Введение к работе
Актуальность проблемы. Понимание механизмов нормального и патологического поведения человека представляет собой одну из актуальных проблем современной нейробиологии и медицины. Тревожность и депрессия являются самыми распространенными среди психических расстройств и значительно снижают качество жизни (The European Health Report, 2005), а агрессивность лежит в основе резко нарастающего во всем мире асоциального и криминального поведения (World Report of Violence and Health, 2002).
Одной из ключевых и фундаментальных проблем нейробиологии является выявление пути от гена к поведению. Не вызывает сомнения ключевая роль в этом пути основных регуляторов поведения - нейромедиаторов мозга. Гены, вовлеченные в регуляцию синаптической передачи, в настоящее время рассматриваются как гены- кандидаты, обуславливающие наследственные особенности поведения.
Одним из классических медиаторов мозга, регулирующих различные виды поведения и физиологические процессы, является серотонин (5-НТ) (Попова и др., 1978; Jacobs, Fornal, 1995; Lucki, 1998). Поразительная полифункциональность серотонина обусловлена, прежде всего, наличием многочисленных рецепторов, опосредующих воздействие этого медиатора на нейроны (Saudou and Hen, 1994; Попова, Куликов, 2003).
В настоящее время идентифицировано 14 типов 5-НТ рецепторов, экспрессирующихся в мозге млекопитающих. Эти рецепторы были классифицированы в 7 типов, принадлежащих к двум суперсемействам (Saudou, Hen, 1994; Barnes, Sharp, 1999). Почти все 5-НТ рецепторы принадлежат к суперсемейству метаботропных рецепторов, реализующих свое действие через сопряженный G- белок, и только 5-НТ3 рецептор является ионотропным рецептором. Наиболее изученными являются 5-НТ1А рецепторы. Хорошо известна роль 5-НТ1А рецепторов в ауторегуляции активности серотониновых нейронов и секреции нейротрансмиттера (Barnes, Sharp, 1999). Имеются доказательства их участия в развитии депрессивных психозов (Maes, Meltzer, 1995), механизмах действия большинства известных антидепрессантов (Borsini, 1994; Blier, de Montigny, 1994) и анксиолитиков (De Vry et al., 1995; Handley, 1995). Имеется множество данных о вовлечении 5-НТ1А рецепторов в терморегуляцию (Hjorth, 1985; Goodwin et al., 1987), регуляцию сна (Попова и др., 1985; Августинович, 1987), агрессивного поведения (Olivier et al., 1995; de Boer et al., 1999; Pruus et al., 2000) и каталепсии (Kulikov et al., 1993; Neal-Beliveau et al., 1993).
Гораздо меньше сведений о роли 5-НТ2А рецепторов мозга. Показана связь 5- НТ2А рецепторов с механизмами психопатологии (Rajewska-Rager et al., 2008; Chen et al., 2009; Pandey et al., 2010; Rasmussen et al., 2010) и с чувствительностью к нейролептикам (Rasmussen et al., 1999). Выявлено участие 5-НТ2А рецепторов в регуляции половой мотивации (Popova, Amstislavskaya, 2002), питьевом поведении (Науменко и др., 2001) и каталепсии (Kulikov et al., 1995a; Popova, Kulikov, 1995). Практически ничего не известно о роли 5-НТ2А рецепторов в ауторегуляции серотониновой системы мозга.
Сведений о роли других 5-НТ рецепторов в ауторегуляции серотониновой системы мозга и регуляции поведения мало, а существующие результаты противоречивы. Отрывочны также сведения о функциональном взаимодействии разных типов рецепторов и оставалось практически неизвестным как сочетаются разные типы рецепторов в регуляции физиологических функций и поведения,
существует ли связь между рецепторами и генами, контролирующими серотониновую систему мозга. Так, не вызывает сомнения вовлечение серотонина в терморегуляцию, как фактора снижающего температуру тела, (Andersson et al., 1966), однако какими рецепторами опосредуется гипотермический эффект серотонина до сих пор оставалось неизвестным. Имеется несколько противоречивых работ, свидетельствующих о возможном влиянии 5-НТ3 и 5-НТ7 рецепторов на температуру тела (Mazzola-Pomietto, 1995; Kandasamy, 1997; Martin et al., 2000; Guscott et al., 2003; Hedlung et al., 2003). Достоверно показана только роль 5-НТ1А рецепторов в механизмах терморегуляции (Hjorth, 1985; Goodwin et al., 1987; Overstreet et al., 1996). В то же время практически ничего не известно о вовлечении 5-НТ1А рецепторов в механизмы естественной гипотермии млекопитающих.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было изучение роли 5-НТ рецепторов, функциональных межрецепторных взаимодействий и рецептор-зависимой регуляции экспрессии ключевых генов серотониновой системы мозга в ауторегуляции 5-НТ системы мозга, терморегуляции и регуляции поведения.
В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:
-
Исследовать участие 5-НТ рецепторов в процессах ауторегуляции 5-НТ системы мозга и выявить, существуют ли функциональные взаимодействия между 5-НТ рецепторами и ключевыми генами 5-НТ системы мозга;
-
Изучить участие 5-НТ1А, 5-НТ3 и 5-НТ7 рецепторов в механизмах терморегуляции;
-
Исследовать участие 5-НТ1А рецепторов в механизмах сопровождающейся глубокой гипотермией зимней спячки;
-
Изучить участие 5-НТ рецепторов в генетической предрасположенности к альтернативным видам защитного поведения - каталепсии и защитно- оборонительной агрессии;
-
Исследовать роль 5-НТ системы мозга в антидепрессивном эффекте BDNF.
Научная новизна работы. Впервые определена последовательность нуклеотидов фрагмента гена, кодирующего 5-НТ1А рецептор в мозге зимоспящих сусликов и обнаружена уникальная трехнуклеотидная инсерция, соответствующая вставке аминокислоты глицин в третью цитоплазматическую петлю 5-НТ1А рецептора, отличающая зимоспящих сусликов от незимоспящих животных (собака, лошадь, горилла, макака, кролик, шимпанзе, орангутанг, тупайа, волк, бык, мышь, крыса, свинья, человек (Ensembl Genome Browser, ; EMBL-EBI Database, )). Показано участие 5-НТ1А рецепторов в механизмах сопровождающейся глубокой гипотермией зимней спячки сусликов.
Впервые показано, что селекция на пониженную агрессивность по отношению к человеку сопровождается повышением функциональной активности 5-НТ1А и 5- НТ2С рецепторов и экспрессии 5-НТ1А и 5-НТ2С генов.
Впервые выявлена связь между генетической предрасположенностью к каталепсии с повышением функциональной активности 5-НТ1А рецепторов и снижением функциональной активности 5-НТ2А рецепторов, сочетающимся со снижением экспрессии 5-НТ2А гена. Установлено участие 5-НТ1А рецепторов в антикаталептическом эффекте 5-НТ2А агонистов.
Впервые установлено, что наряду с 5-НТ1А рецепторами в механизмах терморегуляции участвуют 5-НТ3 и 5-НТ7 рецепторы мозга, вызывая глубокую и продолжительную гипотермию. Обнаружено, что 5-НТ1А рецепторы принимают участие в вызываемой активацией центральных 5-НТ3 рецепторов гипотермический реакции, тогда как гипотермический эффект активации центральных 5-НТ7
рецепторов не зависит от 5-НТіА или 5-НТ3 рецепторов. Выявлено, что гипотермический эффект активации центральных 5-НТ3 рецепторов опосредуется как снижением теплопродукции, так и повышением теплоотдачи, тогда как гипотермический эффект активации 5-НТ1А рецепторов связан только со снижением теплопродукции.
Впервые обнаружено, что ключевой фермент биосинтеза серотонина триптофангидроксилаза-2 (ТПГ-2) и серотониновые 5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторы и кодирующие их гены играют существенную роль в ауторегуляции 5-НТ системы мозга.
Впервые in vivo показано участие селективного сайленсера гена 5-НТ1А рецепторов Freud-1 в ауторегуляции 5-НТ системы мозга.
Впервые обнаружено, что центральное введение нейротрофического фактора мозга (BDNF) подавляет выраженность генетически детерминированного депрессивно-подобного поведения, вызывая повышение функциональной активности 5-НТ2А рецепторов и экспрессии генов, кодирующих 5-НТ2А рецептор и ТПГ-2.
Впервые показано существование гомологических и гетерологических функциональных взаимодействий между 5-НТ рецепторами мозга. Обнаружена возможность рецептор-зависимой регуляции экспрессии генов в серотониновой системе мозга. Показана роль этих процессов в компенсаторных механизмах, направленных на минимизацию поведенческих отклонений при нарушении функции одного из звеньев 5-НТ системы мозга.
Теоретическая значимость работы. Одно из основных достижений проведенного исследования - выявление функциональных взаимодействий различных типов 5-НТ рецепторов друг с другом и обнаружение рецептор- зависимой регуляции экспрессии генов в серотониновой системе мозга, а так же доказательство роли этих процессов в ауторегуляции функциональной активности серотониновой системы мозга, терморегуляции и регуляции поведения. Показано существование гомологических (в пределах одной рецепторной системы) и гетерологических (с вовлечением разных рецепторных систем) функциональных взаимодействий между различными типами 5-НТ рецепторов. Обнаружена возможность рецептор-зависимой регуляции экспрессии генов в серотониновой системе мозга. Разработана концепция сети функциональных межрецепторных взаимодействий как основы регуляции функциональной активности серотониновой системы мозга и ее пластичности.
Показано, что генетическая предрасположенность к альтернативным видам защитного поведения характеризуется противоположными изменениями функциональной активности 5-НТ1А рецепторов: вызванная страхом агрессия связана со снижением, а реакция замирания - повышением функциональной активности 5-НТ1А рецепторов. Установлено участие 5-НТ2А рецепторов в ингибировании реакции замирания.
Показано участие 5-НТ1А рецепторов в механизмах зимней спячки и ассоциированной с ней глубокой гипотермией; выявлены особенности в первичной структуре гена 5-НТ1А рецепторов у зимоспящих сусликов.
Установлено участие единственного среди 5-НТ рецепторов ионотропного рецептора 5-НТ3 типа в механизмах терморегуляции и выявлена его функциональная связь с 5-НТ1А рецептором. Показано, что выраженный гипотермический эффект агониста 5-НТ3 рецепторов опосредуется как снижением теплопродукции, так и повышением теплоотдачи, тогда как гипотермический эффект агониста 5-НТіА рецепторов связан только со снижением теплопродукции.
Впервые установлена функциональная значимость центральных 5-НТ7 рецепторов мозга в механизмах терморегуляции.
Показано участие транскрипционного фактора Freud-1 в ауторегуляции 5-НТ системы мозга при десенситизации 5-НТ1А рецепторов, вызванной их хронической активацией.
На модели депрессивно-подобного поведения установлено, что гены 5-НТ2А рецепторов и ТПГ-2 участвуют в антидепрессивном эффекте BDNF.
Практическая значимость работы. В ходе работы усовершенствован метод количественного определения экспрессии генов, в том числе не содержащих интронов (Науменко, Куликов, 2006; Naumenko et al., 2008).
Установлено, что стимуляция центральных 5-НТ1А, 5-НТ3 и 5-НТ7 рецепторов вызывает глубокую гипотермию, что привлекает внимание к проникающим через гематоэнцефалический барьер агонистам этих рецепторов как к перспективным препаратам для создания искусственной гипотермии.
Доказана селективность широко используемого в фармакологических экспериментах 8-ОН-ОРАТ в отношении 5-НТ1А рецепторов, но не 5-НТ7 рецепторов, что представляет интерес в связи с постоянно высказываемыми в литературе сомнениями относительно селективности этого препарата.
Впервые установлено, что агонисты 5-НТ3 и 5-НТ7 рецепторов не проникают через гематоэнцефалический барьер и, следовательно, непригодны при энтеральном и парэнтеральном введении для исследования функции центральных 5-НТ3 и 5-НТ7 рецепторов.
Показана роль нейротрофического фактора мозга (BDNF) в подавлении выраженности генетически детерминированного депрессивно-подобного поведения и выявлена роль 5-НТ системы мозга в антидепрессантном эффекте BDNF, что может найти применение при создании антидепрессантов нового поколения.
Положения, выносимые на защиту.
Регуляция серотонин-зависимого поведения, физиологических функций и ауторегуляция серотониновой системы мозга осуществляется посредством сложной сети рецепторов, функционально связанных между собой, в том числе, и с вовлечением транскрипционных механизмов.
Селекция на противоположные виды защитно-оборонительного поведения сопровождается изменением разных подтипов 5-НТ2 рецепторов: агрессия, вызванная страхом, сопровождается снижением функционального состояния 5-НТ2С рецепторов, а генетическая предрасположенность к каталепсии - снижением функциональной активности 5-НТ2А рецепторов. Сниженная агрессивность, вызванная страхом, связана с повышением функциональной активности 5-НТ1А рецепторов. В регуляции каталепсии выявлено совместное действие 5-НТ2А и 5-НТ1А рецепторов: 5-НТ2А рецепторы ингибируют реакцию замирания посредством активации 5-НТ1А рецепторов.
5-НТ1А рецепторы вовлечены в регуляцию зимней спячки и ассоциированной с ней глубокой гипотермии. Транскрипционная регуляция 5-НТ1А рецепторов играет существенную роль в механизмах зимней спячки. Структура гена 5-НТ1А рецепторов зимоспящих сусликов отличается от структуры гена 5-НТ1А рецепторов незимоспящих животных трехнуклеотидной инсерцией, соответствующей вставке аминокислоты глицин в третью цитоплазматическую петлю 5-НТ1А рецептора.
Активация трех типов 5-НТ рецепторов (5-НТ1А, 5-НТ3 и 5-НТ7) вызывает гипотермический ответ, что указывает на важную роль серотониновой системы мозга в механизмах эволюционно-закрепленной приспособленности к жизни в жарком климате. Глубокий и продолжительный эффект активации 5-НТ3 рецепторов, обусловлен как снижением теплопродукции, так и повышением теплоотдачи, тогда как значительно более слабый гипотермический эффект активации 5-НТ1А рецепторов связан только со снижением теплопродукции.
5-НТ1А и 5-НТ2А рецепторы играют существенную роль в ауторегуляции серотониновой системы мозга. Показано существование гомологических и гетерологических функциональных взаимодействий между различными типами 5- НТ рецепторов. Обнаружена возможность рецептор-зависимой регуляции экспрессии генов в серотониновой системе мозга. Эти процессы играют существенную роль в компенсаторных механизмах, направленных на минимизацию поведенческих отклонений при нарушении функции одного из звеньев 5-НТ системы мозга.
Транскрипционный фактор Freud-і участвует в ауторегуляции 5-НТ системы мозга, активируясь при хронической стимуляции 5-НТ1А рецепторов, ведущей к их десенситизации.
Наиболее универсальным серотониновым рецептором является 5-НТ1А рецептор. Этот тип 5-НТ рецепторов вовлечен в механизмы регуляции всех изученных видов поведения, терморегуляцию и ауторегуляцию серотониновой системы мозга.
Центральное введение нейротрофического фактора мозга (BDNF) подавляет выраженность депрессивно-подобного поведения. У мышей с генетической предрасположенностью к депрессивно-подобному поведению, введение BDNF вызывает изменения в экспрессии генов 5-НТ2А рецепторов и ТПГ-2.
Апробация результатов. Результаты данной работы были представлены и обсуждены на Ученых Сессиях Института цитологии и генетики в 2008 и 2010 годах; конференции, посвященной академику Д.К. Беляеву (Новосибирск, 2007); конференции, посвященной академику М.А. Лаврентьеву (Новосибирск, 2007); VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008); конференции «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (Санкт-Петербург, 2008); EHRLICH II -World Conference on Magic Bullets (Nurnberg, Germany, 2008); Международном Междисциплинарном Симпозиуме «От Экспериментальной Биологии к Превентивной и Интегративной Медицине» (Судак, Украина, 2008); 11th Annual Meeting of the International Behavioural and Neural Genetics Society (Dresden, Germany, 2009); 9th International Congress of the Polish Neuroscience Society (Warsaw, Poland, 2009); BIT's 1st Annual Neuro Talk. (Singapore. Singapore. 2010); 7th Forum of European Neuroscience (Amsterdam, Netherlands, 2010); Первой международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2010); XXI Российском Физиологическом съезде им. И.П. Павлова (Калуга, 2010); VII Съезде Казахского физиологического общества (Алматы, Казахстан, 2011); Пятой Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно- приспособительных процессов» (Новосибирск, 2011); 13th Annual Meeting of the International Behavioural and Neural Genetics Society (Rome, Italy, 2011); III Съезде Физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 27 работ, из них 26 статей в рецензируемых отечественных (14) и международных (12) журналах и 1 глава в зарубежной монографии.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (430 наименования). Работа изложена на 205 страницах, содержит 55 рисунков и 15 таблиц.
