Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Современные представления о серотониновых рецепторах мозга и их участии в регуляции генетически детерминированного защитного поведения 12
1.1. Семейство серотониновых рецепторов 14
1.1.1. 5-НТ] рецепторы 17
1.1.2. 5-НТ2 рецепторы 18
1.1.3. 5-НТ3 рецепторы 19
1.1.4. 5-НТ4 рецепторы 20
1.1.5. 5-ht5 и 5-ht6 рецепторы 20
1.1.6. 5-НТ7 рецепторы 21
1.2. Генетический контроль 5-НТы рецептора 22
1.2.1. Структура гена и кодируемого им рецептора 23
1.2.2. Методы исследования гена и рецептора 28
1.2.2.1 Методы измерения уровня мРНК 28
1.2.2.2 Методы контроля влияния геномной ДНК на амплификацию 33
1.2.2.3. ОТ-ПЦР 5-НТ 1Арецепторов 34
1.2.2.4. Методы исследования 5-НТ)Арецепторов 35
1.3. 5-НТ 1А рецепторы в регуляции защитного поведения 36
1.3.1. Защитное поведение 38
1.3.2. Межсамцовая агрессия 40
1.3.3. Агрессия, направленная на человека 43
1.3.4. Реакция замирания (каталепсия) 45
1.3.5. Зимняя спячка 48
Глава 2. Материалы и методы 54
2.1. Животные 54
2.2. Определение функциональной активности 5-НТiA рецепторов 57
2.3. Определение экспрессии гена, кодирующего 5-HTjА рецептор 60
2.3.1. Реактивы 60
2.3.2. Праймеры 60
2.3.3. Стандарты 63
2.3.4. Выделение общей РНК 64
2.3.5. Проверка общей РНК на присутствие геномной ДНК 64
2.3.6. Обратная транскрипция 65
2.3.7. Полимеразная цепная реакция 65
2.3.8. Проверка кДНК на присутствие геномной ДНК 66
2.3.9. Рестрикционный анализ 67
2.3.10. Электрофорез 67
2.4. Определение нуклеотидной последовательности методом Сэнгера 68
2.4.1. Очистка ДНК при помощи гель-фильтрации на колонках 69
2.4.2. Очистка продуктов ПЦР и реакции Сэнгера переосаждением изопропанолом 69
2.5. Статистическая обработка данных 70
Глава 3. Результаты исследования 71
3.1. Количественный метод определения экспрессии гена, кодирующего 5-НТ1А рецептор 71
3.1.1. Верификация праймеров, специфичных для гена 5-HTIA рецептора 71
3.1.2. Содержание геномной ДНК в образцах общей РНК и в образцах кДНК 73
3.1.3. Доказательства адекватности разработанного метода 75
3.2. Функциональная активность 5-HTJA рецепторов и экспрессия их гена у высокоагрессивных и неагрессивных животных 78
3.2.1. Крысы-пасюки, селекционированные на высокую агрессивность по отношению к человеку (defensive aggression) и ее отсутствие 78
3.2.2. Мыши с генетическим нокаутом моноаминоксидазы A: offensive aggression 83
3.3. Функциональная активность 5-HTjA рецепторов и экспрессия их гена у мышей, селекционированных на высокую предрасположенность к каталепсии 86
3.4. Экспрессия гена 5-НТ1А рецептора в структурах мозга сусликов, находящихся в разных периодах цикла сон-бодрствование 89
Глава 4. Обсуждение 94
Выводы 109
Список цитируемой литературы 111
- Методы контроля влияния геномной ДНК на амплификацию
- Определение функциональной активности 5-НТiA рецепторов
- Доказательства адекватности разработанного метода
- Мыши с генетическим нокаутом моноаминоксидазы A: offensive aggression
Введение к работе
Актуальность проблемы. Понимание механизмов нормального и патологического поведения человека представляет собой одну из актуальных проблем современной нейробиологии и медицины. Тревожность и депрессия являются самыми распространенными среди психических расстройств человека и значительно снижают качество жизни (The European Health Report, 2005), а агрессивность лежит в основе асоциального и криминального поведения (World Report of Violence and Health, 2002). Механизмы и патогенез этих психоэмоциональных и поведенческих отклонений недостаточно изучены.
Важную роль в исследовании этой проблемы могут сыграть экспериментальные модели на животных, так как считается, что элементы поведения животных могут частично моделировать соответствующие психопатологии человека. Кроме того, известно, что тревожность, агрессивность и депрессия тесно связаны с некоторыми видами защитного поведения животных (Dixon, 1998).
Защитное поведение представляет собой комплекс эволюционно закрепленных врожденных реакций на неодушевленные и одушевленные угрожающие стимулы внешней среды (Попова, 1997; Popova, 1999). Первые включают такие стимулы как резкий звук, свет, запах, экстремальные перепады температуры. Зимняя спячка некоторых видов животных и сопровождающая ее глубокая гипотермия являются эволюционно закрепленным, адаптивным видом защитного поведения, проявляющимся в ответ на резкое падение температуры (Попова, 1997; Popova, 1999). Вторые сигнализируют о приближении хищника или особи того же вида, конкурирующей за самку, территорию или пищу и могут вызывать альтернативные виды защитного поведения - агрессию и реакцию замирания (каталепсию). Среди различных форм агрессивного поведения (Моуег, 1968; Maxson,2000) наибольший интерес вызывают агрессия нападения, или межсамцовая агрессия (offensive aggression), и агрессия, вызванная страхом, или защитно-оборонительная агрессия (defensive aggression; Maxson, 2000). Каталепсия, представляющая собой состояние длительной обездвиженности с пластическим тонусом мускулатуры, привлекает внимание исследователей еще и потому, что наблюдается у человека при некоторых тяжелых формах нервных и психических патологий (Sanberg et al., 1988; Singerman, Raheja, 1994) или как негативный эффект лечения нейролептиками (Fricchione, 1985).
Все виды защитного поведения находятся под контролем генетических факторов, что убедительно доказывают эксперименты по селекции: 1) на повышенную или сниженную агрессивность мышей (Lagerspetz, Lagerspetz, 1971; Ciaranello et al., 1974), крыс (Беляев, Бородин, 1982; Plyusnina, Oskina, 1997) и серебристо-черных лисиц (Трут, 1969); 2) на повышенную предрасположенность крыс к реакции замирания - каталепсии (Барыкина и др., 1983).
Одним из основных факторов, посредством которых осуществляется физиологический контроль генетически детерминированного защитного поведения, является важнейший медиатор мозга - серотонин (5-НТ). Имеется множество литературных данных, свидетельствующих о существенной роли 5-НТ в регуляции разнообразных физиологических процессов и многих форм поведения (Попова и др., 1978; Jacobs, Fornal, 1995; Lucki, 1998). Поразительная полифункциональность серотонина обусловлена прежде всего наличием многочисленных рецепторов, опосредующих воздействие этого медиатора на нейроны (Saudou and Hen, 1994; Попова, Куликов, 2003). К настоящему времени с помощью молекулярно-биологических методов выявлено 14 различных серотониновых рецепторов, экспрессирующихся в мозге млекопитающих.
Эти рецепторы были классифицированы в 7 типов, принадлежащих к двум суперсемействам (Saudou, Hen, 1994; Barnes, Sharp, 1999).
Среди такого огромного разнообразия рецепторов 5-HTiA подтип играет ключевую роль в ауторегуляции активности серотониновых нейронов и секреции нейротрансмиттера и, следовательно, вовлечен в регуляцию всех форм поведения и психических процессов, контролируемых серотонином (Barnes, Sharp, 1999). Более того, имеются многочисленные доказательства участия 5-HTiA рецепторов в механизме депрессивных психозов (Maes, Meltzer, 1995) и действия большинства известных антидепрессантов (Borsini, 1994; Blier, de Montigny, 1994) и анксиолитиков (De Vry et al., 1991; Handley, 1995).
Имеется множество данных о вовлечении 5-НТ1А рецепторов в терморегуляцию (Hjorth, 1985; Goodwin et al., 1987), регуляцию сна (Попова и др., 1985; Августинович, 1987), агрессивного поведения (Olivier et al., 1995; de Boer et al., 1998; Pruus et al.,2000) и каталепсии (Kulikov et al., 1993; Neal-Beliveau et al., 1993).
Однако большинство существующих работ проведены с помощью фармакологических методов и позволяют делать выводы только о вовлечении 5-HTia рецепторов в регуляцию вышеперечисленных типов защитного поведения. Имеется очень мало данных о роли этих рецепторов в генетическом контроле разных видов защитного поведения и ничего не известно об экспрессии гена 5-HTiA рецептора при различных генетически детерминированных видах защитного поведения. Кроме того, до сих пор не установлено, существует ли прямая зависимость между плотностью, функциональной активностью рецепторов и экспрессией кодирующего их гена.
Цель настоящего исследования: используя уникальные генетические модели межсамцовой агрессии, агрессии по отношению к человеку, каталепсии и зимней спячки, выяснить, какова роль 5-НТ]А рецепторов в регуляции этих форм поведения и существует ли связь функциональной активности и плотности рецепторов 1А подтипа с интенсивностью экспрессии кодирующего их гена.
Научная новизна работы
В настоящей работе впервые:
Разработан и верифицирован новый метод количественного определения уровня мРНК 5-HTia рецептора в мозге. Модифицирован метод определения примесей геномной ДНК в образцах общей РНК и создан метод количественного определения примесей геномной ДНК в образцах кДНК.
Показано, что функциональная активность 5-HTiA рецепторов в мозге крыс-пасюков при селекции на повышенную агрессию по отношению к человеку (defensive aggression) снижается на фоне понижения уровня мРНК 5-HTia рецептора в среднем мозге.
Выявлено падение чувствительности 5-HTja рецепторов в мозге высокоагрессивных мышей (offensive aggression) с генетическим нокаутом МАО А (линия Tg8) при повышенном уровне мРНК 5-НТ1А рецептора во фронтальной коре и миндалевидном комплексе.
Показано, что реакция замирания, являющаяся противоположным агрессивному поведению видом защитной реакции, характеризуется противоположными изменениями функциональной активности 5-НТ]А рецепторов: генетически детерминированная каталепсия связана с повышением чувствительности 5-HTia рецепторов на фоне снижения уровня мРНК.
Определена последовательность нуклеотидов фрагмента гена, кодирующего 5-HTia рецептор в мозге зимоспящих сусликов, и показана его гомология с генами, кодирующими 5-НТ)А рецептор в мозге крысы, мыши и человека.
Показано участие 5-HTiA рецепторов в механизмах зимней спячки сусликов. Обнаружено, что погружение в зимнюю спячку связано с повышением уровня мРНК 5-HTia рецептора в гиппокампе, в то время как состояние зимней спячки характеризуется относительно высоким уровнем мРНК 5-HTiA рецептора в среднем мозге. Пробуждение сопровождается повышением уровня мРНК 5-HTja рецептора в гиппокампе и снижением в среднем мозге.
Показано, что регуляция состояния 5-НТіа рецепторной системы в мозге животных с различными генетически детерминированными видами защитного поведения может осуществляться как на посттранскрипционном уровне, так и на уровне транскрипции.
Теоретическая и научно-практическая ценность работы.
Полученные в настоящей работе данные расширяют представления о механизмах, лежащих в основе развития различных видов генетически детерминированного защитного поведения, таких как агрессивность, каталепсия, зимняя спячка и сопряженная с ней гипотермия. Выявленные особенности регуляции экспрессии гена 5-HTia рецептора на моделях животных с генетической предрасположенностью к тому или иному виду оборонительных реакций могут быть полезны для разработки фармакологических агентов, направленных на модуляцию агрессивности, тревожности, депрессии и нарушений сна у человека.
Разработан более простой, чем существовавшие, метод количественного определения экспрессии генов, в том числе не содержащих интронов. Модифицирован метод определения загрязнения образцов общей РНК геномной ДНК и создан метод оценки примесей геномной ДНК в образцах кДНК, позволяющий оценивать влияние загрязнения на количественное определение экспрессии гена.
Положения, выносимые на защиту
Серотониновые 5-HTia рецепторы мозга вовлечены в регуляцию защитного поведения: агрессивного поведения (offensive и defensive aggression), каталепсии и зимней спячки.
Селекция крыс на повышенную агрессивность, вызванную страхом (defensive aggression), приводит к снижению функциональной активности 5-HTjA рецепторов на фоне снижения в среднем мозге уровня мРНК 5-HTia рецептора.
Генетически детерминированная агрессия нападения (offensive aggression) у мышей связана со снижением чувствительности 5-НТ]А рецепторов при повышении уровня мРНК 5-HTia рецептора во фронтальной коре и миндалевидном комплексе.
Реакция замирания, являющаяся противоположным агрессивному поведению видом защитной реакции, характеризуется противоположными изменениями функциональной активности 5-НТ|А рецепторов: генетически детерминированная каталепсия у мышей связана с повышением чувствительности 5-НТ]А рецепторов на фоне снижения уровня мРНК 5-HTiA рецептора.
В различные фазы годового цикла происходят существенные изменения состояния 5-НТіА рецепторной системы в различных структурах мозга зимоспящих сусликов. Погружение в зимнюю спячку и пробуждение связано с повышением уровня мРНК 5-НТ1А рецептора в гиппокампе. Состояние зимней спячки связано с относительно высоким уровнем мРНК 5-HTjA рецептора в среднем мозге, в то время как пробуждение связано со снижением уровня мРНК рецептора в этой структуре.
Регуляция состояния 5-HTiA рецепторной системы в мозге животных с различными генетически детерминированными видами защитного поведения может осуществляться как на посттранскрипционном уровне, так и на уровне транскрипции.
Апробация результатов. Полученные данные были представлены и обсуждены на отчетной сессии Института цитологии и генетики в 2006 году, на XLI международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2003), на 8-й мультидисциплинароной международной конференции по биологической психиатрии «Стресс и поведение» (Санкт-Петербург, 2004), на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на XLII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2004), на XLIII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2005), на международной конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты (Москва, 2005), на V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005), на международной летней школе по нейрогенетике поведения (Москва, 2005).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, из них 6 статей в рецензируемых отечественных (3) и международных (3) журналах.
Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и список цитируемой литературы (229 наименований). Работа изложена на 137 страницах, содержит 19 рисунков и 4 таблицы.
Методы контроля влияния геномной ДНК на амплификацию
Отсутствие высокочувствительного количественного метода определения уровня мРНК - не единственная проблема, ограничивающая применение ОТ-ПЦР. Загрязнение мРНК геномной ДНК - другой существенный фактор, ограничивающий применение ОТ-ПЦР метода в нейробиологии.
Основным способом избежать влияния геномной ДНК на определение уровня мРНК является использование для ПЦР пары праймеров, специфически отжигающихся на двух экзонах исследуемого гена, разделённых интроном, достаточно большим, чтобы, в силу ограниченности времени элонгации, амплификация фрагментов с геномной ДНК не происходила (Zamorano et al., 1996). Однако такой подход, к сожалению, не может быть использован при изучении экспрессии генов, не содержащих интронов. Спектр таких генов достаточно широк - это и 5HTJA рецепторы, и aj, Pi и р2 адренэргические рецепторы, играющие ключевую роль в передаче сигналов в мозге и, следовательно, представляющие собой весьма интересные объекты для изучения. Для контроля чистоты РНК обычно используют ПЦР образцов общей РНК с праймерами для какого-нибудь гена, чаще гена домашнего хозяйства. Однако для определения влияния геномной ДНК на ПЦР и, как следствие, уменьшения ошибки при исследовании экспрессии генов необходимо точное определение количества геномной ДНК в образцах кДНК.
Для очистки образцов РНК от геномной ДНК используют ДНКазы без РНКазной активности. Это наиболее эффективный метод. Однако даже небольшие количества ДНК, оставшиеся после обработки ДНКазой, могут оказать существенное влияние на амплификацию, что недопустимо при исследовании редких транскриптов (Matthews et al., 2002). Поэтому необходим метод количественной оценки загрязнения не только образцов РНК, но и образцов кДНК. Такого метода до настоящего времени разработано не было. при помощи качественной ПЦР (Day et al.,2002; Chidlow et al.,2003). Имеются также исследования, в которых экспрессию гена 5-HTiA рецептора определяли при помощи полуколичественной ОТ-ПЦР (коамплификации) с использованием внутреннего эндогенного стандарта (Burnet et al., 1994; Garcia-Osta et al.,2000; Yamada et al.,2002). Существует только одна работа, в которой уровень мРНК 5-НТ1А рецептора был определен при помощи конкурентной (количественной) ОТ-ПЦР с использованием внутреннего экзогенного стандарта известной концентрации (Li et al., 2000). Также существует единственная работа, в которой экспрессия гена 5-HTiA рецептора была определена при помощи ОТ-ПЦР реального времени (realime) с флуоресцирующей пробой Taq-Мап и мРНК бета-актина в качестве внутреннего стандарта (Anseloni et al., 2005). Очевидно, что применение данного метода сильно ограничено по финансовым соображениям.
Таким образом, несмотря на огромную роль, которую ген 5-НТ1А рецептора играет в регуляции поведения, психических и других процессов в ЦНС, для изучения его экспрессии все еще в основном используют качественную или полуколичественную ОТ-ПЦР. Предложенный в единственной работе метод конкурентной ОТ-ПЦР для определения уровня экспрессии гена рецептора технически слишком сложен для большинства физиологических и нейробиологических лабораторий, а предложенный метод ОТ-ПЦР реального времени требует значительных финансовых затрат. Более того, не разработан надежный и верифицированный метод количественного учета загрязнения образцов кДНК геномной ДНК, что также ограничивает использование количественной ОТ-ПЦР для определения числа копий мРНК 5-НТ1А рецептора в мозге.
Методы исследования 5-НТ1А рецепторов Однако изучение особенностей экспрессии гена 5-HTiA рецептора не является единственным направлением исследования. Наличие большого количества селективных лигандов позволяет изучать особенности самого рецептора, такие как плотность и чувствительность (функциональная активность). Эти параметры являются наиболее значимыми, поскольку отражают эффективность трансдукции сигнала. Плотность рецепторов 1А подтипа определяют при помощи радиолигандного специфического рецепторного связывания. Для данного метода обычно используют меченый агонист 5-HT]A рецепторов - [3Н]8-ОН-ДПАТ. Лиганд добавляют к суспензии клеточных мембран и инкубируют в условиях, обеспечивающих связывание. Затем полученную смесь фильтруют через стекловолоконный фильтр, который помещают в раствор сцинтиллятора. По количеству радиоактивного излучения судят о количестве рецепторов, локализованных на клеточных мембранах. Для учета неспецифического связывания радиоактивного лиганда, например с 5-НТ7 рецепторами, которые связывают 8-ОН-ДПАТ с меньшим сродством, в отдельную пробу добавляют, наряду с [3Н] 8-ОН-ДПАТ, немеченый селективный агонист 5-HTIA рецепторов, вытесняющий радиоактивную метку. Результаты корректируются с учетом фонового счета, определенного по этой пробе (Popovaetal.,1998).
Наряду с плотностью, исследуют также функциональную активность (чувствительность) рецепторов. Как показывают исследования, эти параметры очень часто находятся в прямой зависимости, отражая состояние активных, способных к связыванию рецепторов. Для исследования чувствительности рецепторов также используют селективные агонисты 5-НТ]А рецепторов. Наиболее часто применяемым тестом на функциональную активность рецепторов является определение выраженности гипотермической реакции, индуцируемой их селективными агонистами (Overstreet et al., 1996). Поскольку 5-НТ7 тип серотониновых рецепторов, с которым может связываться 8-ОН-ДПАТ, не учувствует в терморегуляции (Hjorth, 1985; Maj et al., 1987; Goodwin et al., 1987), этот агонист широко применяется для исследования чувствительности рецепторов 1А подтипа.
Еще одним тестом на функциональную активность 5-НТ]А рецепторов является выраженность сокращения нижней губы (Lower Lip Retraction, LLR), вызываемого агонистами рецептора 1А подтипа (Berensen, Broekkamp, 1991). Однако этот тест видоспецифичен и может быть применен только для исследования чувствительности рецепторов в мозге крыс.
Определение функциональной активности 5-НТiA рецепторов
В качестве внешнего экзогенного стандарта для контроля ПЦР была использована геномная ДНК, выделенная из ядер гепатоцитов самца мыши C57BL/6 по модифицированному методу, предложенному Moisan с соавторами (Moisan et al., 1996). Выделенная ДНК была разведена стерильной водой до концентрации 100 нг/мкл и хранилась при -20С. Поскольку размер генома мыши равен 2.493x109 п.н. (Mouse Genome Informatics, http://www.informatics.iax.org ), что соответствует примерно 5 пг, использовались ДНК-стандарты, содержащие 2500, 1000, 660 и 500 копий изучаемых генов в 1 мкл (для бета-актина, Г-З-ФД, 5HT]A рецепторов и триптофангидроксилазы-1, соответственно; Kulikov et al., 2005). Очевидно, что продукт амплификации геномной ДНК в качестве стандарта для ПЦР 5-HTiA рецепторов имеет тот же размер, что и амплифицированный по матрице кДНК, поэтому геномную ДНК нельзя использовать в качестве внутреннего стандарта. Вследствие этого, амплификацию стандарта проводили в отдельной пробирке, в качестве внешнего стандарта.
Для исследования экспрессии генов 5-HTiA рецептора и бета-актина в структурах мозга сусликов в качестве внешнего стандарта использовался ампликон, наработанный по матрице кДНК с помощью ПЦР с теми же праймерами, которые использовались в дальнейшем для определения уровня мРНК бета-актина и рецепторов. В предварительном эксперименте, при сравнении интенсивности флуоресценции маркера молекулярного веса (pBluescript/Msp I) известной концентрации с интенсивностью флуоресценции ампликона, было определено количество его копий в 1 мкл смеси. Кривые зависимости интенсивности флуоресценции ПЦР-продукта, наработанного с ампликона, от его начальной концентрации показали, что в качестве внешнего стандарта следует использовать аликвоты ампликона, содержащие 7240 копий/мкл для бета-актина и 450 копий/мкл для 5-HTiA рецептора. Помимо геномной ДНК в качестве внешнего стандарта, мы использовали мРНК бета-актина или Г-З-ФД в качестве внутреннего эндогенного стандарта для контроля реакции ОТ. Общая РНК была выделена фенолом, хлороформом и гуанидинтиоцианатом по Chomczynski, Sacchi (Chomczynski, Sacchi, 1987), обработана ДНКазой без РНКазной активности (1 ед. на пробу, 37С, 10 мин) и повторно экстрагирована фенолом и хлороформом (Куликов и др., 2004; Kulikov et al., 2005; Науменко, Куликов, 2006). Полученная РНК была разведена водой до концентрации 0.125 мкг/мкл и хранилась при -65С. Для разработки количественного метода определения уровня мРНК, для исследования экспрессии гена 5-HTiA рецептора у различных линий мышей, а также для разработки метода определения загрязнения образцов кДНК геномной ДНК, РНК была выделена двойной экстракцией гуанидинтиоцианатом, фенолом и хлороформом и обработана ДНКазой. Для разработки метода определения загрязнения образцов кДНК геномной ДНК, РНК была выделена тем же способом, но без обработки ДНКазой. Полученная РНК была проверена на наличие примесей геномной ДНК при помощи амплификации с праймерами для бета-актина (см. ниже). Аликвоту, содержащую 30 нг общей РНК, амплифицировали в течение 25 или 32 циклов в 20 мкл инкубационной смеси, содержащей 2 мкл буфера для ПЦР (60 ммоль Tris-HCl, 1.5 ммоль MgCb, 25 ммоль КС1, 10 ммоль 2-меркаптоэтанола, 0.1% Тритон Х-100), 1 мкл смеси dNTP (0.004 мкмоль каждого), 5 мкл смеси прямого и обратного праймера для бета-актина (250 пмоль каждого) и 1 ед. Taq полимеразы. Амплификацию проводили в амплификаторе Eppendorf Master Cycler (Germ.) в следующих условиях: 5 мин при 94С - 1 цикл; 40 сек при 94С, 40 сек при 61 С, 40 сек при 72С - 25-32 цикла; 4 мин при 72С - 1 цикл. Параллельно, в этих же условиях, проводили амплификацию стандарта, содержащего 12.5 нг (25 циклов) или 1 нг (32 цикла) геномной ДНК. 2.3.6. Обратная транскрипция Общая РНК (8 мкл, или 1 мкг) была смешана со 180 нг статистического праймера длиной 6 нуклеотидов (конечная концентрация праймера составила 5 мкМ) и 2.25 мкмолями стерильного КС1 в объёме 16 мкл, денатурирована при 94С в течение 5 мин на амплификаторе Hybaid Omn-E (UK), после чего был проведен отжиг при 41 С в течение 15 мин, затем было добавлено 15 мкл смеси, содержащей обратную транскриптазу M-MLV (200 ед.), Tris-HCl (рН=8.3, 0.225 мкмоль), смесь dNTP (0.015 мкмоль каждого), DTT (0.225 мкмоль) и МпС12 (0.03 мкмоль). Полученная смесь (конечным объёмом 31 мкл) была инкубирована при 41 С в течение 60 мин. Синтезированная кДНК хранилась при температуре -20С. 2.3.7. Полимеразная цепная реакция Аликвота кДНК объемом 1 мкл была смешана с 2 мкл буфера для ПЦР (60 ммоль Tris-HCl, 1.5 ммоль MgCl2, 25 ммоль КС1, 10 ммоль 2-меркаптоэтанола, 0.1% Тритон Х-100), 1 мкл смеси dNTP (0.004 мкмоль каждого), 5 мкл смеси соответствующего прямого и обратного праймера для 5-HTiA, бета-актина или Г-З-ФД (250 пмоль каждого), 1 ед. Taq полимеразы и доведена стерильной водой до конечного объёма 20 мкл. ПЦР была проведена на амплификаторе Eppendorf Master Cycler (Germ.) в следующих условиях: 5 мин при 94С - 1 цикл; 40 сек при 94С, 40 сек при соответствующей температуре отжига (табл. 3), 40 сек при 72С - 21 (для Г-З-ФД), 25 или 26 циклов (для бета актина мышей/крыс и сусликов, соответственно), 32 и 34 цикла для 5НТ)А рецепторов мышей/крыс и сусликов, соответственно; 4 мин при 72С - 1 цикл. Контрольные пробы, содержащие внешний экзогенный стандарт - 1 мкл геномной ДНК (12.5 нг/мкл для бета-актина, 5 нг/мкл для Г-З-ФД, и 3.3 нг/мкл для рецепторов) вместо кДНК и такую же смесь реагентов, были амплифицированы вместе с исследуемыми пробами. При исследовании экспрессии гена 5-НТід рецептора в структурах мозга сусликов в качестве внешнего стандарта использовался соответствующий ампликон в концентрации 7240 копий/мкл или 450 копий/мкл для бета-актина и 5-НТ!Л рецептора, соответственно.
Доказательства адекватности разработанного метода
Для доказательства адекватности разработанного метода были получены кривые зависимости интенсивности флуоресценции от количества циклов амплификации кДНК с праймерами, специфичными для генов 5-НТ1А рецептора, Г-З-ФД и бета-актина. Было показано, что в условиях, используемых в данной работе, участок экспоненциальной кривой линеен в пределах от 31 до 33 циклов для 5-НТ)Л рецепторов, от 20 до 22 циклов для Г-З-ФД и от 24 до 26 для бета-актина. Следовательно, 32, 21 и 25 циклов - это оптимальные условия, позволяющие с наименьшей ошибкой количественно определять уровень мРНК 5-НТА рецептора, Г-З-ФД и бета-актина, соответственно. Аналогичные кривые были получены и для внешнего стандарта -геномной ДНК. Обнаружено, что участок экспоненциальной кривой линеен в пределах от 30 до 33 циклов для 5-HTiA рецепторов, от 20 до 23 циклов для Г-З-ФД, от 24 до 26 для бета-актина и от 30 до 33 для tphl (Kulikov et al., 2005; Науменко, Куликов, 2006).
Кривая зависимости интенсивности флуоресценции ПЦР-продукта от количества амплифицируемой кДНК была получена при добавлении 2 мкл последовательно разбавленного раствора кДНК из гиппокампа мыши в ПЦР смесь. Было показано, что кривые линейны в пределах от 0.5 до 2 мкл для продуктов, полученных при использовании праймеров, специфичных для генов бета-актина, Г-З-ФД и 5-НТ)А рецептора.
Кривая зависимости интенсивности амплификации от начальной концентрации геномной ДНК получена при использовании последней вместо кДНК и амплификации в соответствующих для 5-HTiA рецептора, Г-З-ФД, бета-актина или tphl условиях. Обнаружено, что кривая линейна от 2 до 5 нг/мкл для 5-НТ]А рецептора, от 5 до 12.5 нг/мкл для Г-З-ФД от 10 до 25 нг/мкл для бета-актина и от 2 до 3.5 нг/мкл для tphl (Kulikov et al., 2005; Науменко, Куликов, 2006).
Для проверки воспроизводимости метода был проведен ряд экспериментов. Один и тот же образец кДНК был амплифицирован в десяти повторах. Было показано, что ошибка метода составляет от 5 до 8% для всех изучаемых продуктов, что укладывается в рамки ошибки пипетирования. Такая же погрешность присутствует и в других модификациях метода ОТ-ГЩР.
Обработка разных фотографий одного и того же агарозного геля с визуализированными ПЦР продуктами показала, что ошибка сканирования и оцифровывания составляет 10-12%.
В имеющихся немногочисленных исследованиях экспрессию гена 5-HTjA рецептора в головном мозге определяли полуколичественным методом, включающим коамплификацию в одной и той же пробирке фрагментов рецептора и одного из генов домашнего хозяйства (house keeping gene). Эффективность экспрессии гена 5-НТід рецептора оценивали по отношению интенсивности флуоресценции продуктов ПНР рецептора и гена домашнего хозяйства. Очевидно, что точность такого метода невелика и не позволяет определить количество копий кДНК рецептора. Кроме того, исходная концентрация кДНК 5-НТ]А рецептора значительно меньше, чем кДНК генов домашнего хозяйства (например, наиболее часто используемого бета-актина), и поэтому амплификация кДНК бета-актина будет полностью подавлять амплификацию кДНК рецептора. Действительно, амплификация фрагмента гена бета-актина выходит на плато на 27 цикле, тогда как для получения измеримых количеств продукта ПЦР 5-НТ]А рецептора необходимо как минимум 30 циклов (Рис. 8). Одним из способов решения этой проблемы может быть предварительная (перед добавлением праймеров для бета-актина) амплификация в течение 8 циклов с праймерами, специфичными для гена 5-HTIA рецептора (Куликов и др., 2002а; Куликов и др., 20026; Куликов и др., 2004), что еще сильнее уменьшает точность метода. Однако измерение количества внутреннего эндогенного стандарта в разработанном нами методе не осложнено, поскольку проводится в отдельном эксперименте, контролируемом при помощи соответствующего внешнего стандарта.
Наиболее доступная количественная методика определения экспрессии генов - конкурентная ОТ-ПЦР - для исследования экспрессии 5-HTIA рецептора в мозге мышей использовалась в работе Li с соавторами (Li et al., 2000). Однако предложенная авторами методика технически настолько сложна, что не может быть реализована в любой физиологической или нейробиологической лаборатории.
Существует также одна работа, в которой экспрессия гена 5-НТід рецептора была определена при помощи ОТ-ПЦР реального времени с флуорисцирующей пробой Taq-Man и мРНК бета-актина в качестве внутреннего стандарта (Anseloni et al., 2005). Очевидно, что применение данного метода сильно ограничено по финансовым соображениям.
Кроме того, ни в одной из опубликованных работ не была исследована степень загрязнения образцов кДНК геномной ДНК, что чрезвычайно важно при изучении экспрессии не содержащего интронов гена 5-HTiA рецептора.
Разработанный нами простой и удобный метод количественного определения экспрессии генов, в том числе и не содержащих интронов, позволил впервые исследовать уровень мРНК 5-HTiA рецепторов в структурах мозга животных с различными генетически детерминированными видами защитного поведения.
Мыши с генетическим нокаутом моноаминоксидазы A: offensive aggression
Для исследования участия 5-НТ]А рецепторов в регуляции еще одного эволюционно закрепленного, адаптивного вида защитного поведения -зимней спячки - прежде всего необходимо исследовать особенности регуляции и динамику изменения экспрессии гена рецептора в мозге зимоспящих животных, находящихся в различных фазах цикла сон-бодрствование. Общеизвестно, что для измерения экспрессии любого гена методом ОТ-ПЦР необходимо знать последовательность хотя бы небольшого фрагмента исследуемого гена, достаточного для разработки пары праймеров, специфически отжигающихся на смысловой (прямой праймер) и антисмысловой (обратный праймер) нитях ДНК. Кроме того, расстояние между праймерами (т.е. размер ПЦР-продукта) должно быть не менее 100 пар нуклеотидов, чтобы полученный ампликон можно было отделить с помощью электрофореза от праймер-димеров, всегда образующихся при амплификации и затрудняющих оценку интенсивности флуоресценции исследуемого ПЦР-продукта. Однако, как оказалось, ни ген 5-HTIA рецептора сусликов, ни даже какой-либо его фрагмент до сих пор не были идентифицированы. Более того, в ходе нашей работы ни в одной из доступных баз данных не было обнаружено последовательности нуклеотидов гена 5-HTiA рецептора ни для одного из наиболее близких к суслику видов, таких как сурки или белки. В связи с вышесказанным, первым этапом нашего исследования экспрессии гена, кодирующего 5-HTIA рецептор, в мозге зимоспящих сусликов, было секвенирование фрагмента этого гена и сопоставление полученной последовательности с известными последовательностями генов 5-HTIA рецептора крысы, мыши и человека, а также серотониновыми рецепторами других типов и прочими рецепторами.
Фрагмент гена, полученный согласно протоколу, описанному в пункте 2.3.10 и разделе 2.4 главы материалы и методы, был идентифицирован при помощи описанной там же реакции Сэнгера. Таким образом, впервые была определена последовательность нуклеотидов фрагмента гена, кодирующего 5-HTIA рецептор в мозге зимоспящих сусликов (Рис. 18).
Сравнение полученной последовательности нуклеотидов с имеющимися в базе данных (EMBL Nucleotide database) последовательностями гена 5-НТ)А рецептора других видов позволило выявить значительный процент гомологии между ними. Так, например, при сравнении участка полученной последовательности нуклеотидов, соответствующего пятому трансмембранному домену 5-НТ)А рецептора, было выявлено 93.6% гомологии с таким же участком нуклеотидной последовательности мыши и крысы, в то время как гомология с геном 5-HTIA рецептора человека составила 88.5%. Кроме того, при сравнении вышеуказанного фрагмента полученной последовательности нуклеотидов с аналогичными участками последовательностей, кодирующих другие серотониновые рецепторы (5-НТ1в, 5-НТ7, 5-НТш), было обнаружено порядка 70% гомологии.
На основании полученной последовательности была разработана пара праймеров (№4; табл. 3), специфичных к фрагменту 5-НТ]А гена сусликов.
При исследовании экспрессии гена были выявлены значительные структуроспецифичные изменения, происходящие в различные периоды цикла сон-бодрствование. Так, например, во фронтальной коре на протяжении всего цикла уровень мРНК 5-HTiA рецептора существенно не изменяется, в то время как в гиппокампе и среднем мозге в уровне мРНК 5-HTIA рецептора происходят значительные изменения во время впадения в спячку или пробуждения (Рис. 19).
