Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1 Морфология гиппокампа 14
1.2 Вызванная активность 15
1.3 Следовые посттетанические изменения 17
1.4 Длительная потенциация 17
1.4.1 Механизм развития ДП 17
1.4.2 Глутаматные рецепторы и их роль в механизме развития ДП... 19
1.4.3 Роль протеинкиназ в механизме развития ДП 21
1.5 Длительная депрессия.. 22
1.6 ДП и ДД в аспекте обучения и памяти 22
1.7 Общее понятие о стрессе 23
1.7.1 Стресс-система 25
1.7.2 Стресс-лимитирующие системы 28
1.7.3 Стресс и перекисное окисление липидов 30
1.7.4 Нарушение ПОЛ в мозге при стрессе ...32
1.8 Стресс и пластичность в лимбической системе 37
1.9 Стресс и длительная потенциация в гиппокампе 38
1.9.1 Модуляция ДП гормонами стресса кортикостероидами 39
1.9.2 Свободные радикалы и ДП 40
1.10 Глютатион и его роль в анитоксидантной защите мозга 43
1.10.1 Метаболизм и содержание глютатиона в гиппокампе 44
1.10.2 Глютатион и синаптическая пластичность 45
1.10.3 Локализация глютатиона в гиппокампе и его роль в процессах восстановления после окислительных повреждений 46
1.11 Заключение по обзору литературы 47
Глава 2. Методика исследования 49
2.1 Схемы экспериментов 49
2.2 Нейрофизиологические исследования 50
2.2.1 Приготовление среза 50
2.2.2 Установка для отведения вызванной активности в срезах мозга 51
2.2.3 Инкубационный раствор. 53
2.2.4 Отведение и регистрация электрической активности 53
2.2.5 Ход эксперимента 55
2.2.6 Обработка результатов 56
2.3 Исследование процессов свободнорадикального окисления 58
2.3.1 Описание хемилюминометра 58
2.3 2 Изучение процессов ПОЛ в гомогенатах гиппокампа 60
2.3.3 Изучение антиокислительной активности коменовой кислоты и её солей в модельных системах 60
2.4 Биохимические определения. 61
2.4.1 Определение малонового диальдегида 62
2.4.2 Определение активности глютатионпероксидазы 63
2.4.3 Определение содержания восстановленного глютатиона 64
2.4.4 Определение содержания окисленного глютатиона 65
2.4.5 Определение МДА в гиппокампе in vitro с коменовой кислотой 66
2.5 Коменовая кислота её моно- и динатриевые соли 67
Глава 3. Результаты собственных исследований 69
3.1 Изменения функциональных показателей при разных схемах экспозиции к стресс-факторам 69
3.2 Изменения функциональных характеристик нейронов гиппокампа при действии стресс-факторов 74
3.3 Антистрессорное действие коменовой кислоты 76
3.4 Влияние коменовои кислоты на синаптическую пластичность в гиппокампе 78
3.5 Дозозависимость нормализующего действия коменовои кислоты на нарушенную в результате стресса длительную потенциацию 82
3.6 Гиперпродукция свободных радикалов в тканях мозга крыс
при стрессе и ее подавление коменовои кислотой in vitro 84
3.7 Коменовая кислота нормализует синаптическую пластичность и продукцию свободных радикалов в гиппокампе мозга крыс при иммобилизационном стрессе 87
3.8 Перекись водорода увеличивает амплитуду ДП в срезах гиппокампа крыс 93
3.9 Метаболизм глютатиона в гиппокампе крыс при иммобшшзационно-холодовом стрессе 95
3.10 Антиоксидантная и противострессовая активность натриевых солей коменовои кислоты 98
3.11 Предотвращение постстрессовых изменений длительной потенциации в гиппокампе крыс мононатриевой и динатриевой солью коменовои кислоты 103
Глава 4. Обсуждение результатов 108
4.1 Постстрессовое увеличение скорости свободнорадикального окисления в гиппокампе 108
4.2 Нарушение метаболизма глютатиона в гиппокампе стрессированных крыс .111
4.3 Постстрессовое увеличение амплитуды ДП 112
4.4 Антиоксидантиое действие коменовои кислоты и коменатов натрия 116
4.5 Нормализующее действие коменовои кислоты и её солей на скорость свободнорадикального окисления, метаболизм глютатиона и гиппокампальную ДП при стрессе 117
4.6 Заключение 121
Выводы 123
Список литературы 125
- Стресс и перекисное окисление липидов
- Установка для отведения вызванной активности в срезах мозга
- Влияние коменовои кислоты на синаптическую пластичность в гиппокампе
- Постстрессовое увеличение скорости свободнорадикального окисления в гиппокампе
Введение к работе
Актуальность темы.
Проблема стресса занимает одно из ведущих мест среди проблем экологической физиологии. Происходящие при стрессе нарушения механизмов гомеостаза создают предпосылки к развитию психосоматических заболеваний, прежде всего неврозов, иммунодефицитов, гормональных расстройств, сердечно-сосудистых заболеваний, диабета, язвенных поражений желудочно-кишечного тракта (Судаков, 1984, 1992; Меерсон, 1984; Владимиров и Арчаков, 1972; Ашмарин, 2005) .
Стресс-факторы влияют на физиологические и когнитивные функции через активацию гипоталамо-адренокортикальной системы и повышение уровня циркулирующих кортикостероидов, вызывая при продолжительном воздействии патологические изменения в органах и ЦНС. Стресс-факторы, включающие выраженный психоэмоциональный компонент (иммобилизация, болевое раздражение) поступают в гипоталамус через лимбическую систему мозга (Herman et aL, 1996; Carrasco and Van de Kar, 2003; Van de Kar and Blair 1999). Гиппокамп как центральная структура лимбической системы играет важную роль в регуляции стресс-реакции (Carrasco and Van de Kar, 2003; Van de Kar and Blair 1999). Являясь одной из наиболее чувствительных к стрессу областей мозга, гиппокамп обнаруживает структурные перестройки и изменения функциональных свойств нейронов при действии стресс-факторов (Sala et al., 2004; McEwen, 1994; McEwen and Magarinos, 2001).
Высокую чувствительность к стресс-факторам и медиаторам стресса проявляет также длительная потенциация (ДП) синаптической передачи в гиппокампе (Sapolsky, 2003; Garcia, 2001; Pavlides et al., 1993; McEwen, 1994; McEwen and Magarinos, 2001) - одно из проявлений синаптической пластичности, лежащей в основе адаптивных процессов и обучения (Bliss and Collingridge, 1993).
Многочисленные исследования последних лет показали, что возникновение патологических состояний при стрессе связано с активацией процессов свободнорадикального окисления молекул биологических мембран (Зозуля, 2000; Kovacs et ah, 1996; Abidin et al., 2004; Sahin and Gumulsu, 2004; Yaras et al,, 2003; Zidi and Banu, 2004). Эти процессы носят, очевидно, общебиологический характер и, по мнению многих авторов, являются универсальным механизмом повреждения клеток разных органов и тканей при различного рода патологиях. С активацией свободнорадикального окисления мембранных липидов и белков связывают ухудшение когнитивных функций мозга при старении (Golden et al, 2002; Joseph, 1992) и развитие нейродегенеративных заболеваний (Gotz et al., 1994). Ряд данных свидетельствует об успешном лечении многих дисфункций с помощью антиоксидантов (Фархутдинов и Лиховских, 1995; Владимиров, 1998; Муфазалов, 2002, Joseph, 2005; Lynch, 2001; O'Donnell and Lynch, 1998; Youdim et al., 2004). В связи с этим поиск новых физиологически активных веществ с выраженными антиоксидантными свойствами при отсутствии побочных эффектов на жизненно важные функции представляет собой актуальную задачу.
Коменовая кислота (5-окси-7-пирон-2-карбоновая кислота), является основным физиологически активным соединением в препарате Бализ-2, используемом в медицинской практике в качестве ранозаживляющего средства и при лечении язв желудочно-кишечного тракта (Шурыгин, 2002). Многолетними экспериментальными исследованиями установлено, что данный препарат имеет преимущество в сравнении с аналогичными, а именно, не обладает побочным действием, не угнетает неспецифический иммунитет. Клиническое применение Бализа-2 подтвердило эти качества и его высокую лечебную эффективность. За высокую эффективность в сочетании с полной безвредностью ему были присуждены четыре золотые медали на Всемирной выставке интеллектуальной собственности (г. Женева, 1988 г.), Международных выставках (г. Москва, 2001г., г. С-Петербург, 2001 г.) и Всероссийской ярмарке (г. Нижний Новогород, 2004 г.). Исследования последних лет показали, что коменовая кислота обладает выраженными антиокидантными свойствами (Шурыгин, 2002).
В связи с вышеизложенным, изучение способности коменовой кислоты и ее солей препятствовать развитию нарушений, вызываемых стрессом в гиппокампе, одной из центральных структур регуляции стресс-реакции, играющей также важную роль в процессах обучения и памяти, представляет не только теоретический, но и значительный практический интерес.
Цель исследования:
Целью настоящей работы являлось исследование влияния коменовой кислоты и ее производных на свойства длительной потенциации вызванных ответов и состояние глютатионовои системы антиоксидантнои защиты в гиппокампе при действии стресс-факторов.
В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Отработать эффективную методику развития стресса в организме экспериментальных животных, используя иммобилизацию и охлаждение в качестве стресс-факторов.
Изучить характеристики вызванной активности и длительной потенциации вызванных ответов в поле СА1 гиппокампа после воздействия наиболее эффективных стресс-факторов.
Изучить параметры радикалообразования и перекисного окисления липидов в условиях стресса и оценить их корреляцию с изменениями физиологических характеристик.
Исследовать состояние глютатионовои системы при стрессе
Исследовать влияние коменовой кислоты на изменения свойств длительной потенциации и параметров свободнорадикального окисления при действии стресс-факторов.
Оценить эффективность моно- и динатриевой солей коменовой кислоты на тех же экспериментальных моделях.
Научная новизна работы
Охарактеризовано влияние различных видов стресса на свойства ДП суммарных вызванных ответов пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа крыс. Впервые выявлено значительное увеличение амплитуды ДП в результате применения иммобилизацинно-холодовой и иммобилизационной схем стрессирования. Установлена связь между вызываемым стрессом увеличением амплитуды ДП и возрастанием количества свободных радикалов, а также продуктов ПОЛ. Впервые установлено, что коменовая кислота и ее моно- и динатриевая соли при интрагастральном введении в период стрессирования проявляют центральное антистрессорное действие, предотвращая увеличение амплитуды ДП и гиперпродукцию свободных радикалов в гиппокампе.
Практическая значимость
Полученные данные о нормализующем влиянии коменовой кислоты и коменатов натрия на гиппокампальную пластичность и свободнорадикальное окисление в условиях стресса будут включены в состав материалов, представляемых в Фармакологический комитет Минздрава РФ с целью получения разрешения на клинические испытания препарата Бализ-2 по новому назначению, а именно для профилактики и ликвидации стрессорных состояний. Наличие аналогичных свойств у моно- и динатриевой солей коменовой кислоты дает основание для проведения фармакологических экспериментов с целью разработки новых лекарственных средств на основе этих веществ для лечения заболеваний, при которых кислотные свойства, присущие препарату Бализ-2, необходимо исключить. Возможность использования коменатов натрия парентеральным путём представляется весьма важной для медицинской практики.
Основные положения, выносимые на защиту:
Развитие иммобилизационно-холодового стресса значительно увеличивает амплитуду ДП вызванного ответа в поле СА1 гиппокампа.
Наряду с увеличением ДП, иммобилизационно-холодовой стресс увеличивает скорость свободнорадикального окисления в ткани гиппокампа.
Стресс вызывает нарушение метаболизма глютатиона в гиппокампе, проявляющееся в значительном возрастании активности глютатионпероксидазы и увеличении соотношения окисленный/восстановленный глютатион.
Коменовая кислота и ее моно- и динатриевая соли обладают антистрессорным действием, предотвращая изменения амплитуды гиппокампальной ДП, скорости свободнорадикального окисления и нарушения метаболизма глютатиона в гиппокампе при интрагастральном введении в период экспозиции к стресс-факторам.
Апробация работы
Основные результаты исследований доложены на: — Научно-практической конференции «Медицина будущего». (Краснодар-Сочи, 2002). - Первой всероссийской научно-практической конференции «Теория и практика газоразрядной фотографии», (Краснодар, 2003). — заседании Совета отдела биологически активных веществ Кубанского государственного университета (Краснодар, 2005). - заседании кафедры Физиологии высшей нервной деятельности Биологического факультета МГУ (Москва, 2005).
Публикации по теме диссертации
По материалам диссертации опубликовано 17 работ: 12 статей и 5 тезисов.
Структура и объём диссертации
Диссертация состоит из 4 глав и включает Введение, Обзор литературы, Методику исследования, Результаты собственных исследований, Обсуждение, Заключение и Список литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописного текста, содержит 8 таблиц и 29 рисунков. Список литературы включает 277 источников, в том числе 214 иностранных.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 04-04-49838).
Стресс и перекисное окисление липидов
Липидная пероксидация в мозге - одно из главных последствий стресса (Sahin and Gumuslu, 2004). Очень важно определить её количественно и для эксперимента и для клиники. Сложность и неоднозначность индикаторов стресса установлена в работе Shaheen А. А. и соавторов (1996). Уровень малонового диальдегида, показателя липиднои пероксидации, активность супероксиддисмутазы, глютатионпероксидазы, содержание окисленного глютатиона и активность Na/K насоса определяли в мозге крыс после иммобилизации, гипоксии и холода. Оказалось, что гипоксия и голод стимулировали формирование липидных перекисей в мозге, об этом судили по увеличению МДА, который был выше при голодании, чем гипоксии. Активность СОД также была увеличена в ответ на воздействие гипоксии и лишение пищи, а содержание глютатиона было уменьшено только при гипоксии. Однако ни МДА, ни СОД и глютатион не были изменены при иммобилизации. Активность Na/K насоса в мозге значительно увеличивалась при иммобилизации и гипоксии, но уменьшалась при голодании. Приведённые результаты показывают, что биохимические изменения при различных видах стресса могут быть разными, несмотря на увеличение содержания перекисей липидов под воздействием гипоксии и голодания.
Иммобилизационный стресс у крыс вызывает не только окислительное повреждение липидов (Kovacs et al., 1996) и протеинов в мозге, но и ДНК. Такие данные получены Liu J и соавторами (1996), установившими окислительное повреждение ядерной ДНК во всех отделах мозга. Ими установлено значительное увеличение липиднои пероксидации в церебральном кортексе, мозжечке, гиппокампе и среднем мозге. Уменьшалось содержание глютатиона. Исследования митохондриальной и цитозольной фракций церебрального кортекса показали, что в митохондриях значительно увеличилась пероксидация и окисление протеинов, причём больше чем в цитозоле. Для предотвращения нейродегенеративных изменений в мозге стрессированного организма, и если они произошли, для возможности их устранения используются в первую очередь фармакологические препараты, а для этого требуется глубокое знание динамики биохимических процессов. Сложность решения этой задачи состоит в том, что ответ организма на стресс-фактор обусловлен его физиологическими особенностями и состоянием в период стрессирования. Этим можно объяснить противоречивые данные различных исследователей по стрессу, особенно это касается ранней стадии.
При разных формах стресса наблюдается первичная стадия ингибирования ПОЛ в мозге, а затем следует его активация. Сроки наступления фаз ингибирования и активации обусловлены природой стресса и физиологическим состоянием организма. Вначале избыток радикалов не инициирует ПОЛ, т. к. они подавляются антиоксидантными системами. В этот период наблюдается мобилизация защитных сил. Затем при истощении этих систем происходит усиление ПОЛ, нарушается микроциркуляция, усиливается радикалообразование и, как следствие, нарушается структура мембран нейронов (Гуляева и др., 1998).
Интересен результат эксперимента, показавшего, что головной мозг как орган особо важный в организме имеет особенность быстрее чем другие органы справляться с негативным влиянием стресса. Установлено, что у крыс, имевших наиболее высокую концентрацию продуктов ПОЛ в печени, содержание их в мозге было меньше (Меерсон и др., 1988).
Установлено, что при иммобилизационном и холодовом стрессе концентрация кортикостеронов в плазме и липидная пероксидация в мозге и сетчатке значительно увеличивается (Yaras et al., 2003). Авторы делают вывод, что стресс-вызванная липидная пероксидация может оказывать влияние на вызванные зрительные потенциалы.
Приведённые результаты говорят о том, что окислительное повреждение в мозге при стрессе является одной из причин дегенеративных болезней, включая мозговые дисфункции.
Однако есть возможность и для профилактики и ликвидации постстрессовых нарушений в мозге. Повышенная генерация радикалов в результате стресса, нарушающая синаптическую пластичность, дендритную морфологию, вызывающая нейротоксические повреждения может быть нормализована с помощью антиоксидантов, в частности витаминов А, Е и С. Так в работе Zaidi и Barm (2004), которые вызывали стресс путём иммобилизации и устанавливали вызванные им нарушения по активности СОД и каталазы, содержанию глютатиона в тканях мозга было показано, что постстрессовые нарушения указанных метаболитов можно устранить с помощью витаминов А, С и Е. Причём наибольший эффект получен при использовании витамина Е. Нужно указать, что в большинстве исследований витамин Е уменьшал уровень кортикостеронов, нитритов в ткани мозга стрессированных крыс (Yargicoglu et al., 2003 Armario et al., 1990).
Приведённые нами лишь некоторые данные по витаминам показывают, что нейродегенеративные изменения в стрессированном мозге можно устранять с помощью этих физиологически активных веществ, обладающих антиоксидантним действием.
В клинической практике уже используются различные лекарственные средства для устранения стрессорных нарушений. Так, например ноотропные препараты пирацетам и церебролезин используются как антиоксиданты для коррекции нарушенного стрессом радикалообразования (Девяткина и др., 2000). Ноотропный дипептид ГВС - 111 уменьшает накопление в коре головного мозга и сыворотке крови продуктов перекисного окисления у животных, перенесших иммобилизационный стресс (Лысенко и др., 1997). Нейропсихотропный синтетический препарат мексидол эффективно используется для коррекции дисфункции мозга, лечения больных с острыми У нарушениями мозгового кровообращения (Дюмаев и др., 1995).
Имеется большая перспектива в практическом использовании для коррекции нарушений ПОЛ в мозге с помощью нейропептидов. Залогом этого являются современные достижения в области химического синтеза и аналитической химии, позволяющей выделить из природных источников нейропептиды и произвести синтез их аналогов. В клинике успешно используются тиролиберин при острых депрессивных состояниях и геморрагическом шоке. При использовании нейропептидов очень важно учитывать дозы и физиологическое состояние организма. Например, опиоидные пептиды не оказывают влияния в нормальном организме на уровень гастрина, но резко подавляют его секрецию при стрессе (Чазов и др., 1984).
Интерес представляет экспериментальное исследование о защитном эффекте адаптации к стрессу от повреждений, вызванных геморрагическим шоком. Авторами было показано, что предварительная адаптация к кратковременным стрессам активирует в мозге ферментную антиоксидантную защиту и оказывает защитный эффект от повреждений, вызванных геморрагическим шоком (Кизиченко и Архипенко, 1998).
Одним из важных факторов патогенеза нейродегенеративных изменений мозга при хроническом стрессе является нарушение митохондриальной электронно-транспортной цепи. Хронический стресс вызывает увеличение продукции оксида азота путём экспрессии индуцированной N0 синтетазы в мозге. N0 регулирует митохондриальную функцию. Хронический иммобилизационный стресс у крыс самцов угнетает активность первичных комплексов митохондриальной цепи на 69% в комплексе 1-3 , на 67% в комплексе 2-3, без угнетения активности комплекса 4, продукции АТФ и потребления кислорода. Аминогуанидин предотвращает эти нарушения и препятствует накоплению N0, снижает липидную пероксидацию и нормализует обмен глютатиона. Установлено, что гиперпродукция NO в мозге при стрессе частично ингибирует митохондриальную дыхательную цепь. (Madrigal et. al., 2001).
Установка для отведения вызванной активности в срезах мозга
Все эксперименты в данной работе проведены на самцах крыс линии Wistar в возрасте 6-8 недель.
В экспериментах по выявлению нормализующего действия коменовоЙ кислоты на нарушенную в результате иммобилизационно-холодового стресса ДП использовали четыре группы животных. В 1-ю (контроль, п=И) вошли крысы, не подвергавшиеся стрессовым воздействиям. Во 2-ю (п=8)-животные, также не подвергавшиеся стрессовым воздействиям, но получавшие в течение 4 дней коменовую кислоту (п=8) в виде водного раствора через металлический желудочный зонд. Крыс 3-й и 4-й групп в течение 4 дней подвергали воздействию холодового и йммобилизационного стресс-факторов. В 3-й группе (п=11) животным ежедневно в период стрессирования интрагастрально через зонд вводили 1 мл дистиллированной воды, а в 4-й (п=11) - коменовую кислоту. На следующий день через 17-19 ч после последней экспозиции животных декапитировали и готовили 3-4 поперечных среза для определения ДП по методике, описанной ниже.
В экспериментах по выявлению нормализующего действия коменовой кислоты на нарушенную в результате иммоблизационного стресса ДП и скорость свободнорадикального окисления в гиппокампе использовали группы, аналогичные описанным выше: интактные (п=16) интактные+коменовая (п=16), стресс (п=16), стресс+коменовая (п=16). По пять животных из каждой группы были отобраны для определения ДП, а суммарные ткани гиппокампа остальных животных использовались для определения содержания свободных радикалов хемилюминесцентным (ХЛ) методом, описанным ниже (пункт 2.3.2) и малонового диальдегида (пункт 2.4.1).
Для выявления нормализующего влияния коменовой кислоты на нарушенный в результате иммобилизационно-холодового стресса метаболизм глютатиона также использовали группы животных, аналогичные описанным выше: интактные (п=40), интактные+коме новая (п=40), стресс (п=40), стресс+коменовая (п=40).
В экспериментах по выявлению нормализующего действия моно- и динатривой солей коменовой кислоты на нарушенную в результате иммобилизационно-холодового стресса ДП использовали четыре группы животных: в 1-ю группу вошли животные, не подвергавшиеся стрессовым воздействиям (п=5), во 2-ю, животные перенёсшие иммобилизационно-холодовой стресс и получавшие ежедневно во время стрессирования 1 мл воды (п—5), 3-ю и 4-ю группы «стресс+мононатриевая соль коменовой кислоты» (п=5) и «стресс+динатриевая соль коменовой кислоты» (п=5) составили животные, получавшие ежедневно во время стрессирования эквивалентный объем соответствующей соли (1 мг/мл).
Опыты проводились на срезах гиппокампа крыс линии Вистар в возрасте 6-8 недель. Препарат приготовлялся следующим образом: после декапитации кожа, прикрывающая теменную часть, отодвигалась, далее ножницами производился разрез черепной кости по саггитальному шву. Половинки теменной кости удалялись пинцетом. На оголённом мозге животного осколком лезвия бритвы, закрепленном в держателе, перпендикулярно коре правого полушария и под углом примерно 30 к медиальной линии делался разрез на всю глубину ткани, проходящий через каудальный межполушарный полюс. Далее левая часть мозга удалялась. На сечении боковой части идентифицировался гиппокамп, кора полушарий отодвигалась боковой плоскостью бритвы, и от гиппокампа параллельно первоначальному разрезу отсекалось несколько слоев ткани, в результате чего получалось 2-3 поперечных среза гиппокампа, которые по мере изготовления переносились на нейлонную сетку, находящуюся в проточной камере, предназначенной для электрофизиологического исследования (рис 4). Время приготовления среза обычно не превышало 3 минут, толщина полученных срезов составляла 0.4 - 05 мм. Схема установки показана на рис 4. Суперфузионный раствор поступал в рабочий объем камеры из резервуара, расположенного на 40 см выше, под действием силы тяжести. Этот резервуар представлял собой градуированный цилиндр объемом 40 мл, в котором производилось постоянное насыщение рабочего раствора карбогеном (95% 02 и 5% С02). Для обеспечения постоянной скорости протока, которая зависит от высоты столба жидкости в подающем резервуаре, уровень жидкости в нем поддерживался с помощью системы сообщающихся сосудов, состоящей из малого основного (40 мл) и большего дополнительного (500 мл) объемов. Температура среды при предварительной инкубации и во время отведения электрической активности поддерживалась на уровне 28-30 С. Поддержание нужной температуры осуществлялось с помощью нихромовой спирали, намотанной на стеклянную трубку, соединяющую камеру с резервуарами. Спираль подключалась к источнику постоянного тока. Температура в камере измерялась с помощью термосопротивления, включённого по мостовой схеме, с индикацией на откалиброванном стрелочном гальванометре. Рабочая камера с прозрачным дном была смонтирована между бинокулярной лупой МБС-10 и источником света. Для предотвращения нежелательных вибраций и электрических помех камера, бинокулярный микроскоп, микроманипуляторы, источник света, а также предусилитель и изолирующая приставка были помещены в экранированный металлический каркас, находящийся на опорах, закреплённых в капитальной стене здания. приставка; 15 - стимулятор; 16 - компьютер; 17 - устройство подогрева раствора; 18 - экран от внешних помех; подробное описание этого и следующих рисунков в тексте. В качестве перфузионной среды использовался модифицированный раствор Рингера для теплокровных следующего состава (мМ): NaCl - 124; КС! - 3; СаС12 - 2,5; MgS04 - 2,5; Na2HP04 - 1,25; NaHC03 - 26; D-глюкоза -10, постоянно насыщаемый карбогеном (95% 02+5% СОг). Раствор готовили на бидистиллированной воде. Для визуального определения рН, изменения которого обусловлены насыщением углекислотой, в раствор добавляли индикатор феноловый красный из расчёта 0.001 мг/мл. По мере насыщения раствор менял окраску от ярко-фиолетовой до красно-оранжевой, соответствующей рН 7.2-7.4.
Влияние коменовои кислоты на синаптическую пластичность в гиппокампе
Стресс, как известно, проходит в своём развитии три стадии: стадия тревоги, стадия резистентости и стадия истощения. В процессе реализации стресс-реакции происходит увеличение количества свободных радикалов в тканях, сопровождаемое увеличением ПОЛ (Барабой, 1989 а; Зозуля и др. 2000; Владимиров и Арчаков, 1972; Меерсон, 1981; Меерсон и Пшенникова, 1988). Общие закономерности динамики показателей равновесия ПОЛ и антиокислительной активности по отношению к стадиям стресса при различных видах стрессовых воздействий у животных аналогичны. Так стадии тревоги сопутствует первичная активация ПОЛ, которая сменяется реактивной мобилизацией антиокислительных резервов. Первичная вспышка ПОЛ носит характер медиатора стресса, имеет очень маленькую продолжительность и в некоторых случаях её даже не удаётся зарегистрировать (Барабой, 1991; Зозуля и др, 2000). Стадии резистентности соотвествует стабилизация равновесия на уровне, близком к исходному, и снижение ПОЛ, а в некоторых случаях даже его ингибирование. Для стадии истощения характерен значительный рост скорости свободнорадикального окисления, называемый вторичной вспышкой ПОЛ, которая сопровождается снижением антиокислительного потенциала тканей. Переход в эту стадию наблюдается при продолжительных стрессах и сопровождается гиперкатехоламинией (Барабой, 1989 Ь).
В условиях иммобилизационно-холодового стресса, наличие которого определяли по характерным изменениям в лейкоформуле крови и весе внутренних органов, мы обнаружили существенное увеличение скорости свободнорадикального окисления в гиппокампе. Двукратное увеличение параметра, характеризующего способность липидов гомогената ткани подвергаться перекисному окислению, у стрессированных животных свидетельствует о значительном увеличении количества свободных радикалов в этой ткани.
Наряду с измерением количества свободных радикалов, мы провели параллельное определение концентрации МДА - одного из вторичных продуктов ПОЛ. Нами установлено, что его содержание в тканях гиппокампа животных, перенёсших стресс, превышает контрольный уровень практически в 1.5 раза. Эти данные совпадают с результатами исследования других авторов, которыми показано сходное увеличение радикалообразования, и концентрации продуктов ПОЛ при длительном воздействии экстремальных стресс-факторов (Гуляева и др., 1988). Исследования ряда авторов показали зависимость концентрации продуктов ПОЛ от стадий стресса, а именно, увеличение в стадии тревоги, ингибирование в стадии резистентности и значительное увеличение в стадии истощения (Гуляева и др., 1988; Меерсон и др. 1988, Меерсон и др. 1979; Зозуля и др. 2000). Причина столь значительной активации ПОЛ в стадии истощения кроется, видимо, в его предшествующем ингибировании в стадии резистентности. При этом накапливаются радикалы и липиды, обладающие низкой антиокислительной активностью, и вследствие этого как следствие, быстро окисляющиеся. Эти процессы на фоне исчерпания эндогенных антиокислительных резервов, вызванных продолжительным стрессом, создают благоприятные условия для значительного усиления ПОЛ (Зозуля и др., 2000; Гуляева и др., 1988; Барабой, 1989 а).
Полученные нами результаты хорошо согласуются с результатами исследований других авторов, которые показали, что активация свободнорадикального окисления наблюдается при воздействии на биологические системы любой степени сложности самых разнообразных экстремальных агентов и обосновали концепцию нарушения стационарного состояния свободнорадикального окисления, как составной часть общего синдрома адаптации — стресса (Владимиров, Арчаков, 1972; Муфазалов, 2002; Зозуля, 2000; Барабой, 1989 а; Барабой, 1991). При этом следует отметить, что именно в головном мозгу существуют особенно благоприятные условия для развития свободнорадикальной патологии. Высокое содержание липидов и скорости потребления кислорода при наличии развитой системы биологических мембран делают головной мозг особо уязвимым для окислительного стресса (Болдырев, 2001).
Следует отметить, что в литературе имеются подобные результаты о постстрессовом нарушении ПОЛ в мозге и в гиппокампе в частности в результате действия иммобилизации, холода и их сочетания (Sahin and Gumuslu, 2004; Yaras et al., 2003; Kovacs et al., 1996; Volchegorskii et al., 2004).
Указанные авторы отмечают, что самые значительные нарушения вызывают модели иммобилизационно-холодового и иммобилизационного стресса по сравнению с Холодовым. Иммобилизационный стресс вызывал не только значительное увеличение ПОЛ в тканях гиппокампа, но и окислительные повреждения ядерной ДНК (Liu et al., 1996). Нарушение пространственного обучения и памяти, коррелирующее с увеличением ТБК-активных продуктов в мозге, свидетельствующем о нарушении процессов ПОЛ было обнаружено у крыс, перенёсших иммобилизационный стресс различной длительности (Abidin et al., 2004).
Постстрессовое увеличение скорости свободнорадикального окисления в гиппокампе
Введение коменовой кислоты экспериментальным животным в период экспозиции к стресс-факторам предотвращало увеличение концентрации свободных радикалов, значительно снижало концентрацию МДА, восстанавливало нормальный метаболизм глютатиона и нормализовало величину гиппокампальной ДП. Введение коменовой кислоты интактным животным не влияло ни на один из вышеперечисленных показателей. Исследование дозозависимости нормализующего действия коменовой кислоты на величину ДП определило диапазон Ы.5.мг/мл как оптимальный в отношении ее антистрессорного действия на ДП Интересно, что эта концентрация соответствует концентрации коменовой кислоты в составе препарата Бализ-2, используемого в клинической практике (Шурыгин, 2002)
Способность предотвращать постстрессовое возрастание величины ДП проявили также мононатриевая и динатриевая соли коменовой кислоты при интрагастральном введении в течение воздействия стресс-факторов. Эти результаты могут послужить основанием для проведения фармакологических экспериментов с целью разработки лекарственных средств на основе этих солей коменовой кислоты, в том числе препаратов, с концентрацией водородных ионов, характерной для организма человека и животных. Это весьма важно для использования производных коменовой кислоты (Бализа-2) по новому назначению для лечения других патологий.
Наши данные о нормализации нарушенных в результате иммобилизационно-холодового стресса процессов ПОЛ в гиппокампе коменовой кислотой/ обладающей антиоксидантными свойствами, хорошо согласуются с данными других авторов. Так Yargicoglu и соавторами (2003) было обнаружено значительное увеличение ПОЛ в тканях мозга крыс при использовании в качестве стресс-факторов иммобилизации, холода и их сочетания. Применение антиоксиданта а-токоферола приводило к значительному снижению липидной пероксидации при действии вышеуказанных стресс-факторов. Подобные результаты о нормализующем влиянии антиоксидантных витаминов А, С и а-токоферола на нарушенные в результате иммобилизационного стресса процессы липидной пероксидации получены в работе Zaidi и соавторов (2004). Авторы отмечают, что наиболее выраженный нормализующий эффект был получен при использовании а-токоферола.
Как упоминалось выше, первичная вспышка ПОЛ является медиатором стресса, сигналом, запускающим стресс-реакцию. Уменьшение первичной вспышки ПОЛ антиоксидантами ослабляет стресс-реакцию. Имеются данные о том, что нетоксичные антиоксиданты при введении в достаточно высоких дозах в живую систему перед воздействием стресс-факторов, приводят к подавлению стрессорной активации ПОЛ, что увеличивает выживаемость экспериментальных животных, уменьшает тяжесть патологического процесса, ускоряет восстановления и выздоровления (Зозуля и др., 2000).
Таким образом, справедливо считать, что введение коменовой кислоты, обладающей антиоксидантными свойствами, могло приводить к снижению первичной вспышки ПОЛ и, как следствие, к ослаблению стресс-реакции организма, выражающемуся в снижении гиперпродукции свободных радикалов во время вторичной вспышки ПОЛ. Это предположение объясняет снижение светосуммы в хемилюминесцентном исследовании гомогенатов гиппокампа стрессированных животных и нормализацию содержания МДА в них.
Подавление гиперпродукции свободных радикалов у стрессированных животных могло также привести к предотвращению изменений в метаболизме глютатиона. Подобные данные о восстановлении нарушенного уровня глютатиона в результате стресса с помощью витаминов А, Е и С, обладающих антиоксидантными свойствами имеются в литературе (Zaidi and Banu, 2004). Нами показано, что содержание окисленного и восстановленного глютатиона и фермента глготатионперкосидазы у крыс, получавших во время стрессирования коменовую кислоту, соответствует нормальному метаболическому уровню. Не исключено, что нормализация метаболизма глютатионовой системы могла в какой-то мере способствовать и нормализации ДП, т. к. глютатион необходим для защиты нейронов от свободнорадикальных повреждений (Pellmar et al., 1992 b; Соколовский, 1988) и нарушение его метаболизма пагубно влияет на когнитивные процессы и синаптическую пластичность (Almaguer-Melian, 2000; Cruz et. al., 2003).
Возможен и несколько иной путь коррекции постстрессового нарушения ДП коменовой кислотой. Первичная вспышка ПОЛ влечет за собой мобилизацию симпато-адреномедуллярной и гипоталамо-гипофизо-кортикоадреналовой систем, а её подавление введением антиоксиданта неизбежно должно снижать продукцию медиаторов стресса - катехоламинов и глюкокортикоидов (Зозуля и др., 2004; Меерсон и др., 1980) и тем самым устранять или ослаблять их влияние на ДП.
С другой стороны, согласно недавним исследованиям, активные формы кислорода, включая перекиси, выполняют функции сигнальных молекул в механизмах индукции ДП, и при определенных концентрациях могут значительно увеличивать амплитуду ДП (Kamsler and Segal, 2003; Kamsler and Segal, 2004; Serrano and Klann, 2004). Возможно, подавление генерации активных форм кислорода при введении коменовой кислоты лежит в основе нормализации синаптической пластичности в условиях иммобилизационного и иммобилизационно-холодового стресса. Сходные пути коррекции антиоксидантами нарушений, вызванных возрастным окислительным стрессом или введением в желудочки мозга интерлейкина-lb, приводящих к увеличению свободных радикалов и, как следствие, снижению амплитуды ДП установлены и другими исследователями (Vereker et al., 2000; Watson et al., 2002). Так в работе Murray and Lynch (1998) показано, что возрастные изменения в гиппокампе старых крыс, в том числе нарушения ДП, вызванные окислительным стрессом можно полностью возвратить к норме с помощью такого антиоксиданта как а-токоферол. Также имеются данные о негативном влиянии окислительного стресса на синаптическую пластичнось и обучение и коррекции нарушения последних а-токоферолом (Wu et al. 2004). Этот же антиоксидант может способствовать индукции ДП в гиппокампе гвинейских свиней при избытке свободных радикалов, что характерно для стресса. Его действие при этом авторы связывают с предотвращением перекисного окисления липидов (Xie and Sastry,. 1993). Наряду с этим, указанными авторами установлено, что сам по себе недостаток а-токоферола может приводить к дефициту ДП (Xie and Sastry, 1995). Имеются данные о нормализующем влиянии а-линолиевой кислоты, обладающей антиоксидантными свойствами, на нарушенную в результате возрастного окислительного стресса ДП (McGahon et al., 1999). Приведённые нами исследования по роли антиоксидантов витамина Е и а-линолиевой кислоты в нормализации ПОЛ и ДП в гиппокампе говорят в пользу нашего утверждения о таком же действии коменовоЙ кислоты.
