоидизма. Отсроченными эффектами мы называем те изменения в поведении или в мозге, которые сохраняются у животного после прекращения воздействия и возвращении уровня Т4 в крови к норме. Отсроченные эффекты Т4 изучались следующим образом: сначала животному в течение 60 дней вводили Т4 через питьевую воду, поддерживая высокий уровень Т4 в крови (Табл. 4 и 5), затем введение гормона прекращали и исследовали различные формы поведения и рецепторы серотонина 1А и 2А подтипа уже после нормализации уровня Т4 в крови (Табл.5). Эта модель была реализована в первой серии экспериментов. Основным возражением против такой модели является то, что хроническое введение Т4 подавляет синтез эндогенных гормонов и, значит, удаление Т4 из воды может вызвать у них состояние переходного гипотиреоидизма. Во второй серии экспериментов была реализована модель хронического гипертиреоидизма, когда высокую концентрацию Т4 в крови поддерживали в течение 60 дней и продолжали поддерживать во время поведенческих тестов вплоть до декапитации (Табл.7). Основным возражением против этой модели является трудность различить хроническое действие гормона от острого.
Животные линии AKR были изучены в обеих экспериментальных сериях. Сравнение изменений в поведении и в серотониновой системе мозга у мышей этой линии в двух сериях экспериментов позволяет выделить отсроченные эффекты и учесть возможное влияние резкого прекращения введения экзогенного гормона.
Горизонтальная двигательная активность мышей AKR в тесте открытого поля в первой экспериментальной серии оказалась примерно в два раза больше, чем во второй. Наиболее вероятной причиной такой разницы в двигательной активности между двумя экспериментальным сериями является различие в площади арен, которые использовались в тестах. Арена в первой серии в пять раз больше по площади, чем во второй, следовательно, животным надо было пройти большее расстояние, чтобы исследовать её. Несмотря на это, закономерности изменения поведения в обеих сериях одинаковы: горизонтальная двигательная активность значительно выше у мышей, хронически получавших Т4, по сравнению с животными контрольной группы.
Поскольку в первой серии вызванное хроническим введением Т4 увеличение двигательной активности в тесте «открытое поле» наблюдается после прекращения воздействия и нормализации уровня гормона в крови, можно сделать важный вывод о том, что наблюдаемое увеличение двигательной активности скорее всего опосредовано изменениями в центральной нервной системе, которые сохраняются долгое время после прекращения введения Т4.
Животное имеет врожденный страх перед открытым и освещенным пространством, поэтому время нахождения в центре арены открытого поля рассматривается как негативный показатель тревожности: чем меньше время пребывания в центре, тем выше тревожность животного (Ramos et al., 1997). Недавно был предложен более объективный показатель тревожности -вероятность нахождения в центре. Имеется хорошее соответствие между временем и вероятностью пребывания в центре (Куликов и др., 2007; Kulikov et al., 2008b). Другой оценкой тревожности является время нахождения в светлом отсеке в тесте «свет-темнота»: чем меньше время животное проводит в открытом отсеке, тем выше его тревожность (Cruz et al., 1994; Ramos et al., 1997). Мы показали, что у животных линии AKR хроническое введение Т4 не влияло на время и вероятность нахождения в центре в тесте «открытое поле» и в светлом отсеке в тесте «свет-темнота» и, следовательно, на их тревожность. В других экспериментах также не выявлено влияния гипо- (Barykina et al., 2002; Tikhonova et al., 2005) и гипертиреоидизма (Tikhonova et al., 2005) на тревожность крыс.
Поведение в тесте социального интереса
В то время как хроническое введение Т4 не влияло на время неподвижности в тесте принудительного плавания у животных AKR, гормон достоверно понижал этот показатель у мышей ASC, то есть оказывал антидепрессантный эффект. Это воздействие Т4 является специфическим, и не связано с влияние гормона на двигательную активность, которая не была изменена у мышей линии ASC. Снижение времени неподвижности у животных линии ASC, характеризующейся выраженными «депрессивными» чертами (Базовкина и др., 2005; Kulikov, Popova, 2008), хорошо согласуется с антидепрессантным эффектом гормона у тиреоидэктомированных крыс (Kulikov et al., 1997; Масалова, Сапронов, 2006).
Важно отметить, что антикаталептический и антидепрессантный эффекты Т4 наблюдались даже на фоне некоторого понижения уровня гормона в крови мышей ASC. Ранее было показано, что высокая предрасположенность к каталепсии (Barykina et al., 2002) и повышенной неподвижности в тесте принудительного плавания (Kulikov et al., 1997) ассоциированы с гипотиреоидизмом. Поэтому маловероятно, что наблюдаемые у мышей ASC антикаталептический и антидепрессантный эффекты Т4 обусловлены снижением уровня гормона. Скорее всего, они обусловлены долговременными изменениями в мозге, вызванными хроническим действием Т4.
В отличие от активирующего эффекта Т4 на уровень мРНК и активность 5-НТ2л рецепторов, наблюдаемого у мышей линии AKR, хроническое введение гормона не влияло на эти показатели у мышей линии ASC. Полученный результат свидетельствует об отсутствии связи между наследственной каталепсией, 5-НТгА рецептором и ТГ у мышей.
Хотя не было выявлено эффекта Т4 на уровень мРНК 5-HTiA рецепторов во фронтальной коре, гиппокампе и среднем мозге у мышей AS С, но было показано значительное снижение их активности (по снижению гипотермического эффекта в ответ на острое введение агониста рецептора - 8-OH-DPAT). Можно предположить, что ТГ осуществляют регуляцию 5-НТіЛ рецепторов на посттрасляционном уровне. Из вышесказанного можно предположить, что хроническое введение Т4 осуществляет антикаталептический и антидепрессантаный эффект через посттрансляционную модификацию 5-HTJA рецепторов. Это предположение согласуется с общепринятыми гипотезами о ключевой роли десенситизации 5-HTiA рецепторов в эффектах антидепрессантов (Blier, de Montigny, 1994; Pineyro, Blier, 1999) и в регуляции каталепсии (Broekkamp et al., 1988; Invemizzi et al., 1988; Wadenberg, 1996; Wadenberg et al., 1994).
Главный ген, регулирующий предрасположенность к каталепсии, локализован во фрагменте 61-70 сМ хромосомы 13 мыши (Kulikov et al., 2008а). Его рецессивный аллель, определяющий высокую предрасположенность к каталепсии, локализован в геноме СВА и ASC. Следующей задачей исследования было выяснение участия главного гена каталепсии в механизме регуляции поведения и серотониноых рецепторов тиреоидными гормонами. Для этого было проведено сравнение эффектов гипертиреоидизма на поведение и серотониновые рецепторы у мышей AKR и конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76. Мыши данной конгенной линии отличались от родительской линии AKR наличием СВА-фрагмента хромосомы 13 и высокой предрасположенностью к каталепсии (Kulikov et al., 2008а). Было установлено, что наличие данного фрагмента хромосомы подавляет активирующий эффект хронического введения Т4 на двигательную активность в открытом поле и на 5-НТ2л рецепторы. На мышах AKR.CBA-D13Mit76 не было показано эффекта Т4 на выраженность тревожности в тестах «открытое поле» и «свет-темнота», уровень агрессии на ювенильного самца и на уровень мРНК 5-НТіЛ рецептора. Логично предположить, что эта резистентность к Т4 обусловлена находящимися в этом участке генами. Кроме 5-НТіА рецептора, который не является главным геном каталепсии (Kulikov et al., 2008а), в этом фрагменте находится еще 34 гена (Ensemble, http://www.ensembl.org/Mus musculus). Одним из генов-кандидатов каталепсии и гена резистентности к ТГ, является ген, кодирующий белок gpl30. Этот белок является субъединицей рецепторов цитокинов: интерлекина-6, онкостатина-М, LIF и CNTF, участвующих в механизмах клеточной дифференцировки, иммунитета и эндокринной регуляции (Chesnokova, Melmed, 2002). Полученный результат позволят предполагать участие цитокиновой системы в молекулярном механизме хронического эффекта Т4 на серотониновые рецепторы и поведение мышей.
Таким образом, в работе показана ключевая роль генотипа в регуляции чувствительности к Т4. Мыши линии AKR являются наиболее чувствительны к хроническому действию Т4: гормон вызывает у них увеличение двигательной активности, агрессии, появление каталепсии и активацию 5-НТ2л рецепторов в коре головного мозга. Каталепсия и повышенная агрессия на ювенильного самца являются признаками нарушения поведения, напоминающие таковые у интактных животных линии AKR.CBA-D13Mit76. Поэтому животные линии AKR являются удобной моделью для изучения вызванных гипертиреоидизмом нарушений поведения.
Мыши линии ASC в отличие от животных AKR характеризуются врожденными нарушениями поведения и нервной системы: они чрезвычайно предрасположены к каталепсии и характеризуются выраженными депрессивно-подобными чертами. Мы показали, что хроническое введение Т4 оказывает нормализующее действие на животных ASC: снижает выраженность каталепсии и время неподвижности в тесте принудительного плавания. Эту линию можно рекомендовать как модель для изучения механизмов антидепрессантного действия Т4. Действительно, линия ASC была ранее предложена для изучения механизмов депрессии и действия антидепрессантов (Kulikov, Popova, 2008).
В клинической практике показано, что высокие дозы Т4 могут улучшить состояние некоторых депрессивных больных, но на некоторых ТГ не оказывают эффекта (Bauer et al., 2003). Результаты данного исследования могут частично объяснить и предположить существование биологических предикторов вариации в чувствительности к ТГ, которая наблюдается в клинике. Хроническое введение Т4 оказывает антикаталептический и антидепрессантный эффект на каталептические линии крыс ГК и мышей ASC. Напротив, у линий устойчивых к каталепсии: крыс Wistar и мышей AKR гормон не эффективен или вызывает каталептогенный эффект. Таким образом, генетическая предрасположенность к каталепсии является биологическим предиктором антикаталептического и антидепрессантного эффектов ТГ у мышей и крыс. Результаты данного исследования проводят связь между экспериментальными и клиническими наблюдениями: можно предположить, что Т4 будет улучшать состояние депрессивных больных, но вызовет противоположный эффект у относительно здоровых пациентов. Тиреоидные гормоны широко используются для коррекции дисфункций щитовидной железы. Результаты данной работы предостерегают о возможных нарушениях поведения и функции нервной системы у особо чувствительных к ТГ пациентов.
