Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Взаимодействие 5-НТ системы мозга, ГГНС и иммунной системы в регуляции поведения 10
1.1. Анатомия и биохимия 5-НТ системы мозга 10
1.2. Взаимодействие между 5-НТ системой мозга и ГГНС 14
1.3. Взаимодействие между 5-НТсистемой мозга и иммунной системой 17
1.4. Участие 5-НТ системы мозга в регуляции полового поведения и каталепсии 24
1.5. Наследственная каталепсия у мышей, как модель взаимодействия 5-НТ системы мозга, ГГНС и иммунной системы 29
Глава 2. Материалы и методы 32
2.1. Животные и воздействия 32
2.2. Тест «перегородка» 33
2.3. Тест на каталепсию 34
2.4. Определение уровня кортикостерона 34
2.5. Выделение РНК и ОТ-ПЦР 35
2.6. Определение уровней 5-НТ и 5ТИУК в мозге 36
2.7. Статистическая обработка 36
Глава 3. Результаты 37
3.1. Влияние острого эмоционального стресса на половое мотивационное поведение,
выраженность каталепсии, уровень кортикостерона, экспрессию гена c-Fos, и метаболизм
5-НТ в мозге у мышей, различающихся по предрасположенности к наследственной
каталепсии 37
3.1.1. Сравнение действия острого эмоционального стресса на выраженность полового мотивационного поведения у самцов мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKRHCBA 37
3.1.2. Сравнение действия острого эмоционального стресса на выраженность каталепсии у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и СВА 39
3.1.3. Сравнение действия острого эмоционального стресса на уровень кортикостерона в плазме крови у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и СВА 40
3.1.4. Сравнение действия острого эмоционального стресса на уровень экспрессии гена c-Fos в мозге у мышей конгенной линии D13 и родительской линии AKR 42
3.1.5. Сравнение действия острого эмоционального стресса на метаболизм 5-НТ в мозге у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и СВА
3.2. Эффекты ЛПС на выраженность каталепсии и метаболизм 5-НТ в мозге у мышей, различающихся по предрасположенности к наследственной каталепсии 46
3.2.1. Сравнение эффектов ЛПС на выраженность каталепсии у мышей конгенной линии D13 и родительских линий AKR и СВА 46
3.2.2. Сравнение эффектов ЛПС на метаболизм 5-НТ в мозге у мышей конгенной линии
D13 и родительских линий AKR и СВА 47
Глава 4. Обсуждение результатов 51
Выводы 57
Список цитируемой литературы
- Взаимодействие между 5-НТ системой мозга и ГГНС
- Наследственная каталепсия у мышей, как модель взаимодействия 5-НТ системы мозга, ГГНС и иммунной системы
- Выделение РНК и ОТ-ПЦР
- Сравнение действия острого эмоционального стресса на уровень экспрессии гена c-Fos в мозге у мышей конгенной линии D13 и родительской линии AKR
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время исследование взаимодействия между серотонином мозга (5-гидрокситриптамин, 5-HT), гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системой (ГГНС) и иммунной системой в механизме психопатологии является важной проблемой в психонейроиммунологии. Существует большое количество доказательств взаимодействия между этими системами (Weigent, Blalock, 1995; Dunn et al., 2005; Uhlig, Kallus, 2005; Ziemssen, Kern, 2007). Психические расстройства часто сопровождаются нарушениями в иммунной системе (Perry, 2004; Zunszain et al., 2011; Onore et al., 2012), в то время как стрессы, воспаление и активация иммунной системы увеличивают риск развития психопатологии (Porter et al., 2004; Irwin, Miller, 2007; Anisman et al., 2008; Miller, 2010; Kelley, Dantzer, 2011; Leonard, Maes, 2012).
Для активации неспецифического иммунитета наиболее часто применяют введение бактериального эндотоксина (липополисахарид, ЛПС) (Kent et al., 1992; Dunn, 1992; Anisman et al., 2008). Введение ЛПС приводит к увеличению концентраций IL-1b, IL-6 и TNF-a. Именно IL-1b, IL-6 и TNF-a вызывают болезненное состояние (sickness) и депрессивноподобное поведение: гипертермию, гипокинезию, гипофагию, гипералгезию, сниженный интерес к исследованию окружающей среды, снижение либидо, увеличение времени сна, снижение мотивации и когнитивных функций (Kent et al., 1992; Dantzer et al., 2001; Larson, Dunn, 2001). ЛПС также активирует 5-HT систему мозга (Dunn, Wang, 1995; Dunn, 2006), которая вовлечена в регуляцию многих форм поведения (Lucki, 1998; Popova, 2006).
Эмоциональный стресс является естественной и адаптивной реакцией млекопитающих на различные угрожающие стимулы внешней среды, например, на появление хищника. При опасности происходит изменение в поведении, активация ГГНС, секреция глюкокортикоидов, увеличение экспрессии генов раннего реагирования в нейронах мозга, изменение метаболизма моноаминов в мозге (Pacak, Palkovits, 2001). Важную роль в реакции на эмоциональный стресс играет 5-HT система мозга (Науменко, 1971; Chaouloff et al., 1999). Полагают, что именно стресс являться пусковым механизмом развития психопатологии у чувствительных к стрессу особей (Anisman et al., 2008).
Другой важной и актуальной проблемой современной физиологии является изучение взаимодействия генотипа с факторами окружающей среды в развитии тяжелых психических расстройств (De Maio et al., 2005; Caspi, Moffitt, 2006). Наиболее важными факторами являются эмоциональный стресс и активация иммунной системы, вызванная инфекций. Имеющиеся данные о влиянии эмоционального стресса и активации иммунной системы на метаболизм 5-HT в мозге были получены преимущественно на крысах (Tanaka et al., 1983; Kirby et al., 1997; Dunn, 2006; Mo et al., 2008). Однако эти авторы не исследовали вклад генетических факторов в реакции 5-HT системы мозга на стресс и введение ЛПС.
Каталепсия (животный гипноз, мнимая смерть, тоническая неподвижность) – это состояние, при котором животное или человек не может совершать произвольные движения (впадают в ступор) и сохраняют приданную им неудобную позу в течение длительного времени (Dixon, 1998). В гипертрофированной форме каталепсия и кататония являются синдромами тяжелых нарушений нервной системы (Sanberg et al., 1988; Caroff et al., 2000; Lee, 2007, 2010; Weder et al., 2008; Daniels, 2009; Paparrigopoulos et al., 2009).
У мышей была выявлена так называемая «щипковая» каталепсия (pinch-induced catalepsy), которая вызывается щипками кожи животного в области загривка (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981). Были выявлены существенные межлинейные различия в предрасположенности к каталепсии (Куликов и др., 1989; Kulikov et al., 1993). Из 10 исследованных линий мышей высокая выраженность к каталепсии была обнаружена только у мышей линии CBA (54% каталептиков). Недавно была определена локализация главного гена предрасположенности к каталепсии в дистальном фрагменте хромосомы 13 (59-70 cM) мыши (Куликов и др., 2003; Kondaurova et al., 2006; Kulikov et al., 2008). В результате переноса данного фрагмента хромосомы 13 от каталептической линии CBA в геном некаталептической линии AKR была получена конгенная линия AKR.CBA-D13Mit76 (D13) (около 50% каталептиков).
Показано участие 5-HT системы мозга в регуляции наследственной каталепсии у мышей. Так, у мышей инбредной линии СВА, характеризующихся высокой генетической предрасположенностью к щипковой каталепсии, повышена активность ключевого фермента биосинтеза 5-НТ триптофангидроксилазы-2 (ТПГ-2) и снижена плотность 5-НТ2А серотониновых рецепторов в стриатуме (Kulikov et al., 1995; Popova, Kulikov, 1995). Введение ингибиторов ТПГ-2 снижало выраженность каталепсии у мышей (Popova, Kulikov, 1995).
Иммунная система также вовлечена в механизм наследственной каталепсии. У линии мышей ASC, полученной в результате селекции на высокую предрасположенность к каталепсии, обнаружена низкая способность животных отвечать на Т - зависимый антиген – эритроциты барана (Альперина и др., 2007). А недавно нашими коллегами было обнаружено, что введение ЛПС вызывает реакцию замирания у линий мышей DBA/2 и C57BL/6, которые являются устойчивыми к щипковой каталепсии (Базовкина, Куликов, 2009).
Следовательно, наследственная каталепсия является удобной моделью для изучения взаимодействия 5-HT, эндокринной и иммунной систем, а также роли генотипа и различных видов стресса в развитии нарушений нервной системы и поведения. Поэтому выяснение закономерностей влияния эмоционального стресса и активации иммунной системы на выраженность поведения и 5-НТ систему мозга мышей с наследственными различиями в предрасположенности к каталепсии, несомненно, является актуальным.
Целью данной работы являлось исследование ассоциации наследственной каталепсии с выраженностью поведения и метаболизма 5-HT мозга при воздействии острого эмоционального стресса и активации иммунной системы бактериальным липополисахаридом (ЛПС). В связи с этим были поставлены следующие задачи:
-
Изучить влияние острого эмоционального стресса на выраженность половой мотивации у самцов мышей некаталептической линии AKR и каталептических линий CBA и D13;
-
Изучить влияние острого эмоционального стресса на выраженность каталепсии у мышей некаталептической линии AKR и каталептических линий CBA и D13;
-
Сравнить влияние острого стресса на уровень кортикостерона в плазме крови у мышей линий AKR, CBA и D13;
-
Сравнить влияние острого стресса на экспрессию гена c-Fos в мозге у мышей линий AKR и D13;
-
Оценить влияние острого стресса на метаболизм 5-HT в мозге у мышей линий AKR, CBA и D13;
-
Изучить влияние ЛПС на выраженность каталепсии у мышей линий AKR, CBA и D13;
-
Оценить влияние ЛПС на метаболизм 5-HT в мозге у мышей линий AKR, CBA и D13.
Научная новизна. В настоящей работе впервые были получены доказательства ассоциации наследственной предрасположенности к каталепсии с вызванными эмоциональным стрессом и введением ЛПС изменениями в поведении и метаболизме 5-HT в мозге:
Острый эмоциональный стресс (рестрикция) вызывал более выраженный каталептогенный эффект у мышей каталептических линий CBA и D13 по сравнению с некаталептической линией AKR.
5-HT система среднего мозга у мышей каталептических линий более чувствительна к эмоциональному стрессу по сравнению с животными устойчивой к каталепсии линии.
Введение ЛПС вызывало более выраженный каталептогенный эффект у мышей каталептических линий CBA и D13 по сравнению с некаталептической линией AKR.
5-HT система среднего мозга и стриатума у мышей каталептических линий более чувствительна к ЛПС по сравнению с животными устойчивой к каталепсии линии.
Научно-практическая ценность. Основным вкладом данного исследования в изучении взаимодействия нервной, иммунной и эндокринной систем в механизме психопатологии является экспериментальное доказательство тесного взаимодействия 5-HT системы (нервная система), ЛПС (иммунная система) и эмоционального стресса (ГГНС) в механизме такого наследственного нарушения поведения как каталепсия. Была показана научно-практическая ценность наследственной каталепсии у мышей уникальной конгенной линии AKR.CBA-D13Mit76 (D13) как модели для изучения генетической предрасположенности к психопатологиям, ассоциированным со стрессом и нарушениями в иммунной системе. Полученные результаты используются в курсе лекций «Молекулярные механизмы поведения» для студентов 4 курса факультета естественных наук НГУ.
Положения, выносимые на защиту
-
Острый эмоциональный стресс усиливает выраженность наследственной каталепсии.
-
Усиление каталепсии, вызванное стрессом, сопровождается увеличением обмена 5-HT в среднем мозге у предрасположенных к каталепсии мышей.
-
ЛПС оказывает выраженный каталептогенный эффект. Интенсивность вызванной ЛПС каталепсии более выражена у мышей с наследственной предрасположенностью к каталепсии.
-
ЛПС усиливает метаболизм 5-HT в среднем мозге и стриатуме у предрасположенных к каталепсии мышей, но не у устойчивых к каталепсии животных.
-
Выявлена ассоциация между реакциями наследственной каталепсией на эмоциональный стресс и на введение ЛПС. Показана важная роль 5-HT системы мозга в механизме этой ассоциации.
Апробация работы. Полученные результаты были представлены и обсуждены на XLVIII и XLIX Международных научных студенческих конференциях «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2010, 2011), VII Сибирском съезде физиологов (Красноярск, 2012), VIII International interdisciplinary congress «Neuroscience for Medicine and Psychology» (Sudak, 2012), International Summer School «Neurogenetics. Unraveling behaviorand brain mechanisms using modern technologies» (Zvenigorod, 2012).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 4 статьи в рецензируемых отечественных (2) и международных (2) журналах.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список цитируемой литературы (307 источников). Работа изложена на 82 страницах, содержит 11 оригинальных рисунков и 3 таблицы.
Взаимодействие между 5-НТ системой мозга и ГГНС
Термин «стресс» первоначально определялся Гансом Селье как «неспецифическая реакция организма на требование», также этот термин может быть описан, как реакция на изменение окружающей среды, внутреннее или внешнее, приводящее к нарушению гомеостаза (Leonard, 2005). Целью стрессовой реакции является поддержание гомеостаза (Sapolsky, 2003), которая включает в себя ряд физиологических реакций, одной из которых является активация гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС).
При воздействии стрессора происходит возбуждение соответствующих экстерорецепторов (зрительных, слуховых, болевых и т.д.) или интерорецепторов. Поток нервных импульсов устремляется в головной мозг, а именно в гипоталамус, где под влиянием этих импульсов паравентрикулярное ядро гипоталамуса вырабатывает кортикотропин-рилизинг-гормон (КРГ), который через воротную систему сосудов поступает в переднюю долю гипофиза и стимулирует здесь секрецию адренокортикотропного гормона (АКТГ). Последний выделяется в кровь, достигает коры надпочечников и стимулирует образование в ее клетках глюкокортикоидов (кортизол - у человека и кортикостерон - у грызунов). Глюкокортикоиды способны оказывать влияние на метаболизм, сердечно-сосудистую систему, иммунный ответ, а также на поведение и когнитивные функции, в первую очередь путем изменения экспрессии множества генов. Более того, глюкокортикоиды угнетают секреторную активность гипофиза и гипоталамуса, действуя по принципу отрицательной обратной связи и замыкая, таким образом, цепь регуляции, относящуюся к секреции КРГ и АКТГ. Эффекты глюкокортикоидов осуществляются двумя типами рецепторов - минералокортикоидными (MP) или I тип и глюкокортикоидными (ГР) или II тип. Эти рецепторы различаются сродством связывания к глюкокортикоидам и опосредуют различные, но взаимодополняющие эффекты (Chrousos, Gold, 1992; Pacak, Palkovits, 2001; Tsigos, Chrousos, 2002, Chrousos, 2009).
Общеизвестно, что между ГГНС и 5-НТ мозга существуют реципрокные взаимодействия (Lanfumey et al, 2008). ГГНС и 5-НТ система мозга имеют тесную перекрестную регуляцию при нормальных физиологических условиях у млекопитающих (Chaouloff, 1993;. Lopez et al., 1998). Более того, взаимодействие этих систем имеет особое значение при рассмотрении патологических состояний, таких как депрессия, при которой происходят нарушения в функционировании как 5-НТ системы мозга, так и ГГНС (Lesch et al., 1990; Barden, 1999; Porter et al, 2004).
5-НТ система мозга участвует в реакции на стресс. Существует большое количество данных о наличии 5-НТ окончаний и/или 5-НТ-рецепторов в структурах мозга связанных с реакцией на стресс (например, в миндалине, гипоталамусе, стриатуме, гиппокампе, коре и т.д.) (Chaouloff, 1993; Graeff, 1993). Тела 5-НТ нейронов, локализованные в ядрах шва среднего мозга получают афферентацию от многих структур мозга (Jacobs, Azmitia, 1992), в том числе упомянутых выше, таким образом, позволяя 5-НТ нейронам получать постоянную информацию во время стресса. В частности в этих ядрах наблюдается увеличение экспрессии гена раннего реагирования c-Fos после воздействия различных стрессоров (например, принудительное плавание или рестрикция) (Cullman et al.1995; Chaouloff et al., 1999).
5-НТ рецепторы мозга связаны с функционированием ГГНС. Было показано, что введение 5-НТ в желудочки мозга влечет за собой стимуляцию ГГНС и повышение уровня кортикостероидов в периферической крови морских свинок и белых крыс (Науменко, 1966, 1971; Науменко, Ильюченок, 1967, Науменко, Попова, 1975).
Несомненный интерес вызывает то, что 5-НТ рецепторы, связанные с регуляцией ГГНС, расположены в гипоталамусе, так как именно ему принадлежит роль основного эндокринного регулятора. Так, активация ГГНС была отмечена через час после введения 5-НТ в различные образования переднего, среднего и заднего гипоталамуса морских свинок (Науменко, 1971). Выводы о роли центральных 5-НТ рецепторов на ГГНС были подтверждены в опытах с изолированным гипоталамусом (Науменко и др., 1972; Попова и др., 1972; Popovaetal., 1972).
Кроме того, в трех основных лимбических образованиях - перегородке, миндалевидном комплексе и гиппокампе - были обнаружены реагирующие на 5-НТ структуры, влияющие на функциональную активность ГГНС (Naumenko, 1969).
Введение агониста 5-НТід рецепторов, ипсапирона, приводило к увеличению уровней АКТГ и кортизола в плазме крови у животных и людей (Wetzler et al., 1996; Klaassen et al., 2002). Нейроанатомические исследования показали, что 5-НТ действует через синаптические контакты между 5-НТ терминалиями и КРГ-содержащими клетками паравентрикулярного ядра гипоталамуса (Liposits et al, 1987). В иммуногистохимических исследованиях было обнаружено, что микроинъекции агониста 5-НТід рецепторов 8-ОН-DPAT в паравентрикулярное ядро гипоталамуса вызывали секреции АКТГ (Zhang et al., 2004b; Osei-Owusu et al., 2005). Агонисты 5-HTiA и 5-HT2c рецепторов увеличивали секрецию АКТГ и кортикостерона/кортизол в плазме крови у животных и человека (Wetzler et al., 1996; Van de Kar, 1998; Klaassen et al., 2002). Оба типа 5-HTIA и 5-HT2c рецепторов обнаружены в миндалевидном комплексе и паравентрикулярном ядре гипоталамуса, но 5-НТ2С рецептор, вероятно, является наиболее важным посредником стимулирующего влияния 5-НТ на секрецию глюкокортикоидов во время эмоционального стресса. Действительно, антагонисты 5-НТгс рецепторов сильнее подавляли стресс-индуцированную секрецию АКТГ по сравнению с селективным антагонистом 5-НТід рецепторов, WAY-100635 (Groenink et al., 1996; Jorgenscn et al., 1998). Введение агонистов 5-НТгАдс рецепторов крысам приводило к увеличению секреции всех гормонов стресса, в том числе АКТГ, кортикостерона, окситоцина, пролактина и ренина (Levy et al., 1994; Rittenhouse et al., 1994; Bagdy, 1996; Van de Kar et al., 2001). Эффекты DOI - одного из агонистов этих рецепторов - блокируются предварительным введением антагониста 5-НТ2А рецепторов, MDL 100,907. Это указывает на то, что 5-НТгА рецепторы являются доминирующими рецепторами, опосредующими нейроэндокринные реакции (Van de Kar et al., 2001). Инъекция антагониста 5-НТг рецепторов, кетансерина, в миндалину ингибирует действие светового стресса на секрецию АКТГ (Feldman et al., 1998).
5-НТ мозга регулирует экспрессию ГР и высвобождение гормонов стресса, а также вносит свой вклад в программирование пластичности ответа ГГНС на стресс в ранний период жизни (Laplante et al., 2002; Andrews, Matthews, 2004; Boisvert et al., 2011). Была показана ассоциация между функциональным полиморфизмом 5-HTTLPR в промоторе гена транспортера 5-НТ, реактивностью ГГНС и депрессией (Gotlib et al., 2008). Прием селективных ингибиторов обратного захвата 5-НТ приводил к увеличению секреции АКТГ и кортизола у здоровых добровольцев и пациентов с депрессией (Porter et al., 2004).
Данные о влиянии стресса на уровень и метаболизм 5-НТ в мозге были получены преимущественно на крысах. С помощью микродиализа в многочисленных исследованиях были обнаружены изменения секреции 5-НТ в различных областях мозга (гипоталамус, миндалина, лобная кора, ядра шва среднего мозга и т.д.) в ответ на различные стрессоры (электрический ток, холод, иммобилизация, принудительное плавание и т.д.) (Shimizu et al., 1992; Clement et al., 1993; Kawahara et al., 1993; Inoue et al, 1994; Dinan, 1996; Adell et al, 1997; Amat et al., 1998; Maswood et al, 1998; Hashimoto et al, 1999; Funada, Hara, 2001; Fujino et al, 2002; Lowry, 2002). Следует отметить, что разные виды стресса оказывают разное влияние на уровни 5-НТ и 5-ГИУК в мозге и, кроме того разные структуры мозга по-разному реагируют на стресс (Lee et al, 1987; Petty et al, 1997). В тесте подвешивания за хвост было обнаружено увеличение обмена 5-НТ только во фронтальной коре и
Наследственная каталепсия у мышей, как модель взаимодействия 5-НТ системы мозга, ГГНС и иммунной системы
Выделение общей РНК проводили экстракцией смесью гуанидина тиоционата, фенола и хлороформа и растворяли в 44 мкл обработанной диэтилпирокарбонатом воды. Примеси геномной ДНК удаляли обработкой ДНКазой (5 мкл 10х буфера, Promega, USA и 1 мкл ДНКазы, Promega, USA, 15 мин 37С, затем 10 мин 60СС). РНК, свободную от ДНК, экстрагировали смесью гуанидина тиоционата, фенола и хлороформа и растворяли в 40 мкл обработанной диэтилпирокарбонатом воды, определяли оптическую плотность, разводили обработанной диэтилпирокарбонатом водой до концентрации 0,125 мкг/мкп и хранили при -70С. Наличие примеси геномной ДНК в общей РНК определяли с помощью ПЦР с праймерами для р-актина. F 5 - CGGAACCGCTCATTGCC, R 5 -ACCCACACTGTGCCCATCTA, температура отжига- 61С и размер ампликона 285 п.н..
Концентрацию мРНК генов определяли методом количественного ПЦР (Kulikov et al., 2005; Науменко, Куликов, 2006). В качестве внешнего стандарта брали известные концентрации геномной ДНК мыши (линия C57BL/6J). В нашей работе мы использовали стандарты с концентрациями 64 нг/мкл (12800 копий/мкл) и 128 нг/мкл (25600 копий/мкл). Отрицательным контролем служила ПЦР смесь без добавления аликвоты кДНК. В качестве внутреннего стандарта использовали концентрацию кДНК РНК-полимеразы 2 в пробе. Конечный состав ПЦР-смеси содержал 10х буфер, 0,2мМ dNTP, 0,5мМ смесь прямого и обратного праймеров, 1,5мМ Mg2+, 0,25 ед. Taq полимеразы и стерильной воды до 20 мкл. К реакционной смеси добавляли 1 мкл кДНК или стандарта ДНК. Протокол ПЦР, был следующим: 94С - 2 мин.; (94С - 15 с, ТотжигаС - 30 с, 72С -15 с) 25-30 циклов; 72С - 2 мин. Оптимальное число циклов ПЦР подбирали, строя кривую зависимости количества амплифицированных фрагментов от количества циклов (25-30 циклы), выбирая в качестве оптимального цикл из середины линейного участка кривой. Аналогичным образом подбирали оптимальную концентрацию ДНК-стандартов на выбранном цикле. Уровень мРНК гена c-Fos выражали числом копий на 100 копий мРНК РНК-полимеразы 2. Нуклеотидная последовательности праймеров для c-Fos F 5і-ААА GAG AAG GAA AAA CTG GAG, R 5 - CGG AAA CAA GAA GTC АТС AA, температура отжига - 58C и размер ампликона 264 п.н., а последовательности праймеров для мРНК полимеразы 2 F 5 - GTT GTC GGG CAG ААТ GTA G, R 5 - ТСА ATG AGA ССТ ТСТ CGT ССТ СС, температура отжига - 63С и размер ампликона 188 п.н. Продукты ПЦР исследуемых образцов, стандартов и отрицательного контроля были разделены при помощи электрофореза в 2% агарозном геле. В качестве электрофоретического буфера использовали 0,5-кратный трис-боратный буфер (ТВЕ: 89 mM Tris, 89 тМ Н3ВО3, 2 тМ EDTA, рН=8). Визуализацию ампликонов осуществляли путем окрашивания геля бромистым этидием (конечная концентрация бромистого этидия в используемом для окрашивания растворе трис-боратного буфера составила 0,5 мкг/мл). Визуализированные в ультрафиолетовом свете ПЦР-продукты сканировали с помощью цифровой камеры. Интенсивность флуоресценции полос образцов и стандартов была проанализированы с помощью программы Scion Image.
Содержание 5-НТ и 5-ГИУК в мозге определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (Kulikov et al., 2012а). Образцы ткани взвешивали и гомогенизировали в буфере, содержащем 0,4 М НСЮ4, 0,27 мМ EDTA, после чего гомогенат центрифугировали 5 минут на 15000 оборотов/мин при температуре 4С, и супернатант в объеме 40 мкл наносили на колонку Nucleosil СІ 8 (5 urn, 150ммх2мм Penomenex, USA), используя электрохимический детектор (500 мВ, Coulochem III; ESA, Inc., USA) с электрохимической ячейкой (BASInc, USA), с использованием насоса LC-20AD (Shimadzu Corporation, Japan). Мобильная фаза содержала КН2Р04, 100 мМ, 0,1 мМ Na2EDTA, 1,4 мМ 1 -октансульфоновой кислоты (Sigma, USA) и метанол (8% от объёма), рН=4,35. Скорость мобильной фазы составила 0,5 мл/мин.
Раствор внешнего стандарта содержал в 20 мкл 2 нг 5-НТ, 5-ГИУК. Высота пиков была оценена при помощи программы MultiChrom v. 1.5 (Ampersand Ltd., Россия) и калибрована на соответствующий внешний стандарт. 5-НТ и 5-ГИУК были представлены в мг/г образца ткани. Интенсивность метаболизма 5-НТ оценивали по соотношению 5-ГИУК/5-НТ.
Все полученные результаты представлены как М±ш. Для анализа данных по параметрам половой мотивации использовали двухфакторный дисперсионный анализ для повторных измерений (Repeated measures ANOVA). Различия между отдельными группами оценивали с помощью с применением теста Ньюмапа-Кеулса. Для всех остальных данных использовали двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим о -йос-сравнением по Фишеру. Число животных-каталептиков сравнивали с помощью критерия х2. Различия считали достоверными при р 0,05. Глава 3. Результаты
Данные представлены в виде М±т. р 0,05; р 0,001 по сравнению с пустым отсеком стресс; ++ р 0,01 по сравнению с пустым отсеком контроль; @@@ р 0,001 по сравнению с AKR контроль при предъявлении рецептивной самки. Острый эмоциональный стресс не влиял на число подходов к перегородке в отсутствии рецептивной самки у мышей исследуемых линий. У нестрессированных самцов мышей линий СВА и D13 присутствие рецептивной самки за перегородкой достоверно увеличивало число подходов к перегородке (р 0,01). Однако, у нестрессированных самцов AKR присутствие рецептивной самки не вызывало увеличение числа подходов к перегородке (р 0,05). Родительские линии нестрессированных мышей были контрастны по числу подходов к перегородке при предъявлении рецептивной самки: у мышей каталептической линии СВА их было достоверно больше (р 0,001) по сравнению с некаталептичекой линией AKR. Конгенная линия D13 достоверно не отличалась от родительских линий по этому показателю. В то же время, у стрессированных животных всех исследованных линий наличие рецептивной самки за перегородкой достоверно увеличивало число подходов к перегородке.
Было обнаружено достоверное влияние факторов «линия» (F2,5o=2,60, р 0,001), «стресс» (Fi,5o=6,88, р 0,01), «активация» (Fi_so=162,65, р 0,001) и взаимодействия (активация х линия) (F2,50=5,98, р 0,01) на время, проведенное самцом у перегородки (Рис.6).
Время пребывания самца у перегородки является основным показателем полового мотивационного поведения (Амстиславская, Храпова, 2002). Рестрикция достоверно снижала время пребывания самца у перегородки при предъявлении рецептивной самки только у каталептичекой линии СВА (р 0,05), но не у AKR и D13. Не было обнаружено достоверных различий между линиями нестрессированных и стрессированных мышей по времени у перегородки при пустом отсеке. Родительские линии нестрессированных мышей были контрастны по времени подходов к перегородке при предъявлении рецептивной самки: у линии СВА время подходов при предъявлении рецептивной самки было достоверно выше (р 0,001), чем у линии AKR. У конгенной линии D13 этот показатель был промежуточный и достоверно отличался как от родительской линии СВА (р 0,05), так и от родительской линии AKR (р=0,053). Примечательно, что у нестрессированных мышей линии AKR не происходило увеличение времени пребывания самца у перегородки по сравнению с пустым отсеком в отличие от СВА и D13. Таким образом, были выявлены достоверные различия между нестрессированными мышами линий AKR и D13 по основному показателю выраженности половой мотивации, что подтверждает полученные нами ранее результаты (Тихонова и др., 2010).
Выделение РНК и ОТ-ПЦР
Половое поведение относится к числу биологически высоко значимых витальных форм поведения. Имеются данные об угнетающем влиянии острого и хронического стресса на половое поведение самцов (Retana-Marquez et al., 2003). Не вызывает сомнения, что именно половая мотивация инициирует половое поведение и является необходимой для успешной реализации всех его последующих этапов. В данном исследовании мы использовали два индекса половой мотивации: число подходов и время у перегородки. Первый индекс может зависеть от двигательной активности, которая различается у исследованных линий мышей (Кондаурова и др., 2010). Второй индекс - время у перегородки - кажется более информативным. Ранее нами были выявлены достоверные различия между интактными мышами родительской некаталептической линией AKR и каталептической конгенной D13 по времени у перегородки (Тихонова и др., 2010), а в настоящем исследовании мы наблюдали лишь тенденцию. Таким образом, перенос фрагмента 59-70 сМ хромосомы 13, ассоциированного с наследственной каталепсией, способствует улучшению проявления половой мотивации, которое снижено у родительской линии AKR. Было обнаружено угнетение половой мотивации у стрессированных мышей линии СВА, что согласуются с результатами, полученными ранее в нашей лаборатории (Амстиславская, 2004; Амстиславская, Попова, 2009). Однако рестрикция, по-видимому, не повлияла на выраженность половой мотивации у самцов с преобладанием генотипа AKR (AKR и D13). В настоящее время наряду с данными об угнетающем влиянии стресса на половую систему самцов все больше накапливается сведений о зависимости этих изменений от генотипа (Chaouloff et al., 1999). В нашем исследовании мы подтвердили участие генотипа в механизме угнетающего влияния эмоционального стресса на половую мотивацию. В то же время, мы не обнаружили участия фрагмента хромосомы 13 мыши в механизмах снижения половой мотивации на острый эмоциональный стресс.
В чрезмерно выраженной форме, каталепсия ассоциирована с тяжелыми неврологическими и психическими расстройствами. Механизм каталепсии и влияние стресса на ее развитие остаются неясными. Существует только несколько работ по влиянию стрессовых стимулов на проявление фармакологической каталепсии, однако они достаточно противоречивы (Bhattacharya, Ghosh, 1982; Antelman et al., 1991, 1992). У мышей каталепсию можно вызвать с помощью щипков кожи загривка (щипковая каталепсия) (Amir et al., 1981; Ornstein, Amir, 1981). Эта модель является весьма интересной, так как сам щипок представляет собой легкий эмоциональный стресс (Куликов и др., 1989), Если предположить, что генотип одних животных чувствителен к щипку, а у других нет, то можно считать, что животные с чувствительным генотипом к щипку более чувствительны к стрессу. Для проверки этой гипотезы, мы ввели другой эмоциональный стресс - рестрикцию - предшествующий щипковому стрессу. Мы обнаружили, что рестрикция увеличивала время замирания у всех трех исследуемых линий и значительно увеличивала процент каталептиков (до 100%) у каталептических линий СВА и D13. У некаталептической линией AKR (38%) увеличение процента каталептиков было недостоверным. Следовательно, каталептические линии, более чувствительны к стрессу. Таким образом, полученный результат подтверждает гипотезу о том, что наследственная каталепсия возникает в результате сочетания генетически детерминированной высокой чувствительности к стрессу и стрессора. Следовательно, наследственная каталепсия у мышей может быть адекватной моделью по изучению генетической предрасположенности к психопатологиям, ассоциированным со стрессом.
В механизме каталептического замирания участвуют многие медиаторы и гормоны (Барыкина и др., 2001; Куликов и др., 2004; De Ryck, Teitelbaum, 1984; Hartgraves, Kelly, 1984; Reavill et al., 1999; Caroff et al. 2000; Barykina et al., 2002; Zarrindast et al., 2002; Echeverry et al., 2007; Koek et al, 2007; Koek, France, 2008; Papamgopoulos et al., 2009). В настоящее время существует только одна работа по влиянию цитокинов на проявление фармакологической каталепсии. Было обнаружено, что IL-ip и TNF-a модулируют Д9-тетраканнабиол - индуцированную каталепсию у мышей (Gibertini et al., 1995). В данном исследовании мы показали участие иммунной системы в механизме наследственной каталепсии. Стимуляция неспецифической иммунной системы ЛПС в дозе 200 мкг/кг предрасполагает к щипковой каталепсии мышей некаталептической линии AKR. Одновременно с нами, нашими коллегами было показано, что ЛПС (100 или 200 мкг/кг) вызывает каталепсию у мышей других некаталептических линий C57BL/6 и DBA/2 (Базовкина и Куликов, 2009; Bazovkina et al., 2011). Важным новым результатом данного исследования было то, что ЛПС оказывает более выраженный каталептогенный эффект на мышей каталептических линий СВА и D13, чем на некаталептическую линию AKR. ЛПС доза 50 мкг/кг не способна вызвать каталепсию у AKR, но значительно увеличивает время замирания и процент каталептиков у мышей каталептических линий СВА и D13. Этот результат указывает на ассоциацию между основным локусом каталепсии и каталептогенным эффектом ЛПС.
Таким образом, наследственная предрасположенность к каталепсии ассоциирована с повышенной чувствительностью к эмоциональному стрессу и ЛПС. Возникает закономерный вопрос о нейрональном механизме данной ассоциации. Можно предположить, что нейрональным субстратом, связывающим стресс, ЛПС и каталепсию является 5-НТ система мозга. 5-НТ система мозга вовлечена в механизм наследственной каталепсии (Popova, Kulikov, 1995; Popova, 1999), а также играет важную роль в реакции на эмоциональный стресс (Chaouloff, 1993; Graeff, 1993). Более того, 5-НТ система участвует в психонейроиммуномодуляции (Идова и др., 2006; Idova et al., 2012). Известно, что 5-НТ система гипоталамуса вовлечена в механизм регуляции ГГНС (Науменко, 1971). Поскольку мы показали, что рестрикция и ЛПС значительно облегчают возникновение каталепсии у каталептических линий мышей по сравнению с некаталептической линией, то можно ли ожидать подобных изменений в 5-НТ системе мозга у каталептических линий при воздействии острого эмоционального стресса и активации неспецифического иммунного ответа?
Имеющиеся данные свидетельствуют, что эмоциональный стресс приводит к увеличению метаболизма 5-НТ в мозге (Tanaka et al, 1983; Kirby et al., 1997; Mo et al., 2008). Следует отметить, что большинство этих данных было получено преимущественно на крысах.
Основным результатом исследования по влиянию острого эмоционального стресса на 5-НТ систему мозга было выявление ассоциации реакции 5-НТ системы мозга с наследственной каталепсией. Было обнаружено увеличение основного показателя метаболизма 5-НТ - отношения 5-ГИУК/5-НТ в среднем мозге, только у каталептических линий СВА и D13, тогда как стресс не повлиял существенно на этот показатель у мышей некаталептической линии AKR. У конгенной линии D13 этот показатель был выше по сравнению с AKR и СВА как в контроле, так и при стрессе. Метаболизм отражает активность 5-НТ нейронов, включающую секрецию медиатора в синаптическую щель и его последующее разрушение ферментом МАО А. Увеличение метаболизма в среднем мозге нестрессированных мышей линии D13 можно интерпретировать, как более напряженное функционирование 5-НТ нейронов у животных данного генотипа по сравнению с мышами AKR. Острый стресс, связанный с ограничением подвижности, еще больше усиливает функциональную активность 5-НТ нейронов среднего мозга.
Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что ЛПС увеличивает метаболизм 5-НТ в головном мозге крыс (Dunn, 1992; Dunn, Wang, 1995; Lavicky, Dunn, 1995; Merali et al., 1997; Dunn et al., 1999; Wang, Dunn, 1999). Однако другие авторы не обнаружили этого влияния (Kabiersch et al., 1988). У мышей влияние ЛПС на 5-НТ систему мышей не так выражено, и оно, по-видимому, зависит от генотипа линии: ЛПС увеличивал уровень L-триптофана и 5-ГИУК у мышей СЗН/HeJ и СЗН/HeN (Dunn, Chuluyan, 1994), но не оказывал влияние на метаболизм 5-НТ у мышей линии BALB/c (Cho et al., 1999). Однако эти результаты получены разными авторами в различных
Сравнение действия острого эмоционального стресса на уровень экспрессии гена c-Fos в мозге у мышей конгенной линии D13 и родительской линии AKR
Не выявлено влияние фактора «стресс» на уровень 5-НТ в гиппокампе (Fi,56 l), гипоталамусе (Fi39 l) и среднем мозге (Fi,ss l). Влияние фактора «линия» на уровень 5-НТ было обнаружено в гиппокампе (F2,56=5,03, р 0,01) и среднем мозге(Рг,55=5,14, р 0,01). В покое уровень 5-НТ в гиппокампе у конгенной линии D13 был ниже (р 0,05), чем у родительской линии СВА, и не отличался от уровня 5-НТ у другой родительской линии AKR. При стрессе уровень 5-НТ у каталептической линии СВА был достоверно выше (р 0,05), чем у некаталептической линии AKR. В среднем мозге у конгенной линии D13 уровень 5-НТ при стрессе был ниже (р 0,01), чем у родительской линии СВА (Табл. 2) (Рис.11 А). Выявлено влияние фактора «стресс» на уровень 5-ГИУК только в среднем мозге (Fi,55=4,85, р 0,05). Влияние фактора «линия» на уровень 5-ГИУК было обнаружено в гиппокампе (F2,56=4,61, р 0,05) и гипоталамусе (F2,39=3,32, р 0,05). В покое уровень 5-ГИУК в гиппокампе у линии СВА был выше (р 0,05), чем у линии AKR. В среднем мозге стресс достоверно увеличивал уровень 5-ГИУК только у каталептической линии СВА (Табл. 2) (Рис.11Б).
Влияние острого стресса на уровень 5-НТ (А) и 5-гидроксииндолилуксусной кислоты (5-ГИУК) (Б) в гиппокампе, гипоталамусе и среднем мозге у линий мышей AKR, СВА и D13.
Данные представлены в виде М±т. р 0,05 по сравнению с контролем; @ р 0,05 по сравнению с AKR контроль; + р 0,05 по сравнению с AKR стресс; #р 0,05 по сравнению с СВА контроль; &&р 0,01 по сравнению с СВА стресс.
Не показано влияния факторов «стресс» (F 56 1 и Fi 39 1 в гиппокампе и гипоталамусе, соответственно), «линия» {Уг.ьь и F2,39 1 в гиппокампе и гипоталамусе, соответственно) и взаимодействия (линия х стресс) (F2,56 1 и F2,39 1 в гиппокампе и гипоталамусе, соответственно) на метаболизм 5-НТ в гиппокампе и гипоталамусе. В то же время, выявлено существенное влияние факторов «стресс» (Fi,55=12,67, р 0,001) и «линия» (F2,55=20,31, р 0,001), но не их взаимодействия 0F2,5S 1) на метаболизм 5-НТ в среднем мозге (Табл. 2). Рестрикция увеличивала метаболизм 5-НТ в среднем мозге у каталептических мышей линий СВА (р 0,05) и D13(p 0,05). Как в покое, так и при стрессе метаболизм 5-НТ был выше у конгенной линии по сравнению с мышами родительских линий СВА (р 0,001) и AKR (соответственно, р 0,01, р 0,001) (Рис.12).
Таким образом, фрагмент хромосомы 13 ассоциированный с наследственной каталепсией, вовлечен в регуляцию метаболизма 5-НТ при остром эмоциональном стрессе. Влияние острого стресса на метаболизм 5-НТ (5-ГИУК/5-НТ) в гиппокампе, гипоталамусе и среднем мозге у линий мышей AKR, СВА и D13.
Данные представлены в виде М±т. р 0,05 по сравнению с контролем; @@р 0,01 по сравнению с AKR контроль; +++р 0,001 по сравнению с AKR стресс; ### р 0,001 по сравнению с СВА контроль; &&&р 0,001 по сравнению с СВА стресс. Таблица 2. Результаты двухфакторного дисперсионного анализа по влиянию острого эмоционального стресса на 5-НТ систему в гиппокампе, гипоталамусе и среднем мозгвуАКЯ, СВА и D13.
После введения физиологического раствора каталепсия была обнаружена у 1 животного из 10 у линии мышей AKR, 9 из 10 у конгенной линии D13 и 8 из 11 у СВА. ЛПС в дозе 50 мкг/кг вызывал каталепсию у 1 животного из 10 у линии мышей AKR и у всех мышей линий D13 (п=11) и СВА (п=8). При введении дозы 200 мкг/кг 8 из 11 оказались каталептиками у линии AKR, как и все животные линий D13 (п=9) и СВА (п=10).
Было обнаружено достоверное влияние факторов «линия» (F2,so=53,15, р 0,001), «ЛПС» (F2,8o=14,9, р 0,001) и взаимодействия (линия х ЛПС) (F4,8o=4,05, р 0,01) на продолжительность каталепсии. После введения физиологического раствора время неподвижности у мышей D13 и СВА было выше, чем у линии AKR (р 0,01). ЛПС в дозе 50 мкг/кг не оказывал влияние на время неподвижности у AKR, но значительно увеличивал его у мышей линии D13 (с 72,03 ± 11,43 сек контроль до 115,9 ± 2,31 сек ЛПС, р 0,001) и у СВА мышей (с 46,18 ± 8,7 сек контроль до 96,25 ± 9,91 сек ЛПС, р 0,001). ЛПС в дозе 200 мкг/кг ЛПС увеличивал время каталепсии у всех линий у AKR (р 0,01), D13 (р 0,05) и СВА (р 0,001) (РисЛЗ).
РисЛЗ. Время неподвижности у животных обработанных физиологическим раствором и ЛПС (50 и 200 мкг/кг) AKR, СВА и D13 линий. Данные представлены в виде М±т. р 0,05, р 0,01, р 0,001 по сравнению с контролем; ##р 0,001 по сравнению с AKR контролем; @@@ р 0,001 по сравнению с животными пинии AKR обработанных ЛПС дозой 50 мкг/кг; &&& р 0,001 по сравнению с животными линии AKR обработанных ЛПС дозой 200 мкг/кг.
Не было выявлено влияние фактора «линия» на уровень 5-НТ в гиппокампе (F2,54 1) и среднем мозге (F2,54 1). В то же время было обнаружено влияние фактора «линия» на уровень 5-НТ в стриатуме (F2.s4=3,46, р 0,05) (Табл. 3) : уровень 5-НТ в этой структуре был выше у мышей линии AKR по сравнению с мышами линий СВА (р 0,05) и D13 (р 0,01). ЛПС снижал уровень 5-НТ в гиппокампе (F2,54=7,60, р 0,01) и стриаутме (F2,54=18,68, р 0,001), но увеличивал уровень 5-НТ в среднем мозге (F2.54=4,37, р 0,05). ЛПС в дозе 50 мкг/кг значительно снижал уровень 5-НТ в гиппокампе у мышей линий AKR (р 0,01) и D13 (р 0,05). В то же время ЛПС в дозе 200 мкг/кг значительно снижал уровень 5-НТ в стриатуме у всех мышей исследуемых линий. ЛПС в дозе 200 мкг/кг (р 0,05), но не 50 мг/кг увеличивал на уровень 5-НТ в среднем мозге у мышей линии СВА по сравнению с контрольными мышами. Тенденция к увеличению была обнаружена в конгенной линии мышей D13 при обеих дозах ЛПС (р=0,055 и р=0,054) (Рис. 14А).
Данные представлены в виде М±т. р 0,05, р 0,01, р 0,001 по сравнению с контролем, #р 0,05, Шр 0,01 по сравнению с AKR контроль.
Ни фактор «линия» (F2,54=2,03, р 0,05), ни фактор «ЛПС» (F2,54=3,10, р 0,05) не изменил уровень 5-ГИУК в гиппокампе. У животных, получавших физиологический раствор, не было обнаружено никакой разницы в уровне 5-ГИУК в стриатуме (F2,54 1) или среднем мозге (F2,54=l,16, р 0,05). В то же время ЛПС значительно изменил уровень 5-ГИУК в этих структурах (Р2 54=3,31, р 0,05 в стриатуме и F2,54=l 1,30, р 0,001 в среднем мозге). В то время как ЛПС в дозе 200 мкг/кг значительно снижал уровень 5-ГИУК в стриатуме у мышей линии AKR (р=0,02), обе дозы ЛПС значительно увеличивали уровень 5-ГИУК в среднем мозге у мышей линий СВА (р 0,01 при 50 мкг/кг и р 0,001 при 200 мкг/кг) и D13 (р 0,01) (Рис. 14Б).
ЛПС увеличивал метаболизм 5-НТ (отношение 5-ГИУК/5-НТ) в среднем мозге (F2.54=13,2, р 0,001), гиппокампе (F2,54=45,43, р 0,001) и стриатуме (F2,54=10,43, р 0,001) (Табл. 3). Обе дозы ЛПС значительно увеличивали метаболизм 5-НТ в гиппокампе у всех трех линий (р 0,001). ЛПС в дозе 50 мкг/кг увеличивал метаболизм 5-НТ в среднем мозге только у каталептических линий СВА (р 0,001) и D13 (р 0,05). В то же время ЛПС в дозе 200 мкг/кг значительно увеличивал метаболизм 5-НТ в этой структуре у всех трех линий. Ни доза 50 мкг/кг ни доза 200 мкг/кг ЛПС не влияла на метаболизм 5-НТ в стриатуме у AKR. Однако ЛПС в дозе 200 мкг/кг значительно увеличила метаболизм 5-НТ в стриатуме у каталептических линий СВА (р 0,01) и D13 (р 0,05) (Рис.15).
