Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1- Эндогенная интоксикация при ожоговой болезни 10
1.1.1. Химические соединения - маркеры эндогенной интоксикации 14
1.1.2. Возникновение первичных токсинов при ожоговой болезни 20
1.1.З. Роль печени в процессе детоксикации при ожоговой болезни 24
1.1.4. Роль альдегидцегидрогеназы в детоксикационном процессе при ожоговой токсемии 29
1.2. Альдегиддегидрогеназа 33
1.3. Коррекция ожоговой токсемии лазерным излучением и медикаментозными препаратами 44
2. Материалы и методы исследования 54
2.1 Постановка эксперимента 54
2.2. Методы исследования 57
2.2.1. Приготовление гомогенагов печени и выделение субклеточных фракций 57
2.2.2. Определение активности альдегиддегидрогеназы 59
2.2.3. Определение активности лактатдегидрогеначы 59
2.2.4.Определение активности алкогольдегидрогеназы 61
2.2.5. Определение кинетических характеристик ферментов 61
3. Результаты исследований и их обсуждение 63
3.1. Активность и кинетические показатели альдегиддегидрогеназы печени и эритроцитов крыс в норме и при ожоге 63
3.2. Активность и кинетические свойства альдегиддегидрогеназы печени и эритроцитов крови крыс при введении им "молекул средней массы" 79
3.3. Активность и кинетические показатели альдегиддегидрогеназы печени крыс при инкубации in vitro субклеточных фракций печени с "молекулами средней массы" 90
3.4. Активность и кинетические показатели альдегиддегидрогеназы эритроцитов крови больных с термической травмой 105
3.5. Влияние излучения полупроводникового лазера в опытах in vitro на активность и кинетические показатели альдегиддегидрогеназы печени и эритроцитов крыс с термической травмой 108
3.6. Влияние излучения низкоинтенсивного красного света (люмир) in vitro на активность и кинетические свойства альдегиддегидрогеназы печени и эритроцитов крыс с ожогом 117
3.7. Изменение активности и кинетических показателей альдегиддегидрогеназы печени и эритроцитов крыс с ожогом под влиянием эритроцитарной массы, облученной in vitro полупроводниковым лазером и красным светом 130
3.8. Влияние глицина на активность и кинетические показатели альдегиддегидрогеназы печени и эритроцитов крыс с термической травмой 155
Заключение 178
Выводы 180
Список литературы 182
- Химические соединения - маркеры эндогенной интоксикации
- Роль альдегидцегидрогеназы в детоксикационном процессе при ожоговой токсемии
- Определение активности лактатдегидрогеначы
- Активность и кинетические показатели альдегиддегидрогеназы печени и эритроцитов крыс в норме и при ожоге
Введение к работе
Актуальность темы. Проблема термических повреждений занимает одно из центральных мест в хирургии и травматологии, оставаясь актуальной и по сей день. Ведущим звеном в патогенезе ожоговой болезни является эндогенная интоксикация, которая развивается с первых часов после термической травмы и сопровождает все без исключения стадии и периоды заболевания, во многом определяя его тяжесть и исход (Yao, 1993; Hou et ah, 1994; Козинец и др., 2004).
Суть эндогенной интоксикации состоит в накоплении в крови токсичных биологически активных компонентов в результате усиления катаболиче-ских процессов при снижении эндогенной детоксикации (Копытова и др., 1991). В частности увеличивается содержание таких промежуточных метаболитов как альдегиды (Малахова, 2000). Альдегиды в повышенных концентрациях вызывают ряд отрицательных эффектов. Они нарушают структуру и функции плазматических и внутриклеточных мембран, выступают в качестве ингибиторов активности многих ферментов мембран и сыворотки крови, в результате прямого взаимодействия модифицируют белки крови и тканей. Токсичные среднецепочечные альдегиды: алканали, алкенали и 4-гидроксиалкенали генерализуются в течение липидной пероксидации, которая усиливается при термической травме (Reichard et al., 2000; Townsend et al.,2001).
Основная роль в утилизации альдегидов принадлежит альдегиддегнд-рогеназе (Сатановкая, 1990; Yoshida et al., 1998). Наибольшая активность фермента характерна для клеток печени. Нарушение функций печени является исключительно важным звеном в патогенезе ожоговой токсемии, поскольку печень является главным детоксицирующим органом. Известно, что сразу после термической травмы печень подвергается влиянию токсических продуктов на фоне резко сниженной ее антитоксической функции (Федоров и др., 1985).
Наряду с печенью альдегиддегидрогеназной активностью обладает также и кровь {Матвеева и др.5 1991), Поскольку эритроциты более доступны для исследования, чем печень, определение активности АлДГ в эритроцитах в ранние сроки после термической травмы может являться важным прогностическим признаком и служить дополнительным критерием в оценке синдрома эндогенной интоксикации.
Однако работы по изучению АлДГ при термической травме в праяалн-зированной литературе отсутствуют. Таким образом, исследование активности АлДГ в печени и крови является актуальным в решении проблемы эцдо-генной интоксикации при ожоге.
В последнее время в медицине при лечении ряда заболеваний, в том числе и ожоговой травмы, широко используют низкоинтенсивные электромагнитные излучения (ЭМИ), В связи с этим представляет интерес исследование их влияния на активности АлДГ при ожогах. Наряду с физиотерапией при ожогах также применяют различные химические вещества, способные связывать токсины. В этом плане привлекает внимание глицин, однако его роль в метаболизме альдегидов и влияние на активность АлДГ не изучены.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование активности АлДГ в ранний период после термической травмы и воздействия низкоинтенсивных ЭМИ и глищша на исследуемый фермент.
В работе были поставлены следующие задачи:
1.Исследовать активность и кинетические свойства альдегиддегидроге-назы печени и эритроцитов крыс в ранний период после термической травмы (1 час).
2.Изучить влияние молекул средней массы (МСМ)5 полученных из обожженной печени (МСМоп) на активность и кинетические свойства альде-гиддегидрогеназы в опытах in vitro и при внутрибрюшинном введении крысам МСМоп.
3. Исследовать активность альдегиддегидрогеназы эритроцитов в крови больных с ожогами.
4. Определить активность и кинетические свойства альдегиддегидроге-назы печени и эритроцитов крыс с термической травмой после воздействия низкоит-енсивного электромагнитного излучения в опытах in vitro и in vivo.
5- Изучить влияние глицина, введенного до и после термической травмы, на активность альдегиддегцдрогеназы в печени и эртроцитах крови крыс,
Наутаая новизна Установлено, что термическая травма сопровождается изменением активности и кинетических свойств АлДГ наряду со снижением активности ЛДГ и АДГ в различных фракциях гепатоцитов и эритроцитах. Выявлено, что лактат оказывает положительное, а пируват отрицательное влияние на активность АлДГ,
Показано, что термическая травма вызывает снижение активности и каталитической эффективности АлДГ в эритроцитах крови ожоговых больных.
Впервые установлено ингибирующее действие МСМ обожженной печени на активность АлДГ в субклеточных фракциях печени и эритроцитах. Ожоговые токсины, образующиеся при термической травме и входящие в состав МСМ, связываясь с сульфгидрильньтми группами активного центра АлДГ, снижают ее активность, что доказано в опытах с тетурамом.
Разработан способ даагносгики эндогенной ннтоксикаїщи при ожоге в эксперименте, заключающийся в том что в гемолизате эритроцитов определяют активность альдегиддещдрогеназы и, если ее активность ниже нормы, делают вывод о токсичности крови.
Показано, что облучение in vitro субклеточных фракций печени крыс с ожогом ППЛ и красным светом, а также введение крысам облученной эрит-роцитарной массы (ЭМ) приводит к увеличению активности АлДГ, Установлено, что излучение ППЛ в опытах in vilro и in vivo вызывает повышение каталитической эффективности и сродства АлДГ к субстрату.
Выявлено протекторное и корригирующее действие глицина на активность АлДГ при термической травме в эксперименте.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные данные об изменении активности и кинетических свойств АлДГ углубляют представления о роли ферментов биотрансформации в развитии эндогенной интоксикации при ожогах. Исследование активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и алкогольдегидрогеназы (АДГ) позволяет оценить их влияние на активность АлДГ и метаболизм альдегидов. Полученные результаты свидетельствуют, что одной т причин, приводящих к снижению активности АлДГ, может быть повышение уровня МСМ при ожоге.
Определение активности АлДГ в ранний период после термической травмы имеет важное диагностическое значение и может быть использовано как дополнительный тест для лабораторной диагностики эндогенной интоксикации.
На основе полученных данных изменения активности АлДГ эритроцитов крыс разработан способ оценки эндогенной ютгокешеацйи при термической травме в эксперименте, который может найти применение в экспериментальной биологии и медицине для оценки степени тяжести эндотоксемии.
Исследование влияния излучения красного света и полупроводникового лазера (ГШЛ) выявило положительный эффект их воздействия на метаболизм ксенобиотиков и может найти применение для восстановления активности АлДГ при лечении ожоговых больных. Установленное защитное действие глшщна на активность АлДГ позволяет рекомендовать использование глицина в качестве вспомогательного средства при оказании помощи тяже-лообожжеппым.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Международном конгрессе «Комбустиология на рубеже веков» (Москва, 2QG0), Всероссийской научно-практической конференции «Новые технологии в медицине» (Саратов, 2001), Всероссийской конференции «Проблемы медицинской этимологии. Современные технологии лабораторной диагностики нового столетия» (Москва, 2002), VI Международном медицинском конгрессе студентов и молодых ученых (Терноиоль, 2002), Российской науч но-практической конференции с международным участием «Клинические и теоретические аспекты острой и хронической боли» (Н.Новгород, 2003), VIII Всероссийская научно-практической конференции «Проблемы лечения тяжелой термической травмы» (Н.Новгород, 2004).
По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, получен патент на изобретение «Способ диагностики эндогенной интоксикации при ожогах в эксперименте» (№ 2217753 от 27Л 1.2003).
Основные положения, выносимые на зашиту. Термическая травма сопровождается снижением активности и изменением кинетических показателей АлДГ, При ожоге уменьшается активность не только АлДГ, но и ЛДГ и АДГ в различных фракциях гепатоцитов и эритрощггах, В опытах in vitro установлено, гго лактат оказывает положительное, а пируват - отрицательное влияние на активность АлДГ. В опытах in vitro и in vivo показано ингиби-рующее действие МСМ, выделенных из обожженной печени, на активность АлДГ.
В исследованиях in vivo in и vitro при ожоговой болезни выявлено, что излучение низкоинтенсивного красного света и полупроводникового лазера способствует увеличению активности АлДГ экспериментальных животных.
Показано, что глицин оказывает защитное действие на каталитические свойства АлДГ печени и эритроцитов крыс при ожоге в эксперименте. Библ. 327 названий
Химические соединения - маркеры эндогенной интоксикации
Представления о СЭИ и о природе токсических веществ среди разных исследователей достаточно дивергенты.
Так, Ю.Н. Белоруков (1986) и И.А. Брюхин (1989) (щгг. по Корячкину и Страпгаовуа 2002) сообщают об участии в реализации СЭИ более 40 промежуточных продуктов обмена, выявленных при хромагографическом исследовании, а среди источников интоксикации основное внимание уделяют очагам первичной и вторичной воспалительной деетрующи, ишемюирован-ным тканям, зонам естественной вегетации микрофлоры в организме.
Наиболее полную в отечественной литературе классификацию компонентов эндогенной интоксикации приводят В,ВЛаленкоэ Ф.Х. Кутушев (цит. по Корячкину, Страшнову, 2002), Авторы выделяют следующие группы веществ: 1. промежуточные и конечные продукты нормального обмена в ано мально высоких концентраіщях (лактат, пируват, креатинин, билирубин и др-); 2. продукты извращенного обмена (альдегиды, кетоны); 3. иммунологически чужеродные продукты расщепления пластического материала организма; 4. нарушение распределения и диссеминация органо- и цитолокаяизо-ванных веществ; 5. проникновение во внутреннюю среду компонентов полостей организма (индол, скатол, фенол); 6. накопление продуктов жизнедеятельности нормальной, условно-патогенной и патогенной микрофлоры. С.А- Симбирцев, Н.А, Беляков (1994) предлагают следующую классификацию эндотоксинов: 1 - продукты естественного обмена в высоких концентрациях; 2 - активированные препараты, способные повреждать ткани; 3 - медиаторы воспаления и другие биологически активные вещества; 4 - класс среднемолекулярных веществ различной природы; 5 - гарекисные продукты; 6 - неоднородные по составу ингредиенты нежизнеспособных тканей; 7 - агрессивные компоненты комплемента; Позднее было установлено, что к эндотоксинам относятся накапливаемые в патологических концентрациях компоненты и эффекторы регуляторних систем организма (биогенные амины, продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), компоненты свертывающей, фибринолитической, калликре-ин-тсининовой систем и др,) (Беляков, 1995); бактериальные экзо- и эндотоксины (Беляков, 1995; Goldberg et at, 1995; Elzaim et at, 1998; Rumbaugh et at, 2001; Shimizu et at, 2001). B.K. Гостищев и др. (1992), EtK. Гостищев, Федоровский (1994) считают целесообразным выделение 3 компонентов эндогенной интоксикации: микробиологического, (шохимического, иммунологического. Ответственными за возникновение микробной токсемии авторы считают преимущественно токсины кишечной палочки (Бардахчьян, ХарлановаД997; Neety et al,, 2002; Hiroki et al., 2003; Yamaguchi et al., 2003), а бактериемии - стафилококковую флору (Childs et al, 1994; Marodi et at, 1995; Childs et al, 1999; Li et at, 2000; Floret et at, 2001; Oyake et at, 2001; Ami et at, 2002; Li et at, 2002; Thomas et at, 2002; Yaoetat, 2002;). МЯ.Маяахова (2000) формулирует понятие о биохимическом субстрате ЭИ как мере метаболического ответа организма на агрессивный фактор. В качестве такого "субстрата" выступает среднемолекулярный пул веществ, который принято разделять на вещества низкой и средне-молекулярной массы (ВН и СММ) (вещества в основном небелкового происхождегош) и пептиды с молекулярной массой не более 10-15 кД (Малахова, 1995). Олигопептидная составляющая среднемолекулярного пула веществ включает в себя регуляторные (РП) и нерегуляторные (ЮТ) пептиды (Виноградов, 1998; Wu et аЦ 2001), Регуляторные пешиды - гормоны, играющие важную роль в процессе жизнедеятельности, в обеспечении гомеостаза и патогенезе различных заболеваний {тшйротензины, нейрокинины, эндорфияы, энксфалины и другие биологически активные вещества). Нерегуляторные пептиды - зачастую активные в биологическом плане вещества, имеют несколько путей образования, главным из которых являются тюстуштшие извне ТОКСШИЙ (бактериальные, ожоговые, кишечные) и образовавшиеся внутри организма (в результате аутолиза, ишемии, пшоксии органов, процессов неограниченного протеоли-за) продукты, т.е. пептиды с нерегулируемым содержанием и непредсказуемыми свойствами. Наиболее обширную группу идентифицированных пептидов составляют пептиды — фрагменты коллагена и фибриногена и других белков плазмы крови, выделяемые с мочой при разных заболеваниях (Wu et aL, 2001). Вещества средней молекулярной массы обнаруживаются в плазме крови, лимфе, моче, спинномозговой жидкости, в слюне и других средах организма. ВН и СММ представляют собой в основном небелковые вещества различной природы: - мочевина, креатинин, мочевая кислота, амнносахара, молочная и другие органические кислоты, аминокислоты, жирные кислоты, билирубин, холестерин, фосфолштады и их дериваты, продукты промежуточного метаболизма, свободнорадикального окисления и другие, накапливающиеся в превышающих нормальные концентрациях; - высокие концентрации промежуточных метаболитов (аммиак, альдегиды, кетоны); - вещества аномального метаболизма (спирты, карбоновые кислоты) и токсичные компоненты полостных сред организма (фенол, скатол, индол, путресцин, кадаверин) (Ветров, Бутаевэ2000). По своему происхождению ВН и СММ можно подразделить на катабо-лические и анаболические. Данный пул веществ распределяется в крови между белками-носителями (альбумины, липопротеиды) и гликокаликсом эритроцитов, которые способны транспортировать эти вещества. Проявление биологической активности ВН и СММ весьма разнообразно: от участия в поддержании работы систем гомеостаза до альтерирук5Щеґо действия (Малахова, 2000), Установлено, что отдельные компоненты среднемолекулярного пула веществ: - обладают нейротоксической активностью (Смирнов и др.5 1989); - участвуют в развитии состояния вторичной иммунодепрессии (Ко-пытоваидр., 1991;BordeetaL, 2002); - оказывают ингибирующее действие на эритропоэз, биосинтез белка, адениловых нуклеотидов, тканевое дыхание (Малахова, 1995); - изменяют проницаемость мембран (Малахова, 1995); - нарушают натрий-калиевый баланс, процессы транспорта аминокислот, выведения креатинина (Смирнов и др,, 1989); - усиливают ПОЛ в тканях (Liu et aL5 2002); - оказывают цитотоксическое действие (Малахова, 1995); - вызывают нарушение микроциркуляции и лимфодинамики (Галактионов и др,, 1984; Остапенко, 1995; Ветров, Бутаев, 2000); - ингибирующе влияют на активность ряда ферментов (Смирнов СВ. и др., 1989).
Роль альдегидцегидрогеназы в детоксикационном процессе при ожоговой токсемии
Несмотря на то, что в процессе биотрансфрмации веществ в конечном итоге образуются менее токсичные соединения, многие промежуточные продукты 1 и II стадии могут обладать высоким гепатоксическим эффектом. На 1 стадии биотрансформации ксенобиотиков большую опасность представляет образование реактивных продуктов восстановления кислорода, связанное в основном с пероксидазной активностью цигохрома Р-450- Их источником может быть дисмутация супероксидного аниона, высвобождаемого при диссоциации оксищггохрома Р-450, что приводит к образованию Н202 и органических гидроперекисей.
Высокие концентрации Нз02 и органических гидроперекисей обладают сильным цитотоксическим эффектом, выражающимся в нарушении поверхностной структуры клетки, деградации GSH и выходе Са2 из гепатоцита во внеклеточное пространство (Матюшин и др., 1992),
Активные формы кислорода (АФК) могут образовываться в окислительно-восстановительных превращениях путем непосредственного взаимодействия ксенобиотиков, имеющих хиноновую структуру, с кислородом.
Взаимодействие свободнорадикальных продуктов восстановления кислорода с ненасыщенными алкильными цепями приводит к инициации пере-кисного окисления липидов биологических мембран. Главный токсический эффект продуктов перекисного окисления в целом заключается в изменении микроархигектуры мембранных образований, приводящем к нарушению их проницаемости, подавлению ферментативной активности и образованию токсичных продуктов типа альдегидов (Гулак и др., 1985).
Перекисное окисление липидов в биологических мембранах сопровождается образованием разнообразных по химической структуре альдегидов, которые являются продуктами распада перекисей полиненасыщенных жирных кислот и сквалена. Около 40% от общего количества карбонильных соединений приходится на долю малонового диальдегида (МДА), МДА весьма активно реагирует с аминогруппами белков и нуклеиновых кислот, образуя внутри- и межмолекулярные сшивки. При этом появляются флуоресцентные хромофоры с Хтюзб 395 нмим- 470 нм, благодаря формированию характарных I-амино-З-иминопропеновых структур, МДА, встраиваясь в клеточные мембраны, образует основания Шиффа, которые как бы стягивают мембраны, нарушая их физико-химические свойства, особенно эластичность и проницаемость (Дерюгина, 1998). Кроме того, было показано, что МДА способен модифицировать молекулы РНК и ДНК, что может быть одним из факторов канцерогенеза в условиях повышенной радиации.
Поскольку перекисное окисление липидов непрерывно протекает в нормальной клетке и усиливается при патологии (Логинов и др., 1985; Бож-ко, 1990; Потапов и др., 1995; Елагин, 1997)т накопление МДА является постоянным процессом (Liu et aL, 2002), Однако пути утилизации этого метаболита исследованы слабо. В гепатоцитах окисление МДА катализируют некоторые изоферменты альдещлдегидрогеназы (КФ 1,2.1,3-), локализующиеся в цитозоле и мигохоцдриях (Банкова и др., 1988; КулинскиЙ, 2002). Из экстракта печени крысы выделили ферменты, катализирующие НАД-зависимое окисление МДА. Во время хроматографии на 5" - АМФ-сефарозе дегидроге-наза МДА разделялась на две изоформы (1 и II). Изоформа I имела широкую субстратную специфичность и характеризовалась наименьшими значениями Km и наибольшей активностью в отношении алифатических альдегидов с короткой и средней длиной цепи (С2-С$у Значения Km для МДА и ацетальде-гида равнялись соответственно 2,8 и 0,69 мкМ. Изоформа II наиболее активна со средне- и длинноцепочечными алифатическими альдегидами (С6-Сц) и характеризовалась Km для МДА и ацетальдегида соответственно 37 и 52 мкМ, Изоформа I дегидрогеназы МДА была значительно более чувствительна к ингибированию дисульфирамом, чем изоформа ТІ; при этом обе они имели одинаковую молекулярную массу 93000 Да. Предполагается, что изоформа I дегидрогеназы МДА аналогична альдегиддегвдрогеназе митохонд-риального матрикса с низкой Km для ацетальдегида» а изоформа П локализуется в цитозоле клеток печени (Пирожков, Панченко, 1988).
Не менее токсичными свойствами, чем МДА? обладает ацетальдегид. Ацетальдегид выступает в качестве ингибитора активности многих ферментных систем мембран и сыворотки крови, в результате прямого взаимодействия модифицирует белки крови и тканей, вызывает внутри- и межмолекулярные сшивки полипептидов. Нарушение структуры и функции генетического аппарата генеративных и соматических клеток в условиях интоксикации преимущественно обусловлено действием ацетальдегида. Помимо прямых негативных эффектов ацетальдегид может вызывать нарушение физиологических функций, опосредованное стимуляцией процессов перекисного окисления липидов (Божко, 1990).
Нейрофизиологическая активность ацетальдегида может реализоваться в результате формирования его комплексов с биогенными аминами или ароматическими аминокислотами с образованием тетрагидроизохинолинов. Ацетальдегид и другие низкомолекулярные альдегиды оказывают денатурирующее действие на ДНК (Божко, Хоменко, 1988).
Интоксикация вызывает гиперпродукцию АФК в митохондриях. Ненасыщенные липиды мембран клеток особенно восприимчивы к окислению молекулярным кислородом. В результате образуется около 20 разновидностей молекул альдегидов и кетонов. Повышение уровня ацетальдегида и других альдегидов крови и тканей может являться следствием снижения активности альдегиддегидрогеназы (АлДГ) (Божко, 1990).
Известна роль АлДГ как одного из критериев оценки наличия злокачественного процесса (Сатановская, 1995; Nomura et al., 2000; Трещалина и др., 2001; Park et al, 2002; Seishiro et al., 2002). Недостаток АлДГ2 вносит вклад в развитие митохондриальных дисфункций при болезни Альцгеймера (Ohta, 2000), активность АлДГ эритроцитов крови изменяется при атеросклерозе (OhlinetaL, 1991).
Определение активности лактатдегидрогеначы
Эксперименты были проведены на 284 белых нелинейных крысах-самцах массой 180-200 г. Все животные под тиопенталовым наркозом (30 мг/кг массы) получали ожог пламенем на тщательно освобожденных от шерсти 10%-ах поверхности кожи, экспозиция - 45 с. При этих условиях темпера-турапод кожей 45-60С (Федоров и др.? 1985). Исследованием Н.А.Федорова и др. (1985) убедительно показана зависимость тяжести поражения от температуры прогревания тканей. Наиболее выраженные изменения обнаруживаются при прогревании тканей до 45-бОС. Исходя из поставленной задачи, для тестирования ожоговой токсемии мы приняли модель ожоговой травмы, описанную выше. Через час после ожога печень и кровь забирали для исследований. Активность АлДГ определяли в эритроцитах, гомогенате и субклеточных фракциях печени (цитозоле, Ml и М2-митохоццриях). Из литературы известно о гетерогенности митохондрий по морфологии, плотности, участии в апоптозе клетки и старении, В животной клетке одновременно присутеггвуют «молодые» - диаметром менее 1 мкм (Ml) и «зрелые» - диаметром более I мкм (М2) мигохоцдрии. Митохондрии разного размера обладают сходством по таким показателям, как интенсивность дыхания, состав дегидрогеназ, фосфорилирование АДФ, состав белков, что свидетельствует о тесном родстве этих органелл. В то же время, митохондрии разного размера отличаются по NADH-дегидрогеназной и фосфорилирующей активности, по содержанию нескольких белков, что отражает процесс созревания митохондрий (Шишма-ков и др., 2004)- Ml и М2-митохондрии получали путем дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.
С помощью количественных методов биотестирования in vitro и in vivo доказано, что кровь и тканевые экстракты животных и людей после ожога приобретают явно выраженные токсические свойства. Отмечено, что интоксикация и глубокие функциональные нарушения в обожженном организме выявляются одновременно уже в первые часы после ожога (Федоров и др., 1985).
Выраженные изменения на уровне клеточных и субклеточных структур были обнаружены и в печени (Заец и др., 1990), Установлено, что термическое поражение вызывает нарушение проницаемости лшосомалъных мембран. В эксперименте показано, что уже в первые часы после травмы происходит деструкция мембран лизосом и поступление лизосомальных ферментов в кровь. Этот процесс может первоначально быть следствием токсического воздействия, но затем вышедшие из клеток лгоосомальные ферменты в свою очередь иогут оказывать токсическое действие и способствовать токси-нообразованию, В этих условиях необходимо исследовать не только токсические свойства сывороток, но и токсичность экстрактов органов. Таким образом, накопление токсических продуктов в печени после ожога и их важная роль в патогенезе ожоговой токсемии в настоящее время не вызывает сомнений. Однако выделение этих веществ и определение их токсичности по отношению к АлДГ ранее не проводилось (Федоров и др., 1985). С этой целью получали раствор "молекул средней массы" (МСМ) из обожженной in vitro печени (МСМоп) по следующей схеме: в опытах использовали печень нормальных беспородных крыс. Термическую обработку печени in vitro проводили обжигом печени в спирте в течение 45 секунд. Через 1 час готовили гомогенат в среде, содержащей 2,25М раствор сахарозы, 0,01М трис-НС1-буфер (рН 7,5). Фракцию МСМ получали из гомогената по МЛШалаховой (1995). При изучении токсичности экстрактов, выделенных из органов обожженных животных, в качестве контроля обычно применяют экстракты, приготовленные, как считают Б.Е. Мовшев и Р.В.Недошивина (1974) , "из нормальных органов при аналогичных условиях". Таким образом, контроль представлен фракцией МСМ, выделенной аналогично из необожженной печени крыс (МСМнп). Токсический эффект МСМ оценивали по изменению активности АлДП Полученные МСМоп и МСМнп вводили интактным крысам внугрибрюшинно в дозе 5 мл/кг массы. Через 1 час после введения животных забивали путем декапитации. В опытах in vitro МСМ, полученные вышеописанным способом, вводили непосредственно в среду для определения активности ЛДГ, АДГ и АлДГ в количестве 0,1 мл на пробу объемом 3 мл. Универсальный ингибитор активности альдегиддегидрогеназы тетурам вводили внугрибрюшинно в дозе 0,2 г/кг массы тела ингактным крысам и крысам, получившим термическую травму за 60 мин до ожога (Волошин и др., 1991), В условиях in vitro изучалось влияние лактата Na (0,45М) и пирувата Na (0,18М) на активность АлДГ ингактных крыс и крыс с термической травмой (Хочачка, Сомеро, 1988; Мертвецов, 1990)- Данные вещества вносили непосредственно в среду для определения активности АлДГ (0,1 мл на пробу объемом 3 мл). Раствор глицина в дозе 250 мг/кг массы вводили крысам внутрибрю-шинно (Бунятян и дрм 1999; Девяткина и др., 2000), В качестве источников ЭМИ использовали полупроводниковый лазер Микрон С-01 "Сполох" (X = 890 нм, мощность - 0,5 мВт) и источник на основе двухслойных полимерных оптоволокон с люминесцентными добавками в керне. Диаметр волокон составлял 0,8 мм. Использовался красный свет со спектром 600-800 нм и максимумом 630 нм. Интенсивность излучения составляла 1,5 мВт/см3, В опытах in vitro гомогенат и субклеточные фракции, полученные из печени обожженных крыс, облучали 1 мин в камере для экстракорпорального облучения. В опытах in vivo животным с ожогом через 1 час после термотравмы вводили внутрибрюшинно донорскую эршрощггарную массу (2,5 мг/кг), предварительно облученную ( время экспозиции - 1 мин). Контролем служили животные с ожогомт которым через час после термотравмы вводили необлученную донорскую эритроцнгарную массу в той же дозе. Концентрацию белка в субклеточных фракциях и крови определяли по методу Лоури в модификации (Coakley et al.s 1978; Dawson, Heatlic, 1984). Кровь крыс для исследований забирали из шейной артерии и стабилизировали раствором цитрата натрия (3,8%) в соотношении 9:1. Для определений использовали гемолизат эритроцитов в дистиллированной воде в соотношении 1:40.
Активность и кинетические показатели альдегиддегидрогеназы печени и эритроцитов крыс в норме и при ожоге
Иммуиогистохимическим методом показано, что АДГ локализуется у человека в желудочно-кишечном тракте, почках, эндокринных железах, мозге. Фермент сосредоточен преимущественно в цитозольной фракции, хотя не исключается возможность его взаимодействия с мебранами. НАД-зависимая АДГ-І окисляет первичные, вторичные и циклические спирты. Первичные спирты окисляются до альдегидов, вторичные до кетонов. Ингибиторами фермента являются вещества, связывающие цинк или взаимодействующие с SH-гругаіами: 8 - оксихинолин, фенатролин, этилендиаминтетрауксусная кислота, бипиридин, 4 - метилпиразол, меркаптоэтанол (Cheng, Lek, 1992). Конкурентными ингибиторами АДГ являются галогенсодержащие субстраты: трихлорэтанол, хлоралгидрат, а также фенилгидразин. Значительно меньше известно об активаторах АДГ. Так, очищенный фермент из печени крыс активируется дезоксихолатом натрия (1мМ) и другими желчными кислотами. Показана активация АДГ печени путем гликозилировання (Mcpherson etal, 1988),
Кроме того, естественные продукты лактатдегидрогеназной реакции, лактат и пируват, в аномально высоких концентрациях считаются компонентами МСМ (Корячкин, Страшное, 2002). Нами установлено, что при ожоге происходит снижение активности не только АлДГ, но и ЛДГ как в прямой, так и в обратной реакции и АДГ в разных фракциях гепатоцитов (табл, 2). Так активность ЛДГобр достоверно уменьшается в гомогенате на 86%, в ци-тозоле - на 36%, в М2 митохондриях - на 43% по сравнению с интактными животными. Активность АДГобр достоверно снижается в гомогенате на 51%, в цитозоле - на 62%, в М2-митохондриях - на 36% по сравнению с интактными животными. Активность ЛДГпр уменьшается достоверно в гомогенате на 58%, в М2-митохондриях - на 66% по сравнению с интактными животными.
Проведен корреляционный анализ между величинами активности АлДГ и ЛДГ. Корреляционный анализ выявил различия во взаимосвязях ме-яоду ЛДГ и АлДГ у интактных и обожженных животных. При термической травме существует высокая степень положительной корреляции между активностями ЛДГ в прямой реакции и АлДГ в М2-митоховдриальной фракции (г = 0,995; р 0,0001).
В проведенных опытах было показано, что основная активность ЛДГ и АДГ интактных животных обнаруживается в цигоплазматической фракции печени, в которой сосредоточено 85% суммарной активности ЛДГпр, 89% -ЛДГобр, 83% - АДГобр, в Ml-митохондриях - 6% ЛДГпр, 5%ЛДГо6р, 2%АДГо6р, в М2-митоходриях 9%ЛДГпр, 7%ЛДГобр, 8%АДГобр. Распределение активностей ЛДГ и АДГ у животных с термической травмой аналогично распределению активности ферментов в нормальной печени крыс (рис. 2) на фоне более низкой общей активности во всех фракциях печени.
Однако снижение активности ЛДГ в прямой и обратной реакциях при термической травме сопровождается увеличением соотношения активностей ЛДГ в прямой реакции к активности ЛДГ в обратной реакции в гомогенате и цитозоле печени, а также в эритроцитах, что сопровождается повышением содержания пирувата и снижением количества НАД, который расходуется в прямой лактатдегидрогеназной реакции. Увеличение пирувата и снижение НАД, являющегося коферментом для АлДГ, отрицательно сказываются на активности АлДГ В литературе отмечено, что при интоксикации уменьшается отношение активностей АлДГ/АДГ наряду с изменениями каталитических параметров ферментов и изоферментаого спектра АлДГ, что определяет увеличение содержания в крови ацетальдегида (Кершенгольц и др., 1985).
Уменьшение активностей ЛДГ и АДГ при термической травме сопровождается снижением каталитической эффективности ферментов во всех фракциях гепатоцитов. Сродство фермента ЛДГпр к субстрату уменьшается в М2 митохондриях в 3 раза, в цитоплазматической фракции Kt АДГ реакции увеличивается в 3 раза (табл. 3).
Из литературы известно, что кинетические свойства, характерные для ферментативной реакции, катализируемой ЛДГпр, аналогичны АлДГ: высокое сродство к субстрату и высокий показатель каталитической эффективности присущи цитоплазматической ЛДГпр. АлДГ в субклеточных фракциях печени интактных крыс различаются по величинам Kt, Vmax и Vmax/K.t для ацетапьдегида: цитоплазмахичекая АлДГ в отличие от АлДГ Ml и М2 мято-хондриальных фракций обладает высоким сродством к ацетальдегиду и характеризуется более высоким показателем каталитической эффективности. R.Lindahl и 3. Evces (1984) указывают, что изоферменты АлДГ, идентифицированные как в митохондриальной, так и в микросомальной фракциях, различаются между собой специфичностью к субстратам и коферментам, по ин-гибированию дисульфирамом и по изоэлектрическим точкам.
В опытах in vitro выявлено, что лактат оказывает положительное, а пи-руват - отрицательное влияние на активность АлДГ печени и эритроцитов интактных и ожоговых крыс (рнс.З). Под влиянием лактата активность АлДГ интактных крыс достоверно увеличивается в цитоплазматической фракции -на 80%, в Ml-митохондриях - на 71%, в М2-митохондриях - на 65%. Под влиянием пирувата активность АлДГ достоверно уменьшается в цитоплазматической фракции печени на 66%, в М2-митохондриях - на 50%.
