Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
Глава 1. РЕАЛИЗАЦИЯ ЭФФЕКТОВ ПРОЛАКТИНА В
КЛЕТОЧНЫХ ЭЛЕМЕНТАХ ПЕЧЕНИ (литературный обзор) 11
1.1. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ПЕЧЕНИ 11
Строение печени, ее клеточный состав 11
Физиологические функции печени. Участие различных клеточных элементов 13
Функции клеток печени при развитии некоторых патологических/компенсаторных состояний 17
Регенерация печени 17
Фиброгенез 18
Холестаз 18
1.2. ФУНКЦИИ ПРОЛАКТИНА 20
Общие положения 20
Секреция пролактина 20
Функции пролактина 21
Действие пролактина на отдельные клеточные элементы печени 22
Действие на гепатоциты 23
Действие на холангиоциты 24
1.3. РЕЦЕПТОРЫ ПРОЛАКТИНА И РЕАЛИЗАЦИЯ ЕГО ЭФФЕКТОВ 25
Особенности строения рецептора пролактина 25
Строение гена рецептора пролактина и его транскрипция 26
Сравнительный анализ изоформ рецептора пролактина млекопитающих. Механизмы образования 27
1.3.4. Механизм действия пролактина через собственные рецепторы 31
1.3.4.1. Димеризация рецепторов 31
Участие внутриклеточных белков-посредников в проведении сигнала рецепторов пролактина 32
Интернализация и ядерная транслокация 35
Роль короткой и длинной форм рецептора пролактина в проведении сигнала 35
1.3.4.5. Процессинг рецептора 36
1.3.5. Регуляция экспрессии мРНК рецептора пролактина 37
Уровень рецепторов пролактина. Регуляция транскрипции 37
Регуляция альтернативного сплайсинга пре-мРНК рецептора пролактина: соотношения короткой и длинной изоформ 38
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ 43
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 45
2.1.МАТЕРИАЛЫ 45
Животные 45
Реактивы 45
2.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МЕТОДЫ 50
2.2Л. Хирургические операции 50
Индуцированный обструктивный холестаз 50
Кастрация самцов 50
Овариэктомия самок 50
Введение препаратов 50
Приготовление препаратов клеток и тканей для анализа 51
Подготовка тканей для иимуногистохимического анализа 51
Подготовка ткани печени для ПЦР-анализа 51
Разработка способа дифференциального выделения гепатоцитов
и холангиоцитов 51
2.2.4. Иммуногистохимическая идентификация рецепторов пролактина в
тканях крыс 55
Приготовление срезов 55
Иммуногистохимическая идентификация рецепторов пролактина 55
Цитофотометрическое определение интенсивности ПрлР-позитивного окрашивания 56
Выделение РНК из тканей и изолированных клеток 57
Синтез первой цепи на выделенной РНК 59
Введение метки в олигонуклеотиды 59
Постановка полимеразной цепной реакции 59
2.2.10. ДНК-блотинг (Саузерн-гибридизация) 63
2.2.11. Клонирование фрагментов короткой и длинной изоформ
рецепторов пролактина 63
2.2.12. Разработка метода полуколичественной оценки уровня мРНК
рецептора пролактина и соотношения его короткой и длинной изоформ с
использованием внутреннего стандарта 65
Уровень мРНК рецепторов пролактина 65
Соотношение и уровень мРНК короткой и длинной изоформ рецепторов пролактина 66
Обоснование контрольной группы 66
2.2.13. Разработка метода количественного сопоставления уровня мРНК
рецептора пролактина в гепатоцитах и холангиоцитах с использованием
внешнего стандарта 66
2.3. ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫЕ МЕТОДЫ 68
2.3.1. Разработка метода математической оценки активности пролактин-
индуцированных сигнальных каскадов в тканях крысы, на основе
измеренных уровня мРНК рецепторов пролактина и соотношении его
изоформ 68
2.3.1,1. Формулировка модели 68
2.3.1.2. Верификация модели 71
2.3.2. Статистическая обработка данных 73
Глава 3. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ
РЕЦЕПТОРОВ ПРОЛАКТИНА В КЛЕТКАХ РАЗНОГО ТИПА
САМОК КРЫС 74
3.1. СУБКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПРЛР-СПЕЦИФИЧНОЙ
4
ОКРАСКИ 74
3.2. ЯИЧНИКИ 74
Фолликулы яичников 74
Желтые тела 76
3.3.МАТКА 78
ГИПОФИЗ И ГИПОТАЛАМУС 78
ПЕЧЕНЬ 79
Глава 4. УРОВЕНЬ мРНК РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА И
СООТНОШЕНИЕ ЕГО ИЗОФОРМ В ГЕПАТОЦИТАХ И
ХОЛАНГИОЦИТАХ САМОК КРЫСЫ В НОРМЕ 81
Глава 5. ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ НА УРОВЕНЬ мРНК
РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА И СООТНОШЕНИЕ ИЗОФОРМ В
ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ КРЫС 85
ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ НА ГЕПАТОЦИТЫ 85
ВЛИЯНИЕ ПОЛОВЫХ ГОРМОНОВ НА ХОЛАНГИОЦИТЫ 90
Глава 6. ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА
УРОВЕНЬ мРНК РЕЦЕПТОРА ПРОЛАКТИНА И СООТНОШЕНИЕ
ИЗОФОРМ В ГЕПАТОЦИТАХ И ХОЛАНГИОЦИТАХ
КРЫС 92
ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА ГЕПАТОЦИТЫ... 92
ВЛИЯНИЕ ОБСТРУКТИВНОГО ХОЛЕСТАЗА НА ХОЛАНГИОЦИТЫ.... 93 Глава 7. МАТЕМАТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ДЕЙСТВИЯ ПРОЛАКТИНА НА ГЕПАТОЦИТЫ И ХОЛАНГИОЦИТЫ В РАЗЛИЧНЫХ СОСТОЯНИЯХ 96
ГЕПАТОЦИТЫ 96
ХОЛАНГИОЦИТЫ 98
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 100
ВЫВОДЫ Ш
ЛИТЕРАТУРА 112
5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ИОХ - индуцированный обструктивный холестаз
ОТ-ПЦР - обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция
П.о„ т.о., т.п.о,, - пар оснований, тысяч оснований, тысяч пар оснований
ПрлР - рецепторы пролактина
СТГ - соматотропный гормон
ADAM17 -a disintegrin and metalloproteinase
Akt - тоже, что protein kinase В
ANOVA - analysis of variance
AP-1 - activator protein 1
CIS - cytokine inducible SH2 proteins
ERK - extracellular signal-regulated kinase
Grb - growth factor receptor-bound protein 2
HNF - hepatocyte nuclear factor
hnRNP — heterogeneous nuclear ribonucleoprotein
JAB - Janus kinase binding protein
J AK - Janus kinase
JNK - c-jun-N-terminal kinase
MAP(K) - mitogen activated protein (kinase)
PI AS - protein inhibitor of activated STATs
PRAP - prolactin receptor associated protein/17-гидроксистероиддегидрогеназа
7иготипа
SF-1 - steroidogenic factor 1
SF2/ASF - splicing factor 2/alternative splicing factor
SOS - son of the sevenless
SOCS - silencer of cytokine signaling
STAT - signal transducer and activator of transcription
TACE - TNFa converting enzime
Введение к работе
Пролактин - один из самых многофункциональных гормонов
млекопитающих. Его многочисленные функции включают регуляцию роста,
дифференцировки, размножения, метаболизма, осморегуляцию,
иммуномодуляцию и регуляцию поведения [Bole-Feysot et al, 1998].
Пролактин осуществляет свои эффекты, взаимодействуя со специфическими мембранными рецепторами (ПрлР). Несмотря на то, что к настоящему моменту уже накоплено достаточно много данных о механизмах проведения сигнала через рецепторы пролактина, многие вопросы, связанные с его тканеспецифичными эффектами, остаются нерешенными.
Наличие нескольких форм, как самого гормона [Sinha, 1995], так и его рецепторов [Ни, et al, 1998а; Bignon et al, 1999; Horseman, 1999] предоставляют широкое поле для изучения его мультифункциональности. У млекопитающих описано несколько функционально-различных изоформ ПрлР, обычно - это длинная с которой связывают проведение сигнала через основной для рецепторов цитокинов путь, связанный с активацией тирозинкиназ Януса, и короткая (или несколько разных коротких изоформ), которая, с одной стороны, негативно действует на активацию тирозинкиназ Януса, а, с другой стороны, ассоциирована с «тканеспецифическими» вариантами пролактин-индуцированных эффектов [Das and Vonderhaar, 1995; Nokelaen et al, 1997]. При этом специфика его действия определяется, прежде всего, типом ткани-мишени, и присущим этой ткани соотношением изоформ ПрлР, а ответ ткани формируется из ответа ее клеточных элементов.
К настоящему моменту уже накоплено множество данных по экспрессии ПрлР и передачи его сигнала во многих тканях [Nagano and Kelly, 1994; Ouhtit et al, 1994; Morel et al, 1994], однако, за редкими исключениями [Yokoyama et al, 2003], только на уровне целого органа или на уровне перевиваемых клеточных линий [АН, 1998]. Учитывая вышеизложенное, актуальным является сравнительное изучение экспрессии уровня ПрлР и соотношения его изоформ в разных клеточных элементах одной ткани и их изменений в различных
7 условиях. В связи с этим целью настоящей работы является: исследование на рецепторном уровне особенностей вклада разных клеточных элементов а суммарный ответ органа на пролактин при различных физиологических и патологических состояниях.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: Исследовать характер экспрессии ПрлР в различных клеточных элементах таких органов как яичники, матка, гипофиз, гипоталамус, печень самок крыс, для определения объекта дальнейших исследований - ткани, клеточные элементы которой обладают значимо различным и не гетерогенным уровнем ПрлР, и могут быть дифференциально изолированы.
Установлено, что этим критериям отвечает печень, основные клеточные элементы которой, гепатоциты и холангиоциты, контрастно различаются по уровню рецепторов пролактина. Дополнительным преимуществом этого выбора было то, что ранее в нашей лаборатории было установлено наличие избирательности влияния ряда факторов на экспрессию ПрлР в различных клеточных элементах печени: половые гормоны являются основными регуляторами ПрлР в гепатоцитах, в то время как обструктивний холестаз - в холангиоцитах [Петращук с соавт, 1996; Смирнова с соавт, 1998, Орлова с соавт, 1999]. Однако, для установления характера пролактин-индуцируемого ответа клеток этих данных совершенно недостаточно, необходимо знать не только тотальный уровень рецепторов пролактина, но также и соотношение их функционально различных изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах при различных физиологических состояниях.
Необходимыми предпосылками решения дальнейших задач являлись, во-первых, отработанный в рамках настоящего исследования метод одновременного выделения гепатоцитов и холангиоцитов в виде фрагментов желчных протоков с проверкой качества разделения по дифференциальным маркерам и, во-вторых, отработанный нами полуколичественный метод определения уровня рецепторов пролактина и соотношения его изоформ на уровне мРНК, основанный на анализе накопления продуктов конкурентной полимеразной цепной реакции с применением внутреннего стандарта [Pi and Grattan, 1998].
8 В дальнейшем, при работе с печенью крыс как удобным модельным объектом, были поставлены и решены следующие задачи:
оценка отличий гепатоцитов и холангиоцитов по таким параметрам как уровень мРНК ПрлР, и уровни его короткой и длинной изоформ ПрлР у самок крыс в норме;
сравнительное исследование действия половых гормонов на уровень мРНК ПрлР и уровней его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок и самцов крыс;
сравнительное исследование действия обструктивного холестаза на уровень мРНК ПрлР и соотношение его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок и самцов крыс. В рамках данной задачи важно было также установить, действует ли обструктивный холестаз на экспрессию ПрлР опосредовано через изменение уровня половых гормонов или его действие независимо от половых гормонов;
оценка вклада различных изоформ и изменения их соотношения при различных физиологических и патологических условиях в реализацию разных типов эффектов пролактина с помощью разработанной нами математической модели. Поскольку прямая экспериментальная проверка эффективности и характера действия пролактина на клетки крайне затруднительна, а при описании состояний in vivo и практически не возможна, необходимо было разработать альтернативный подход оценки вклада различных клеточных элементов печени в общий пролатин-индуцированный ответ печени на пролактин на основании уровня мРНК рецепторов пролактина и уровней мРНК его изоформ. Таким подходом стала, разработанная нами, математическая модель для расчета эффективности действия пролактина на клетки и ее зависимости от уровня изоформ. Данная модель позволяет сопоставить не только уровень рецепторов пролактина и соотношение его изоформ с описанными в литературе результатами оценки интенсивности пролактин-индуцированных каскадов in vitro, но анализировать новые экспериментальные данные.
9 Использование настоящей модели и полученные данные об уровне изоформ в разных типах клеток позволили нам оценить вклад гепатоцитов и холангиоцитов в реализацию различных пролактин-индуцируемых каскадов у крыс разного пола в норме. Кроме того, при использовании данных о действии половых гормонов и обструктивного холестаза на уровень мРНК рецепторов пропактина и соотношение его изоформ в гепатоцитах и холангиоцитах самок и самцов крыс, нами установлена степень влияния этих параметров на эффективность действия пролактина в зависимости от типа клеток печени.
В результате проведенной работы получены новые данные, позволяющие сопоставить вклад гепатоцитов и холангиоцитов в реализацию различных эффектов пролактина в печени при различных функциональных состояниях.
Установлено, что холангиоциты отличаются от гепатоцитов в норме не только существенно более низким уровнем мРНК рецепторов пролактина, но и обратным соотношением их изоформ: в холангиоцитах, как и большинстве тканей преобладает длинная изоформа рецептора, в гепатоцитах - короткая. Показано, что в отличие от большинства тканей в холангиоцитах половые гормоны не влияют ни на уровень мРНК рецепторов пролактина, ни на соотношение его изоформ. Продемонстрировано также, что обструктивный холестаз является независимым от половых гормонов фактором регуляции экспрессии рецепторов пролактина, дифференциально действующим на разные клеточные элементы печени. В холангиоцитах он, в первую очередь, повышает общий уровень мРНК рецептора, а в гепатоцитах преимущественно влияет на соотношение изоформ.
Математическая оценка интенсивности пролактин-индуцируемых каскадов, позволила заключить, что в печени интакных крыс и гепатоциты, и холангиоциты с равной эффективностью проводят сигнал пролактина, опосредованный активацией тирозинкиназ Януса, однако преобладают, по-видимому, тканеспецифические сигналы, которые реализуются через короткую изоформу рецептора, доминирующую в гепатоцитах. Математическая модель высветила существенные половые отличия сдвига пролактин-индуцируемых каскадов в гепатоцитах при обструктивном холестазе. Если у самок интенсивность пролактин-индуцированной активации тирозинкиназ Януса в
10 гепатоцитах возрастает более чем на порядок, то у самцов она не претерпевает практически никаких изменений.
Результаты, полученные в ходе настоящей работы, могут иметь значение для фундаментальной эндокринологии, так как не только расширяют представления о характере экспрессии рецепторов пролактина и их изоформ в основных клеточных элементах печени при различных функциональных состояниях, но и позволяют оценить на основе этих данных соотношение и интенсивность эффектов пролактина, реализуемых через разные клеточные элементы, и их вклад в реализацию эффектов в целой печени. Практическая значимость полученных данных заключается в развитии представлений о половых отличиях в протекании патологических процессов в печени, например, индуцированных обструктивным холестазом, что создает основы для пол-специфического фармакологического воздействия.
