Содержание к диссертации
Введение
Введение 5
Глава I. Эстрогенные рецепторы клеток органов половой сферы и печени (обзор литературы) 7
1. Роль рецепторов в механизме действия эстрогенов 8
2. Основные свойства эстрогенных рецепторов и краткие сведения о механизмах стероид-рецеп-торного взаимодействия 10
3. Современная модель действия стероидных гормонов 16
4. Мультирецепторная гипотеза действия стероидных гормонов 20
5. Современные представления о механизмах реализации эффектов ГРК 21
6. Эстрогенсвязывающие белки печени 24
7. Гетерогенная система эстрогенсвязывающих белков печени и ее особенности 26
Глава II. Материалы и методы 32
А. Материалы, буферные растворы и реактивы 32
1. Экспериментальные группы животных 32
2. Введение гормонов 32
3. Буферные растворы, реактивы и препараты 33
Б. Методы 34
1. Получение цитозоля печени крыс 34
2. Получение частично очищенного препарата
3. Получение ядер печени 36
4. Изучение гормонсвязывающих свойств ОЭСБ 36
а) общие принципы метода 36
б) определение /1/ и К^ ОЭСБ в экспериментах.. 40
в) определение концентрации Е2-связывающих мест ОЭСБ по связыванию минимальной добавки гор
мона 41
г) изучение стереоспецифичности ОЭСБ 42
5. Исследование транслокации гормон-рецепторных комплексов в ядра In, vivo 45
6. Определение белка и ДНК 48
7. Статистическая обработка результатов 48
Глава III. Стереоспецифичность сродства ОЭСБ к гормональным стероидам и его возможная физиологическая роль 50
1. Количественная характеристика взаимодействия ОЭСБ с рядом стероидных и нестероидных соединений 50
2. Структурный анализ взаимодействия исследуемых лигандов с ОЭСБ 50
3. Модель структуры связывающего центра ОЭСБ 67
4. Возможная физиологическая роль связывания гормональных лигандов с ОЭСБ 70
Глава ІV. Влияние ОЭСБ на аккумуляцию эстроген-рецепторных комплексов в ядрах гепатоцитов 75
Глава V. ОЭСБ как объект программирующего и регулирую щего действия эстрогенов и андрогенов 87
1. Роль андрогенов в детерминации ОЭСБ 88
2. Андрогены как регуляторы содержания ОЭСБ 90
3. Эстрогены как регуляторы содержания ОЭСБ 92
4. Взаимодействие регулирующих эффектов эстрогенов
и андрогенов на уровень ОЭСБ 95
Заключение 97
Выводы. 106
Литература 108
- Роль рецепторов в механизме действия эстрогенов
- Экспериментальные группы животных
- Количественная характеристика взаимодействия ОЭСБ с рядом стероидных и нестероидных соединений
- Влияние ОЭСБ на аккумуляцию эстроген-рецепторных комплексов в ядрах гепатоцитов
- Роль андрогенов в детерминации ОЭСБ
Введение к работе
Исследования последних лет позволяют рассматривать печень как, важнейший объект, модулятор и посредник многообразных программирующих и регуляторних эффектов эстрогенов и андрогенов. Половые стероиды оказывают свое действие в этом органе в нескольких направлениях: во-первых, они регулируют проявление собственной активности, а также активности некоторых других гормонов, определяя интенсивность гормонального метаболизма, транспорта и рецепции; во-вторых, посредством комплекса секретируемых печенью факторов оказывают системное влияние на организм (артериальное давление, водносолевой обмен, гемостаз, и др.) (В.Б.Розен, А.Н. Смирнов, 1981; А.Г.Резников, 1981; Coliu , 1980;і$Є*4-есІ,АЬегь 1979).
Для реализации множественного влияния половых гормонов печень обладает гетерогенной системой специфически связывающих их белков, на уровне которой в определенной степени, видимо, осуществляется дискриминация гормональных эффектов. Для эстрогенов такая рецепторная система впервые была выявлена и охарактеризована в лаборатории эндокринологии ?ЛГУ (О.В.Смирнова с соавт., 1975; А.Н.Смирнов с соавт., 1975,1977; Г.Д.Матарадзе с соавт., 1979). Показано, что в печени крыс содержится три цитоплазматических белка, специфически связывающих эстрадиол. Два из них аналогичны классическим рецепторам матки и являются, видимо, изоформами. Третий, особый эстрогенсвязывающий белок (ОЭСБ), обнаруживаемый только у самцов крыс, существенно отличается от предыдущих целым рядом параметров (А.Н.Смирнов с соавт.,1977; Г.Д.Матарадзе с соавт., 1979). Этот растворимый мономерный белок связывает не только многие эстрогены, но и некоторые андрогены; сродство его к гормону на два порядка ниже, а концентрация связывающих мест - на три порядка выше, чем у классических эстрогенных рецепторов; комплексы, образуемые им с эстрадиолом, отличаются лабильностью и, наконец, ОЭСБ, в отличие от рецепторов, не транслоцируется из ци-тозоля в ядро в комплексе с гормоном в системе ил* ш-съо . в то же время функциональные характеристики этого белка практически не изучены. Можно было лишь предполагать, что поскольку печень является одновременно и объектом действия, и центральным органом метаболизма эстрогенов и андрогенов, то ОЭСБ как органоспецифический белок может иметь существенное значение для процессов рецепции и метаболизма половых стероидов. Актуальность вопроса о функциональной роли ОЭСБ определяется важностью понимания динамики половых гормонов в организме, что необходимо для объективной оценки ее роли в физиологическом контроле многих системных процессов.
Раскрытие физиологической роли любого фактора требует разностороннего подхода как в отношении аспектов рассмотрения, так и в отношении уровня исследования. Мы считали целесообразным подойти к вопросу о физиологической роли ОЭСБ с трех сторон.
Изучить стереоспецифичность этого белка к различным гормональным соединениям и их метаболитам, для того, чтобы представить себе круг связываемых им лигандов.
Исследовать влияние ОЭСБ на аккумуляцию эстроген-рецеп-торных комплексов в ядрах гепатоцитов для того, чтобы оценить роль ОЭСБ в процессе рецепции половых стероидов.
Изучить регулируемость ОЭСБ со стороны эстрогенов и андрогенов в опытах: иь i/Liso.
Необходимо отметить, что к началу нашей работы сведений по указанным вопросам в литературе практически не имелось.
Роль рецепторов в механизме действия эстрогенов
В последнее время накоплено значительное количество разнообразных экспериментальных данных, позволивших создать единое представление о механизмах действия стероидных гормонов. В его основе лежит твердо установленный факт существования в клетках специальных рецепторних структур, опосредующих действие гормонов. Гормон- рецепторное взашлодействие, как считается, - ключевой этап в механизме действия гормонов (В.Б.Розен,А.Н.Смирнов,1981).
Рецепторы эстрогенов были первыми рецепторами стероидных гормонов, обнаруженными в чувствительных к этому типу гормонов органах, так называемых органах - мишенях ( 7&/гЗеи , I960; емек/ і tacohson, , 1962). Было показано, что специфический захват и аккумуляция эстрогенов происходят с помощью крупномолекулярных белковых компонентов цитоплазмы, способных обратимо, но с высоким сродством, избирательностью и ограниченной насыщаемостью связывать эти гормоны. Образование гормон-рецепторных комплексов (ГРК) - первичное событие после попадания гормона в компетентную клетку, непосредственно не зависящее от .других клеточных функций: уровней синтеза ДНК, РНК, белка, интенсивности дыхания и окислительного фосфорилирования (В.Б.Розен, 1977; 4 ,1968, bouu.bctu 1979).
По современным представлениям рецепторная молекула является двухвалентной в структурно-функциональном отношении: ее гормон-связывающий локус осуществляет дискриминированный прием гормонального сигнала и его аккумуляцию, эффекторный участок определяет взаимодействие гормона с акцепторными структурами клетки, инициируя специфические гормональные эффекты. Немаловажными являются и локусы внутри-молекулярного сопряжения первых двух функций, поскольку они обусловливают преобразование гормонального сигнала во внутриклеточный посредством конформационных перестроек рецепторной молекулы (В.Б.Ровен, 1984).
Рецепторы эстрогенов, как и других стероидных гормонов, локализованы внутри клетки, а не на ее поверхности, что характерно для многих гормональных и прочих сигнальных веществ.
Экспериментальные группы животных
Цитозоль, полученный, как описано в разделе БІ, фракционировали сульфатом аммония до 55% насыщения. Выпавшие в осадок белки отделяли центрифугированием при 20000 об./мин в течение 30 мин. Супернатант вновь высаливали сульфатом аммония до 75% насыщения. Осадок растворяли в ЖЕ-6 мМ ДТТ (1/10 от исходного объема) и фракционировали на колонке (14,8 х 77 см) ультрогеля АсА-44, уравновешенной ТКЕ. Элюцию проводили ТКЕ-буфером, каждую фракцию тестировали на эстрадиол-связывающую активность (разд.УІ.І). Фракции, содержащие 0ЭСБ, объединяли и наносили на колонку (1,8 х 8,5 см) ДЭАЭ-сефадекса А-50, уравновешенную ТКЕ. Задержанные на ионообмен-нике белки элюировались раствором /vdCc с линейньм градиентом концентрации 0-0,3 М, приготовленном на ТКЕ. Фракции, содержащие Ез-связывающую активность, объединяли, диализовали 24 часа против ТКЕ-0,5 мМ ДТТ, и после добавления 10 мМ ДТТ хранили при 4-6С две-три недели, причем активность препарата существенно не изменялась. Суммарная очистка 0ЭСБ была 50-100-кратной.
Очистку ядер проводили по модифицированному методу (иксш,-ггеаце/о 1956). Омытую от крови печень взвешивали, переносили в 2,2 М раствор сахарозы в ТКМ, который брали в соотношении 2:1 (объем-.вес), и гомогенизировали механическим гомогенизатором типа " Po&ftwhs " 3 раза по 20 сек при напряжении 80 В. Гомогенат переносили в пробирки от ультрацентрифуги ,( SbCyvCo (ротор "В") или УЩ-3-75 (ротор ШУ-30), на дно которых наслаивали "подушку" из 2,2 М раствора сахарозы в ТКМ (1/5 объема пробирки). Центрифугировали при 140000 а в теченіві часа. Супернатант сливали, осадок ядер отмывали от сахарозы путем мягкой гомогенизации вручную в буфере А и осаждали при 2500а. 15 мин.
С помощью фазово-контрастного микроскопа установлено, что полученный препарат содержит интактные ядра печени, имеющие правильную форму и свободные от пршяесей других клеточных структур. Соотношение концентраций ДНК/белок в препаратах колебалось от 0,5 до 0,55.
Количественная характеристика взаимодействия ОЭСБ с рядом стероидных и нестероидных соединений
В первом разделе нашего исследования для выяснения физиологической роли ОЭСБ мы считали целесообразным определить круг стероидных гормонов и их метаболитов, связываемых этим белком. Кроме того, в этом разделе мы ставили перед собой задачу оценить интенсивность этого взаимодействия и выявить требования, предъявляемые ОЭСБ к структуре связываемых им лигандов.
На рис.5 представлены графики вытеснения "%-Ео из комплексов с ОЭСБ рядом немеченых гормональных соединений. Полученные кривые взаимно параллельны, что указывает на конкурентный характер связывания %-эетрадиола производными эстрана и андростана. Результаты определения величин. ОКА стероидных и нестероидных соединений из нескольких аналогичных экспериментов представлены в итоговой
Можно видеть из данных, приведен-ных на рис.6,7, что концентрации связывающих участков всех Н-сте-роидов близки между собой, а соотношение ОКА для этих стероидов находится в соответствии с соотношением их К&.
Влияние ОЭСБ на аккумуляцию эстроген-рецепторных комплексов в ядрах гепатоцитов
Из данных по изучению стереоспецифичности сродства ОЭСБ и высокой концентрации его в ткани печени (7 ЗХГ1 м/мг белка (А.Н. Смирнов с соавт., 1977) следует потенциальная возможность влияния ОЭСБ на динамику рецепции стероидных гормонов. Как известно, печень испытывает многообразные регуляторные и программирующие влияния эстрогенов и андрогенов (В.Б. Розен, 1983) и обладает для опосредования этих влияний гетерогенной системой рецепторних белков. Ряд функций печени находится под двойным эстроген-андрогенным контролем, причем реализация его достигается, по-видимому, не только физиологически модулируемой продукцией тех или иных гормонов, но и внутриклеточной модуляцией интенсивности потоков половых гормонов на рецепторный аппарат ге-патоцита. ОЭСБ в силу своей большой емкости и способности связывать как эстрогены, так и андрогени является реальным претендентом на роль такого модулятора. В связи с этим нами была предпринята попытка получить экспериментальные доказательства влияния ОЭСБ на рецепцию половых стероидов. С этой целью было исследовано влияние андрогенов на динамику вызванной введением эстра-диола и гексэстрола аккумуляцию эстрогенрецепторных комплексов в ядрах клеток печени самцов и самок крыс.
Схема опытов была основана, во-первых, на половом диморфизме в содержании ОЭСБ, во-вторых, на различиях в гормональной специфичности сродства ОЭСБ и ЭР.
Согласно полученным нами результатам, динамика ядерной аккумуляции ЭР у самцов существенно отличается от динамики, наблюдаемой у самок (рис. 9, 10). Если у самцов максимальное накопление ЭР в ядрах после инъекции 10 мкг Eg наблюдается на 60-й минуте, то у самок этот максимум сдвинут на 30-ю минуту.
Абсолютные значения ядерной акумуляции у самок также выше, чем у самцов (табл. 6). Эти данные соответствуют литературным. Так, PouSe.-\onu и Thompson, (1980) показали, что в натив-ном цитозоле транслокация ГРК у самцов меньше, чем у самок, однако, при увеличении времени инкубации количество транслоциро-ванных комплексов возрастает. Аналогичные данные приводят л Ьел и U/eLnJpe oet (1979,1980). Можно предположить, что эти половые различия связаны с наличием ОЭСБ, уменьшающего поток эстра-диола, направленный на рецепторний аппарат клетки. Со временем, благодаря диссоциации комплексов гормона с ОЭСБ, уровень транслокации у самцов повышается.
На основе наших данных о стереоспецифичности сродства ОЭСБ одновременно с эстрадиолом мы вводили самцам тестостерон, ожидая что в силу своей способности конкурировать за связывающие места ОЭСБ, он увеличит активную концентрацию эстрадиола в клетке и тем самым повысит уровень транслокации эстроген-рецептронных комплексов в ядрах.
Роль андрогенов в детерминации ОЭСБ
Как видно из табл. 7, уровень ОЭСБ на порядок ниже, чем в печени взрослых самцов, может быть выявлен и у неполовозрелых животных того же пола. Б то же время в печени самок того же возраста содержание ОЭСБ находится на неопределяемом уровне. Можно думать, что появление 6ЭСБ в печени неполовозрелых самцов есть результат неонатального импринтинга. Прямой проверкой такого предположения является эксперимент с неонатальной андро-генизацией самок. Такие опыты были проведены и показали (табл. 7) , что в печени неполовозрелых самок, подвергшихся неонатальной андрогенизации, ОЭСБ можно обнаружить в количестве, близком к найденному у самцов того же возраста. Факт подверженности появления ОЭСБ неонатальному импринтингу согласуется с данными РохХеШ-ЛЯЬЦ d аі (І98І)ч Sdoop tt си. (1983). Индукция андрогенами ОЭСБ может происходить у самок и на последующих этапах их онтогенеза. Уровень ОЭСБ после 3-х дневного введения тестостерона про-пионата (ТП) неполовозрелым самкам близок к содержанию его как у неонатально андрогенизированных неполовозрелых самок, так и у неполовозрелых самцов, получавших и не получавших ТП (табл. 7).
Андрогены сохраняют способность к стимуляции появления ОЭСБ и в печени половозрелых самок. При этом индуцированный андрогенами ОЭСБ продолжает выявляться достаточно долго как у половозрелых овариэктомированных самок, так и у кастрированных половозрелых самцов, не получавших ТП (О.В. Смирнова с соавт. 1980). Не исключено, что такой длительный эффект андрогенов на уровень ОЭСБ является свидетельством необратимости процесса индукции этого белка.
