Введение к работе
Актуальность проблемы. Болезни печени включают в себя обширную полиэтиологическую группу заболеваний человека, в которую входят такие поражения печени как холецистит, холелитиаз, печеночноклеточная недостаточность, гепатиты, цирроз и опухоли печени. Эти заболевания приводят как к значительному ухудшению качества жизни пациентов, так во многих случаях и к смерти. В разных странах злокачественные новообразования печени составляют от 2% до 50% всех опухолей, и при этом доля их постоянно увеличивается (Aguayo and Patt, 2001, Patel, 2002, Slattery and Sahani, 2006). За последние десятилетия уровень смертности от рака печени также растет, при этом данный тип заболевания наиболее трудно диагностируется и плохо поддается лечению.
Пролактин, гормон передней доли гипофиза, регулирует широкий спектр функций различных типов клеток, и может секретироваться местно как аутокринный регулятор многих типов клеток, включая опухолевые (Bole-Feysot et al., 1998, Clevenger et al., 2003). В организме млекопитающих пролактин участвует в регуляции роста, дифференцировки, размножения, метаболизма, поведения, иммуномодуляции и осморегуляции (Bole-Feysot et al., 1998). Пролактин является также важным регулятором функций печени, где он индуцирует пролиферацию гепатоцитов и холангиоцитов (Орлова с соавт, 19996, Piccoletti et al, 1997, Orlova et al, 1998, Smirnova and Orlova, 1999), регулирует рост и дифференцировку гепатоцитов (Розен и др., 1991, Zabala and Garcia-Ruiz, 1989, Crowe et al, 1991, Berlanga et al, 1995), осуществляет соматогенные эффекты (Murphy et al, 1988), регулирует обмен и экзокринные функции гепатоцитов (Bole-Feysot et al., 1998). Пролактин реализует свои эффекты, взаимодействуя с рецепторами (РПрл), относящимися к семейству рецепторов цитокинов (Смирнов, 2006). У млекопитающих описано несколько функционально различных изоформ РПрл, образующихся в результате альтернативного сплайсинга (Bole-Feysot et al., 1998). Длинная изоформа РПрл опосредует основные изученные эффекты пролактина посредством активации конститутивно ассоциированной с рецептором тирозинкиназы JAK2 (Janus kinase 2) и транскрипционных факторов STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription). Короткие изоформы РПрл традиционно считаются негативными регуляторами JAK/STAT сигнализации, т.к. не способны активировать STAT белки. С другой
стороны, эффекты коротких изоформ РПрл связывают с тканеспецифическими
сигналами пролактина (Duan et al, 1997, Nokelainen et al, 1998, Russell and Richards, 1999). При этом функциональные особенности действия пролактина на клетки определяются типом ткани-мишени, а также соотношением изоформ РПрл, характерным для данной ткани.
Печень является одной из центральных мишеней пролактина, и экспрессия РПрл в ней находится на высоком уровне, а также зависит от пола: у особей женского пола уровень РПрл выше, чем у мужского (Розен В.Б., 1991, Smirnova et al., 1994). Хорошо известно, что опухолевые процессы в печени характеризуются увеличенной пролиферацией различных клеток печени, изменением соотношения ее клеточных элементов, структуры печеночной дольки и, как следствие, нарушением сложной и многогранной функции печени. В литературе встречаются данные, полученные на человеке и животных, которые свидетельствуют о повышении экспрессии РПрл в клетках печени и изменении их компартментализации, в частности появлении интенсивной экспрессии РПрл в ядрах клеток, в условиях активной пролиферации (Орлова и др., 1998, Смирнова и др., 1998, Garcia-Caballero, 2000). А в последнее время, появились прямые и косвенные доказательства того, что появление рецепторов некоторых факторов роста и цитокинов, в частности, рецепторов родственного пролактину гормона роста, коррелирует с пролиферативным статусом клеток, и конститутивной активацией JAK/STAT пути (Mertani et al., 2003, Conway-Campbell et al., 2007). С другой стороны, роль пролактина в процессе гепатоканцерогенеза остается не изученной.
Цель и задачи исследования. Исходя из вышесказанного, целью настоящей работы было исследование особенностей экспрессии рецепторов пролактина в опухолях различных типов клеток печени человека и крыс, как основы для оценки вклада пролактина в развитие этих опухолей.
Для реализации поставленной цели нами были сформулированы следующие задачи:
1. Сравнить характер экспрессии РПрл в печени человека при различных заболеваниях печени, таких как холецистит, обструктивный холестаз разной этиологии, первичные и вторичные опухоли печени, для определения объектов дальнейших экспериментальных исследований на моделях животных. Демонстрация того, что в первичных опухолях разных типов клеток печени человека, а также в удаленной от опухоли ткани печени, выявляются значимые изменения как уровня
экспрессии РПрл, так и их компартментализации, позволило нам выбрать для дальнейших исследований два типа опухолей печени крыс разного клеточного происхождения: перевиваемые линии гепатоцеллюлярного рака Н27 и холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1, и сформулировать дальнейшие задачи:
Охарактеризовать экспрессию мРНК основных маркеров разных типов клеток печени и возможность секреции пролактина в клетках печеночных трансплантатов перевиваемых опухолей печени Н27 и РС-1 крыс.
Оценить интенсивность экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах опухолей гепатомы Н27 и слизистого рака РС-1.
Исследовать характер компартментализации РПрл во внутрипеченочных трансплантатах опухолей гепатомы Н27 и слизистого рака РС-1.
Проанализировать зависимость от пола экспрессии РПрл во внутрипеченочных трансплантатах Н27 и РС-1.
Изучить в ткани печени животного-реципиента взаимное влияние клеток опухолей и клеток окружающей ткани на экспрессию и характер компартментализации РПрл.
Исследовать уровень мРНК РПрл и соотношение ее изоформ в клетках гепатомы Н27 и слизистого рака РС-1.
Научная новизна. Установлено, что у человека уровень экспрессии РПрл в первичных опухолях печени разного клеточного происхождения выше, чем при других заболеваниях печени. Внутрипеченочные трансплантаты гепатоцеллюлярной карциномы Н27 и холангиоцеллюлярного рака РС-1 крыс, представляющие собой животные модели разных типов рака печени, также характеризуются повышенной экспрессией РПрл, по сравнению с клетками печени интактных животных. Обнаружено, что в клетках внутрипеченочного трансплантата РС-1, в отличие от Н27, возможна аутокринная регуляция развития опухоли пролактином. Показано, что внутрипеченочные трансплантаты холангиоцеллюлярного слизистого рака РС-1 характеризуются интенсивной аккумуляцией РПрл в ядрах клеток. Выявлено также, что характерная для печени половая дифференцировка экспрессии РПрл с преобладанием у самок сохраняется как в опухолевых клетках внутрипеченочных трансплантатов гепатомы Н27 и холангиокарциномы РС-1, так и в окружающих и удаленных от опухолей гепатоцитах. Данная тенденция в целом наблюдается и у человека при различных заболеваниях печени. В клетках гепатомы Н27 при
внутрипеченочной трансплантации выявляется «классическая» для нормальных гепатоцитов гормональная регуляция экспрессии РПрл, позитивно зависимая от эстрогенов, и негативно - от андрогенов. Кроме того, присутствие внутрипеченочного трансплантата опухолей Н27 или РС-1 в значительной степени влияет на окружающие и удаленные от опухоли ткани, а характер влияния зависит от типа опухоли и пола животного-реципиента, при этом аналогичные данные получены и на человеке. Показано, что ткань печени значительно влияет на опухоль в зависимости от ее типа: в случае РС-1 индуцирует увеличение экспрессии РПрл и аккумуляцию их в ядрах опухолевых клеток, а в опухоли Н27 у животных обоих полов индуцирует увеличение доли мРНК длинной изоформы РПрл, при сравнении с культурой клеток гепатомы Н27. Установлено, что доля мРНК длинной изоформы РПрл растет в клетках внутрипеченочного трансплантата Н27 у крыс обоего пола, а в клетках внутрипеченочного трансплантата РС-1 - только у самцов, по сравнению с печенью интактных животных.
Теоретическая значимость работы определяется тем, что в ней наглядно продемонстрирована возможность и важность участия пролактина в патогенезе различных типов заболеваний и опухолей печени человека и крыс; установлена половая дифференцировка экспрессии РПрл в опухолях печени; показано также взаимовлияния опухоли и ткани печени.
Практическая значимость работы состоит в том, что результаты исследования позволяют обосновать новые подходы для зависимой от пола терапии опухолей печени, а также возможности использования признака ядерной аккумуляции РПрл при диагностике холангиокарциномы, и лечения этого заболевания с помощью лекарств на основе прямой ядерной доставки в клетки опухоли.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на 8ой Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов» (Москва, 2001), 11ой Европейской неделе по гастроэнтерологии (Мадрид, 2003), Двухгодичных научных встречах международной ассоциации по изучению печени (Сан-Сальвадор, 2004), Зем Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), 1ом съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005), 12ом Международном симпозиуме, посвященном вирусному гепатиту и болезням
печени (Париж, 2006) и на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ (Москва, 2007).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах, содержит 16 таблиц и 31 рисунок. Список литературы включает источников.
