Содержание к диссертации
Введение
1 Обзор литературы 14
1.1 Общая характеристика NO-пути в сосудах 14
1.1. Синтез и механизм действия оксида азота 14
1.1.2 Строение и принцип работы эндотелиальной NO-синтазы 15
1.1.3 Регуляция работы eNOS 16
1.1.3.1 Регуляция на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях 17
1.1.3.2 Другие механизмы долговременной регуляции eNOS 18
1.1.3.3 Механизмы кратковременной регуляции активности eNOS 20
1.2 Регуляция активности eNOS половыми гормонами 22
1.2.1 Локальный синтез и рецепторы эстрогенов в сосудистой системе 22
1.2.2 Влияние эстрогенов на экспрессию eNOS 24
1.2.3 Влияние эстрогенов на активность eNOS 25
1.3 Регуляция активности eNOS тиреоидными гормонами 28
1.3.1 Синтез тиреоидных гормонов и их рецепторы 29
1.3.2 Влияние тиреоидных гормонов на активность и экспрессию eNOS в
эндотелии сосудов 31
1.3.3 Взаимосвязь регуляторных влияний половых и тиреоидных гормонов 33
1.4 Изменения активности NO-пути в раннем постнатальном онтогенезе 34
2 Материалы и методы 40
2.1 Экспериментальные животные 40
2.1.1 Общая характеристика экспериментальных групп 40
2.1.2 Хроническая блокада эстрогеновых рецепторов типа / и ароматазы в раннем постнатальном периоде 41
2.1.2.1 Характеристика препаратов 41
2.1.2.2 Протокол введения 42
2.1.3 Модель антенатального гипотиреоза 42
2.1.3.1 Характеристика препарата 43
2.1.3.2 Протокол введения 43
2.2 Эксперименты in vivo 44 2.2.1 Изготовление катетеров 44
2.2.2 Вживление катетеров 45
2.2.3 Установка для измерения артериального давления 46
2.2.4 Исследование реакций на метоксамин и L-NAME 46
2.2.5 Обработка результатов 47
2.3 Определение показателей крови 48
2.3.1 Получение сыворотки крови 48
2.3.2 Определение содержания гормонов методом иммуноферментного анализа 48
2.3.3 Протокол измерения содержания метаболитов NO в образцах сыворотки крови 49
2.4 Эксперименты на изолированных сосудах 50
2.4.1 Объекты исследования 50
2.4.2 Исследование сокращения в изометрическом режиме 51
2.4.2.1 Нормализация (определение оптимального растяжения сосуда) 52
2.4.2.2 Активация препарата 53
2.4.2.3 Фармакологические агенты, использовавшиеся в экспериментах на изолированных сосудах 54
2.4.2.4 Протоколы экспериментов 56
2.4.2.4.1 Протокол экспериментов по исследованию блокады продукции оксида азота в эндотелии 56
2.4.2.4.2 Протокол экспериментов по исследованию чувствительности гладкой мышцы артерий к донору оксида азота 57
2.4.2.4.3 Обработка результатов 58
2.5 Исследование уровня экспрессии мРНК методом полимеразной цепной реакции 2.5.1 Приготовление образцов мРНК 60
2.5.2 Синтез комплементарной ДНК 61
2.5.3 Количественная ПЦР или ПЦР в реальном времени 62
2.5.4 Обработка результатов количественной ПЦР 63
2.6 Статистическая обработка результатов 63
3 Результаты 65
3.1 Исследование активности NO-пути у 2-недельных и взрослых крыс на системном уровне 65
3.1.1 Изменения параметров системной гемодинамики после блокады NO-синтазы
3.1.2 Содержание продуктов метаболизма NO в крови 67
3.2 Исследование активности NO-пути в резистивных артериях различных органов у крыс разного возраста 68
3.2.1 Изменение диаметра и сократимости артерий с возрастом 68
3.2.2 Влияние блокады продукции NO на сократительные ответы артерий брыжейки 69
3.2.3 Влияние блокады продукции NO на сократительные ответы подкожной артерии 70
3.2.4 Влияние блокады продукции NO на сократительные ответы артерии икроножной мышцы 74
3.2.5 Влияние блокады продукции NO на сократительные ответы артерий почки 76
3.2.6 Чувствительность гладкой мышцы артерий различных органов к NO 78
3.2.7 Уровни экспрессии мРНК eNOS и аргиназы-2 в артериях различных органов
3.2.8 Заключение по результатам исследования активности NO-пути в артериях крыс разного возраста 82
3.3 Исследование влияния эстрогенов на NO-зависимую регуляцию тонуса артерий в раннем постнатальном онтогенезе 83
3.3.1 Сравнительный анализ состояния эстрогеновой системы у 2-недельных и взрослых крыс 83
3.3.1.1 Содержание половых гормонов в сыворотке крови 2-недельных и взрослых крыс 83
3.3.1.2 Уровни экспрессии мРНК -типа эстрогеновых рецепторов в артериях 84
3.3.2 Исследование эффектов хронической блокады эстрогеновых рецепторов типа
/ на активность NO-пути в артериях 2-недельных крыс 85
3.3.2.1 Влияние блокады ER/ на реакции подкожной артерии 86
3.3.2.2 Влияние блокады ER/ на реакции артерий брыжейки 88
3.3.2.3 Влияние хронической блокады ER/ на содержание метаболитов NO в крови 2-недельных крыс 89
3.3.3 Уровни экспрессии мРНК мембранного рецептора GPR30 в артериях 2 недельных и взрослых крыс 90
3.3.4 Исследование эффектов хронической блокады ароматазы на активность NO пути в артериях 2-недельных крыс 91
3.3.4.1 Влияние хронической блокады ароматазы на содержание метаболитов NO в крови 2-недельных крыс 92
3.3.4.2 Влияние блокады ароматазы на реакции подкожной артерии 92
3.4. Исследование влияния тиреоидных гормонов на NO-зависимую регуляцию тонуса артерий в раннем постнатальном онтогенезе 95
3.4.1 Сравнительный анализ продукции и рецепции тиреоидных гормонов у 2 недельных и взрослых крыс 95
3.4.1.1 Содержание тиреоидных гормонов в сыворотке крови 95
3.4.1.2 Уровни экспрессии мРНК генов, регулирующих влияние тиреоидных гормонов в артериях 96
3.4.2 Эффекты блокады синтеза тиреоидных гормонов на беременных самок и их потомство 98
3.4.3 Эффекты антенатального гипотиреоза на активность NO-пути в артериях 2-недельных крыс 102
3.4.3.1 Влияние блокады синтеза тиреоидных гормонов на реакции подкожной артерии и артерий брыжейки 102
3.4.4 Влияние блокады синтеза тиреоидных гормонов на экспрессию генов в стенке артерий 107
4 Обсуждение результатов 109
4.1 Основные результаты исследования 109
4.2 Активность NO-пути выше в организме 2-недельных крыс по сравнению со взрослыми 109
4.2.1 Антиконстрикторный эффект NO присутствует во многих сосудистых регионах 2-недельных крыс и уменьшается при взрослении 109
4.2.2 Уровни экспрессии аргиназы-2 в артериях 2-недельных крыс ниже, чем у взрослых 114 4.2.3 Изменения активности NO-пути у 2-недельных крыс на системном уровне 116
4.3 Влияние эстрогенов на NO-зависимую регуляцию тонуса артерий в раннем постнатальном онтогенезе 119
4.4 Влияние тиреоидных гормонов на NO-зависимую регуляцию тонуса артерий в раннем постнатальном онтогенезе 122
Заключение 126
Выводы 128
Список использованной литературы 129
- Синтез и механизм действия оксида азота
- Хроническая блокада эстрогеновых рецепторов типа / и ароматазы в раннем постнатальном периоде
- Исследование активности NO-пути в резистивных артериях различных органов у крыс разного возраста
- Антиконстрикторный эффект NO присутствует во многих сосудистых регионах 2-недельных крыс и уменьшается при взрослении
Введение к работе
Актуальность проблемы. Рост и развитие организма сопровождаются значительными изменениями в строении и функционировании сосудистого русла, которые необходимы для адекватного кровоснабжения органов и тканей в соответствии с их метаболическими потребностями. При этом формирование артериального русла в ходе развития организма происходит по-разному в разных органах, о чем свидетельствуют перераспределение сердечного выброса между органами и изменение кровотока в отдельных органах. Например, в таких органах как головной мозг, селезенка и почки кровоток по мере созревания организма растет, а в тонком кишечнике и коже – напротив, снижается; в скелетных мышцах он может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от их метаболических характеристик [Boegehold, 2010; Nankervis et al., 2001; Stulcov, 1977]. Следует отметить, что механизмы изменений артерий в раннем постнатальном онтогенезе изучены мало.
Важная роль в регуляции уровня системного артериального давления (АД) и кровоснабжения органов принадлежит эндотелию сосудов. В здоровом организме регуляторная роль эндотелия реализуется в секреции факторов, которые вызывают расслабление гладких мышц сосудистой стенки и/или ослабляют вазоконстрикторные влияния (т.н. антиконстрикторное влияние эндотелия) [Медведева, 2001; Мелькумянц, 2005]. Среди релаксирующих эндотелиальных факторов наиболее изученным и значимым является оксид азота. Ранее было показано, что эндотелий подкожной артерии 1-2 недельных крысят, в отличие от взрослых крыс, не только секретирует NO в ответ на дилятаторные агонисты, но и тонически продуцирует NO, что приводит к ослаблению сократительных ответов этой артерии; такое влияние эндотелия у молодых крыс связано с повышенной экспрессией и активностью эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) [Gaynullina et al., 2013]. Вместе с тем остается неясным, существует ли повышенная продукция NO в эндотелии других сосудистых регионов и является ли этот механизм важным для формирования уровня системного артериального давления, который в раннем постнатальном периоде значительно ниже, чем в последующие периоды жизни. Второй неясный вопрос состоит в том, под влиянием каких факторов может формироваться такой «неонатальный» фенотип секреции эндотелия сосудов.
В настоящее время установлено, гормоны, которые циркулируют в крови и/или локально синтезируются в сосудистой стенке, оказывают влияние на различные функции эндотелия. Во-первых, среди гормональных систем следует выделить эстрогеновую. Существует большое количество данных о протекторных эффектах эстрогенов на сердечно-сосудистую систему, связанных в первую очередь с влиянием на функции эндотелия. Известно, что у женщин степень эндотелий-зависимой дилятации варьирует в течение менструального цикла и увеличивается при заместительной гормональной терапии эстрогенами после наступления менопаузы [Duckles, Miller, 2010]. На культуре эндотелиальных клеток было описано прямое потенцирующее действие эстрадиола на экспрессию eNOS [MacRitchie et al., 1997]. Эстрогены также могут регулировать активность eNOS: хроническое введение эстрогенов
овариэктомированым самкам приводит к увеличению продукции NO в артериях мозга, что связано с повышением уровня активирующего фосфорилирования eNOS и снижением уровня экспрессии кавеолина-1, ингибитора eNOS [Schreihofer et al., 2010; Stirone et al., 2005]. Основываясь на этих наблюдениях, можно предположить, что эстрогены могут стимулировать продукцию NO эндотелием и в раннем постнатальном периоде, ведь известно, что их содержание в крови крыс в первые дни после рождения выше, чем во взрослом возрасте [Cheng, Johnson, 1973; Ojeda et al., 1975; Weisz, Gunsalus, 1973].
Во-вторых, недавно было продемонстрировано, что продукция NO в эндотелии сосудов находится под контролем тиреоидных гормонов. Как повышение, так и снижение секреторной активности щитовидной железы сопровождаются изменениями сопротивления периферических сосудов [Danzi, Klein, 2012]. Например, введение трийодтиронина приводит к увеличению эндотелий-зависимого расслабления за счет повышения содержания белка eNOS и продукции NO [Bssemaker et al., 2003]. Так как гормоны щитовидной железы играют ключевую роль в регуляции роста и развития организма, дифференцировки практически всех клеток и тканей [Смирнов, 2008], можно предположить, что в сферу влияния тиреоидной системы входит и эндотелий сосудов. Однако роль тиреоидных гормонов в ранней регуляции секреторной активности эндотелия практически не изучена.
Целью данной работы было оценить антиконстрикторное влияние эндогенно продуцируемого NO в артериях разных органов у самцов крыс 2-недельного возраста по сравнению со взрослыми и изменения такого влияния при хроническом подавлении действия эстрогенов и тиреоидных гормонов.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Сравнить активность NO-пути в организме 2-недельных и взрослых крыс по изменению уровня артериального давления после блокады синтеза NO и содержанию метаболитов NO в крови.
-
Сравнить показатели активности NO-пути в артериях тонкого кишечника, кожи, скелетной мышцы и почки у крыс разного возраста по изменению сократительных реакций при блокаде продукции NO в эндотелии, чувствительности гладкой мышцы к NO и уровню экспрессии мРНК белков, которые могут влиять на синтез NO.
-
Исследовать влияние блокады эстрогеновых рецепторов и ароматазы в раннем постнатальном периоде на показатели активности NO-пути в артериях крыс 2-недельного возраста.
-
Исследовать изменения активности NO-пути в организме 2-недельных крыс при потреблении тиреостатика пропилтиоурацила самками в период беременности и вскармливания.
Научная новизна работы. Результаты, полученные в данной работе, развивают наши представления о NO-зависимой регуляции сокращения артерий гемодинамически важных органов в раннем постнатальном онтогенезе. Впервые в результате комплексного исследования активности NO-пути в артериальных сосудах показано, что в раннем постнатальном периоде в артериях многих органов оксид азота оказывает мощный антиконстрикторный
эффект, который градуально уменьшается при взрослении. Впервые установлено, что уровень артериального давления у 2-недельных крысят в бодрствующем состоянии подвержен более значительной регуляции оксидом азота, чем у взрослых животных, что может быть одним из механизмов поддержания артериального давления на низком уровне. Принципиальная новизна работы состоит в том, что в ней проведено исследование регуляторных последствий антенатального гипотиреоза в отношении секреторной активности сосудистого эндотелия. Полученные данные являются уникальными и демонстрируют важную роль тиреоидных гормонов в модуляции активности пути оксида азота в артериях крыс в раннем постнатальном периоде.
Практическая значимость работы. Значимость настоящей работы для фундаментальной и практической медицины обусловлена тем, что в последнее время у новорожденных детей все чаще обнаруживаются патологические изменения функционирования сердечно-сосудистой системы. Такие нарушения могут развиваться как во время внутриутробного развития, так и после рождения ребенка, и приводить к серьезным заболеваниям в последующие годы жизни, если не предпринимать попыток их медикаментозной коррекции. В работе раскрыты регионарные особенности регуляции тонуса артериальных сосудов, которые следует принимать во внимание при определении путей коррекции возможных нарушений органного кровообращения. Данные о механизмах влияния антенатального гипотиреоза на регуляцию тонуса кровеносных сосудов в раннем постнатальном онтогенезе указывают, что при выборе фармакологического способа коррекции нарушений сосудистой системы в раннем возрасте необходимо принимать во внимание не только особенности регуляции сосудов в данном сосудистом регионе, но и гормональный статус организма.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Продуцируемый эндотелием оксид азота оказывает мощный антиконстрикторный эффект в артериях тонкого кишечника, кожи и скелетных мышц 2-недельных крысят, такое влияние градуально снижается по мере взросления.
-
Эстрогены не являются специфическими регуляторами повышенной активности NO-пути в организме 2-недельных крыс.
-
Тиреоидные гормоны в антенатальном и раннем постнатальном периодах оказывают потенцирующее действие на продукцию оксида азота в артериях тонкого кишечника, а также на системном уровне.
Апробация материалов диссертации. Основные результаты
диссертационной работы были представлены на съезде Немецкого
физиологического общества (Регенсбург, Германия, 2011), на XX
Международном симпозиуме по резистивным сосудам (Ребилд, Дания, 2011), на Международных научных конференциях «Ломоносов – 2011» и «Ломоносов – 2013» (Москва, 2011, 2013), на съезде Скандинавского физиологического общества (Берген, Норвегия, 2011), на V Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2012),
на XI и XII Всероссийских с международным участием научных школах-конференциях по механизмам адаптации растущего организма к физической и умственной нагрузке (Казань, 2012, 2014), на совместном съезде Обществ по микроциркуляции и сосудистой биологии Германии и Нидерландов (Мангейм, Германия, 2012), на XXII съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Волгоград, 2013), на Х Международном симпозиуме «Биологическая подвижность: новые факты и гипотезы» (Пущино, 2014) и на совместном съезде Европейского общества по гипертензии и Международного общества по гипертензии (Афины, Греция, 2014). Диссертация апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (протокол № 41 от 19 мая 2014 г.).
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ №13-04-02087-а и №14-04-31377-мол_а и субсидии Минобрнауки России (соглашение между Минобрнауки России и ГНЦ РФ-ИМБП РАН №14.604.21.0029). При проведении исследований использовалось оборудование, приобретенное за счет средств Программы развития Московского университета.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, и 16 тезисов докладов на отечественных и международных конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142____ страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения полученных данных, заключения и выводов. Список литературы включает 136 источников. Работа иллюстрирована 7 таблицами и 32 рисунками.
Синтез и механизм действия оксида азота
Рост и развитие организма сопровождаются значительными изменениями в строении и функционировании сосудистого русла, что необходимо для адекватного кровоснабжения органов и тканей в соответствии с их метаболическими потребностями. При этом формирование артериального русла в ходе развития организма происходит по-разному в разных органах, о чем свидетельствуют перераспределение сердечного выброса между органами и изменение кровотока в отдельных органах. Например, в таких органах как головной мозг, селезенка и почки кровоток по мере созревания организма растет, а в тонком кишечнике и коже – напротив, снижается; в скелетных мышцах он может увеличиваться или уменьшаться, в зависимости от их метаболических характеристик [Boegehold, 2010; Nankervis et al., 2001; Stulcov, 1977]. При этом следует отметить, что механизмы органоспецифических изменений артерий в раннем постнатальном онтогенезе изучены мало.
Важная роль в регуляции уровня системного артериального давления и кровоснабжения органов принадлежит эндотелию сосудов. В здоровом организме регуляторная роль эндотелия реализуется в секреции факторов, которые вызывают расслабление гладких мышц сосудистой стенки и/или ослабляют вазоконстрикторные влияния (т.н. антиконстрикторное влияние эндотелия) [Медведева, 2001; Мелькумянц, 2005]. Среди релаксирующих эндотелиальных факторов наиболее изученным и значимым является оксид азота. Ранее было показано, что эндотелий подкожной артерии 1-2 недельных крысят, в отличие от взрослых крыс, не только секретирует NO в ответ на дилятаторные агонисты, но и тонически продуцирует NO, что приводит к ослаблению сократительных ответов этой артерии; такое влияние эндотелия у молодых крыс связано с повышенной экспрессией и активностью эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) [Gaynullina et al., 2013]. Вместе с тем остается неясным, существует ли повышенная продукция NO в эндотелии других сосудистых регионов и является ли этот механизм важным для формирования уровня системного артериального давления, который в раннем постнатальном периоде значительно ниже, чем в последующие периоды жизни. Второй неясный вопрос состоит в том, под влиянием каких факторов может формироваться такой «неонатальный» фенотип секреторной активности сосудистого эндотелия.
В настоящее время установлено, что важная роль в регуляции функций эндотелия принадлежит эндокринной системе и гормонам, которые циркулируют в крови и/или локально синтезируются в сосудистой стенке. Во-первых, среди гормональных систем следует выделить эстрогеновую. Существует большое количество данных о протекторных эффектах эстрогенов на сердечно-сосудистую систему, связанных в первую очередь с влиянием на функции эндотелия. Известно, что степень эндотелий-зависимой дилятации варьирует в течение менструального цикла и увеличивается при заместительной гормональной терапии эстрогенами у женщин после наступления менопаузы [Duckles, Miller, 2010]. На культуре эндотелиальных клеток было описано прямое потенцирующее действие эстрадиола на экспрессию eNOS [MacRitchie et al., 1997]. Эстрогены также могут регулировать активность eNOS: хроническое введение эстрогенов овариэктомированым самкам приводит к увеличению продукции NO в артериях мозга, что связано с повышением уровня активирующего фосфорилирования eNOS и снижением уровня экспрессии кавеолина-1, ингибитора eNOS [Schreihofer et al., 2010; Stirone et al., 2005]. Основываясь на перечисленных выше наблюдениях, можно предположить, что эстрогены могут стимулировать продукцию NO эндотелием и в раннем постнатальном периоде, ведь известно, что их содержание в крови крыс в первые дни после рождения выше, чем во взрослом возрасте [Cheng, Johnson, 1973; Ojeda et al., 1975; Weisz, Gunsalus, 1973].
Во-вторых, недавно было продемонстрировано, что продукция NO в эндотелии сосудов находится под контролем тиреоидных гормонов. Показано, что тиреоидные гормоны вызывают эндотелий-зависимое расслабление артерий in vitro, хотя механизм такого действия изучен недостаточно [Barreto-Chaveset et al., 2011]. С другой стороны, известно, что как повышение, так и снижение секреторной активности щитовидной железы приводит к изменению сопротивления периферических сосудов [Danzi, Klein, 2012]. Например, введение трийодтиронина сопровождается увеличением эндотелий-зависимого расслабления за счет повышения содержания белка eNOS и продукции NO [Bssemaker et al., 2003]. Так как гормоны щитовидной железы играют ключевую роль в регуляции роста и развития организма, дифференцировки практически всех клеток и тканей [Смирнов, 2008], можно предположить, что в сферу влияния тиреоидной системы входит и эндотелий сосудов. Однако роль тиреоидных гормонов в ранней регуляции секреторной активности эндотелия и в становлении органоспецифического кровообращения не изучена.
Целью данной работы было оценить антиконстрикторное влияние эндогенно продуцируемого NO в артериях разных органов у самцов крыс 2-недельного возраста по сравнению со взрослыми и изменения такого влияния при хроническом подавлении действия эстрогенов и тиреоидных гормонов.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Сравнить активность NO-пути в организме 2-недельных и взрослых крыс по изменению уровня артериального давления после блокады синтеза NO и содержанию метаболитов NO в крови.
2. Сравнить показатели активности NO-пути в артериях тонкого кишечника, кожи, скелетной мышцы и почки у крыс разного возраста по изменению сократительных реакций при блокаде продукции NO в эндотелии, чувствительности гладкой мышцы к NO и уровню экспрессии мРНК белков, которые могут влиять на синтез NO.
3. Исследовать влияние блокады эстрогеновых рецепторов и ароматазы в раннем постнатальном периоде на показатели активности NO-пути в артериях крыс 2-недельного возраста.
4. Исследовать изменения активности NO-пути в организме 2-недельных крыс при потреблении тиреостатика пропилтиоурацила самками в период беременности и вскармливания.
Хроническая блокада эстрогеновых рецепторов типа / и ароматазы в раннем постнатальном периоде
Анализ данных литературы показал, что при хроническом введении ICI 182,780 новорожденным крысам используют дозы от 0.5 мг/кг до 3 мг/кг [Hilakivi-Clarke et al., 1997; Lee, 1998], для введения летрозола также используют сходный диапазон доз [Kondarewicz et al., 2011; Speert et al., 2007]. В данной работе оба вещества вводили в дозе 1 мг/кг один раз в сутки с первого дня жизни до дня, предшествующего взятию в эксперимент. Навески веществ разводили в ДМСО, в результате получали маточные растворы с концентрацией 5 мг/мл, которые аликвотили и хранили при -20С. Непосредственно перед введением аликвоты размораживали и разводили персиковым маслом до концентрации 400 мкг/мл. Полученные растворы вводили крысятам подкожно в области холки из расчета 2.5 мкл на грамм массы тела крысенка. Крысятам контрольной группы вводили аналогичный объем смеси ДМСО и персикового масла. Использование масла обеспечивает депонирование веществ и их постепенное высвобождение в промежутки времени между инъекциями.
Для определения количества вводимого препарата крысят ежедневно взвешивали (весь помет целиком), начиная с первого дня постнатальной жизни. Объем вводимых веществ был одинаковым для всех крысят в помете, поскольку его рассчитывали с учетом среднего веса крысенка в помете.
Эффективность действия блокаторов оценивали по относительной массе матки (для антиэстрогена ICI 182,780) или по содержанию эстрадиола в сыворотке крови (для летрозола). Эксперименты проводили параллельно на крысятах-самцах из групп «ICI», «Летрозол» и «Контроль», возраст крысят составлял 14-15 дней.
Половозрелых самок подсаживали в клетку к самцам на ночь и на следующее утро брали влагалищные мазки. Если в мазке обнаруживали сперматозоиды, этот день считали первым днем беременности. В таком случае самок помещали в индивидуальные клетки и начинали вести учет потребления воды и прироста массы тела в ходе беременности. Самкам экспериментальной группы с первого дня беременности в питьевую воду добавляли PTU.
Согласно данным литературы, PTU вызывает дозозависимое подавление секреторной функции щитовидной железы. При добавлении беременным самкам в питьевую воду в концентрации 0.0003% (3 ppm) PTU вызывает умеренное снижение содержания тиреоидных гормонов в крови новорожденных крысят, в то время как в большей концентации (10-12 ppm) он приводит к выраженному снижению содержания тиреоидных гормонов и к соматическим и неврологическим нарушениям у потомства [Chakraborty et al., 2012; Shibutani et al., 2009; Taylor et al., 2008]. В нашей работе самки потребляли раствор тиреостатика в концентрации 0.0005% (5 ppm). Для этого PTU сначала растворяли в дистиллированной воде в концентрации 0.05% (0.5 мг/мл). Затем полученный маточный раствор непосредственно в поилке разводили в 100 раз питьевой водой. Доза вещества составляла в среднем 0.7 мг/кг/сутки.
Тиреостатик добавляли в питьевую воду в течение 5 недель, то есть до достижения крысятами 2-недельного возраста. Раствор PTU и воду в поилках сменяли каждые 2-3 дня и замеряли количество потребления воды самками группы «PTU» и «Контроль». Наряду с этим самок взвешивали каждые 5 дней в течение беременности. Крысят взвешивали на 1 и 7 дни после рождения (весь помет целиком), а также непосредственно перед взятием в эксперимент.
Эксперименты проводили параллельно на крысятах-самцах из групп «PTU» и «Контроль», возраст крысят составлял 14-15 дней.
В экспериментах по оценке показателей системной гемодинамики использовали 2-недельных и взрослых самцов. Проводили вживление катетеров в правую сонную артерию, для регистрации системного артериального давления (АД), и правую яремную вену, для введения веществ.
Катетеры изготавливали из полиэтиленовых трубок трех видов: 1) толстой (наружный диаметр 0.97 мм, внутренний – 0.58 мм; 2) средней толщины (наружный диаметр 0.6мм, внутренний – 0.28 мм); 3) тонкой (наружный диаметр 0.5 мм, внутренний – 0.2 мм). Катетеры для взрослых крыс изготавливали из толстой трубки (участок для подключения к установке) и трубки средней толщины (участок для вставления в сонную артерию или яремную вену). Катетеры для 2-недельных крыс изготавливали, из толстой трубки (участок для подключения к установке), однако в артерию или в вену вставляли более тонкую трубку. Отрезки трубок надевали на металлическую проволоку и в месте соединения герметично спаивали над паяльником. Перед операцией катетеры заполняли раствором гепарина (500 Ед/мл) и затыкали кусочками лески. 2.2.2 Вживление катетеров
Операцию проводили под эфирным наркозом, который подавали капельным способом. Взрослых крыс помещали ненадолго в эксикатор с парами эфира, затем в течение операции использовали эфирную маску. 2-недельных крыс наркотизировали с использованием эфирной маски. Длительность операции не превышала 60 минут, по ее окончании животные просыпались в течение 15 минут. 2-недельных крыс во время операции помещали на грелку брюшной стороной вверх, для поддержания нормальной температуры тела, препаровку проводили под бинокулярным микроскопом (МБС-10, Россия).
Над вентральной поверхности шеи удаляли шерсть, операционное поле обрабатывали спиртом и делали разрез кожи длиной 1 см. Жировую и мышечную ткань раздвигали пинцетами. Стеклянным крючком отделяли от окружающих тканей участок правой общей сонной артерии и подводили под нее лигатуру, смоченную в физиологическом растворе. Лигатуру плотно завязывали, как можно ближе к дистальному концу выделенного участка артерии. Далее под артерию подводили глазной пинцет так, чтобы пережать артерию и остановить кровоток в выделенном участке. После этого подводили вторую лигатуру и заготавливали узел, который будет фиксировать катетер в артерии. Стенку артерии надрезали вблизи дистальной бранши пинцета, край разреза приподнимали тонким пинцетом и вводили кончик катетера. Вторую лигатуру завязывали на один узел, чтобы она слегка придерживала кончик катетера и не давала вытекать крови (после того, как будет убран пережимающий пинцет). Затем, придерживая катер в сосуде пинцетом, убирали пережимающий пинцет и осторожно продвигали катетер на по направлению к сердцу. Фиксирующую лигатуру затягивали туже, после чего завязывали на ней второй узел. Рядом накладывали еще одну лигатуру.
Катетер в яремную вену вставляли так же, как в артерию. После окончания операции, периферические концы катетеров протягивали под кожей с помощью зонда и выводили в кожный разрез в межлопаточной области. Далее оба разреза зашивали, и приступали к регистрации артериального давления.
Исследование активности NO-пути в резистивных артериях различных органов у крыс разного возраста
Анализ данных литературы показал, что при хроническом введении ICI 182,780 новорожденным крысам используют дозы от 0.5 мг/кг до 3 мг/кг [Hilakivi-Clarke et al., 1997; Lee, 1998], для введения летрозола также используют сходный диапазон доз [Kondarewicz et al., 2011; Speert et al., 2007]. В данной работе оба вещества вводили в дозе 1 мг/кг один раз в сутки с первого дня жизни до дня, предшествующего взятию в эксперимент. Навески веществ разводили в ДМСО, в результате получали маточные растворы с концентрацией 5 мг/мл, которые аликвотили и хранили при -20С. Непосредственно перед введением аликвоты размораживали и разводили персиковым маслом до концентрации 400 мкг/мл. Полученные растворы вводили крысятам подкожно в области холки из расчета 2.5 мкл на грамм массы тела крысенка. Крысятам контрольной группы вводили аналогичный объем смеси ДМСО и персикового масла. Использование масла обеспечивает депонирование веществ и их постепенное высвобождение в промежутки времени между инъекциями.
Для определения количества вводимого препарата крысят ежедневно взвешивали (весь помет целиком), начиная с первого дня постнатальной жизни. Объем вводимых веществ был одинаковым для всех крысят в помете, поскольку его рассчитывали с учетом среднего веса крысенка в помете.
Эффективность действия блокаторов оценивали по относительной массе матки (для антиэстрогена ICI 182,780) или по содержанию эстрадиола в сыворотке крови (для летрозола). Эксперименты проводили параллельно на крысятах-самцах из групп «ICI», «Летрозол» и «Контроль», возраст крысят составлял 14-15 дней.
Половозрелых самок подсаживали в клетку к самцам на ночь и на следующее утро брали влагалищные мазки. Если в мазке обнаруживали сперматозоиды, этот день считали первым днем беременности. В таком случае самок помещали в индивидуальные клетки и начинали вести учет потребления воды и прироста массы тела в ходе беременности. Самкам экспериментальной группы с первого дня беременности в питьевую воду добавляли PTU.
Согласно данным литературы, PTU вызывает дозозависимое подавление секреторной функции щитовидной железы. При добавлении беременным самкам в питьевую воду в концентрации 0.0003% (3 ppm) PTU вызывает умеренное снижение содержания тиреоидных гормонов в крови новорожденных крысят, в то время как в большей концентации (10-12 ppm) он приводит к выраженному снижению содержания тиреоидных гормонов и к соматическим и неврологическим нарушениям у потомства [Chakraborty et al., 2012; Shibutani et al., 2009; Taylor et al., 2008]. В нашей работе самки потребляли раствор тиреостатика в концентрации 0.0005% (5 ppm). Для этого PTU сначала растворяли в дистиллированной воде в концентрации 0.05% (0.5 мг/мл). Затем полученный маточный раствор непосредственно в поилке разводили в 100 раз питьевой водой. Доза вещества составляла в среднем 0.7 мг/кг/сутки.
Тиреостатик добавляли в питьевую воду в течение 5 недель, то есть до достижения крысятами 2-недельного возраста. Раствор PTU и воду в поилках сменяли каждые 2-3 дня и замеряли количество потребления воды самками группы «PTU» и «Контроль». Наряду с этим самок взвешивали каждые 5 дней в течение беременности. Крысят взвешивали на 1 и 7 дни после рождения (весь помет целиком), а также непосредственно перед взятием в эксперимент.
Эксперименты проводили параллельно на крысятах-самцах из групп «PTU» и «Контроль», возраст крысят составлял 14-15 дней.
В экспериментах по оценке показателей системной гемодинамики использовали 2-недельных и взрослых самцов. Проводили вживление катетеров в правую сонную артерию, для регистрации системного артериального давления (АД), и правую яремную вену, для введения веществ.
Катетеры изготавливали из полиэтиленовых трубок трех видов: 1) толстой (наружный диаметр 0.97 мм, внутренний – 0.58 мм; 2) средней толщины (наружный диаметр 0.6мм, внутренний – 0.28 мм); 3) тонкой (наружный диаметр 0.5 мм, внутренний – 0.2 мм). Катетеры для взрослых крыс изготавливали из толстой трубки (участок для подключения к установке) и трубки средней толщины (участок для вставления в сонную артерию или яремную вену). Катетеры для 2-недельных крыс изготавливали, из толстой трубки (участок для подключения к установке), однако в артерию или в вену вставляли более тонкую трубку. Отрезки трубок надевали на металлическую проволоку и в месте соединения герметично спаивали над паяльником. Перед операцией катетеры заполняли раствором гепарина (500 Ед/мл) и затыкали кусочками лески. 2.2.2 Вживление катетеров
Операцию проводили под эфирным наркозом, который подавали капельным способом. Взрослых крыс помещали ненадолго в эксикатор с парами эфира, затем в течение операции использовали эфирную маску. 2-недельных крыс наркотизировали с использованием эфирной маски. Длительность операции не превышала 60 минут, по ее окончании животные просыпались в течение 15 минут. 2-недельных крыс во время операции помещали на грелку брюшной стороной вверх, для поддержания нормальной температуры тела, препаровку проводили под бинокулярным микроскопом (МБС-10, Россия).
Над вентральной поверхности шеи удаляли шерсть, операционное поле обрабатывали спиртом и делали разрез кожи длиной 1 см. Жировую и мышечную ткань раздвигали пинцетами. Стеклянным крючком отделяли от окружающих тканей участок правой общей сонной артерии и подводили под нее лигатуру, смоченную в физиологическом растворе. Лигатуру плотно завязывали, как можно ближе к дистальному концу выделенного участка артерии. Далее под артерию подводили глазной пинцет так, чтобы пережать артерию и остановить кровоток в выделенном участке. После этого подводили вторую лигатуру и заготавливали узел, который будет фиксировать катетер в артерии. Стенку артерии надрезали вблизи дистальной бранши пинцета, край разреза приподнимали тонким пинцетом и вводили кончик катетера. Вторую лигатуру завязывали на один узел, чтобы она слегка придерживала кончик катетера и не давала вытекать крови (после того, как будет убран пережимающий пинцет). Затем, придерживая катер в сосуде пинцетом, убирали пережимающий пинцет и осторожно продвигали катетер на по направлению к сердцу. Фиксирующую лигатуру затягивали туже, после чего завязывали на ней второй узел. Рядом накладывали еще одну лигатуру.
Катетер в яремную вену вставляли так же, как в артерию. После окончания операции, периферические концы катетеров протягивали под кожей с помощью зонда и выводили в кожный разрез в межлопаточной области. Далее оба разреза зашивали, и приступали к регистрации артериального давления.
Антиконстрикторный эффект NO присутствует во многих сосудистых регионах 2-недельных крыс и уменьшается при взрослении
Кроме эстрогенов, гормональными регуляторами активности eNOS являются тиреоидные гормоны [Hiroi et al., 2006]. Эти гормоны играют особенно важную роль в развитии организма в раннем постнатальном онтогенезе [Смирнов, 2009]. В связи с этим мы предположили, что тиреоидные гормоны могут оказывать влияние и на функцию эндотелия в раннем постнатальном онтогенезе, то есть потенцировать антиконстрикторный эффект NO в артериях крыс 2-недельного возраста. Проверке этой гипотезы был посвящен заключительный этап работы.
В щитовидной железе происходит синтез тироксина (Т4), который затем под действием ферментов-дейодиназ превращается в трийодтиронин (Т3), более активную гормональную форму. Анализ содержания тиреоидных гормонов в сыворотке крови крыс показал, что не только концентрация общего Т4 (рисунок 26А), но и содержание активного свободного Т3 (рисунок 26Б) гораздо выше в организме 2-недельных крыс по сравнению со взрослыми. Повышенное содержание тиреоидных гормонов в раннем постнатальном периоде говорит об их важной роли в регуляции роста и развития организма, возможно, и в регуляции функций сосудистого эндотелия. А
На рисунке 27А представлены данные по уровню экспрессии рецептора тиреоидных гормонов -типа (TR) в подкожной артерии и артериях брыжейки 2-недельных и взрослых крыс. Ген TR в равной степени экспрессируется в обеих артериях 2-недельных и взрослых крыс, причем статистически значимых различий между двумя типами артерий также не было обнаружено (рисунок 27А).
Ключевым ферментом локального превращения Т4 в Т3 в стенке артерий является дейодиназа 2 типа (D2) [Gereben et al., 2008]. Эксперименты показали, что в подкожной артерии уровни экспрессии мРНК D2 у 2-недельных и взрослых крыс не различаются (рисунок 27Б). При этом уровни экспрессии мРНК D2 в подкожной артерии молодых и взрослых крыс были значимо выше, чем в артериях брыжейки крыс соответствующего возраста. Важно, что в артериях брыжейки крысят уровень экспрессии мРНК D2 в несколько раз выше, чем в артериях взрослых крыс.
Таким образом, наряду с повышенным содержанием тиреоидных гормонов в крови у 2-недельных животных существует возможность более интенсивной локальной продукции Т3 в артериях брыжейки. На следующем этапе работы были проведены эксперименты по проверке гипотезы о потенцирующем влиянии тиреоидных гормонов на повышенную продукцию NO в эндотелии артерий 2-недельных крыс. Для этого у крыс моделировали антенатальный гипотиреоз путем ингибирования синтеза тиреоидных гормонов в организме матери с первого дня беременности и затем у крысят до достижения ими 2-недельного возраста.
В таблице 6 отражена динамика массы тела самок в течение беременности. Исходно и во время беременности масса тела самок в группах «Контроль» и в группе, получавшей ингибитор синтеза тиреоидных гормонов PTU (группа «PTU») статистически значимо не различались. Однако снижение массы тела после родов (сутки 22) в группе «PTU» было значимо больше, чем у контрольных самок. Потребление жидкости в группе «PTU» было немного ниже, чем в группе «Контроль». В начале беременности (9-й день) такие различия в потреблении жидкости могли быть связаны с влиянием PTU на метаболические процессы в организме самок, а после родов (22 и 24 дни) – с влиянием PTU на массу тела.
Длительность беременности у двух групп самок не различалась и составляла примерно 22 дня. Также не различалось количество крысят в помете: 8.1±0.6 в группе «Контроль» и 8.4±0.9 в группе «PTU». Однако масса тела крысят в первый день жизни в группе «PTU» была статистически значимо меньше, чем в контрольной группе: 6.1±0.4 г и 7.3±0.2 г соответственно (p 0.05).
Измерение содержания тиреоидных гормонов в крови самок и их крысят самцов через 2 недели после рождения показало, что содержание общего Т4 в крови самок группы «PTU» и их потомства сильно снижено по сравнению с соответствующими контрольными группами животных (рисунок 28А). Концентрации свободного Т4 (рисунок 28Б) в крови самок, получавших PTU, была также снижена по сравнению со значениями у контрольных самок, однако содержание свободного Т3 (рисунок 28В) не изменилось. В крови 2-недельных самцов группы «PTU» содержание свободного Т4 было значительно снижено по отношению к здоровым 2-недельным самцам, кроме того, в этой группе наблюдалось снижение концентрации свободного Т3. Полученные результаты позволяют говорить, что применение PTU привело к мягкому гипотиреозу у самок и к более выраженному гипотиреозу у их потомства.
В дополнение к измерению гормонов была проведена оценка содержания метаболитов NO в крови 2-недельных крыс с антенатальным гипотиреозом. На рисунке 29 видно, что суммарное содержание нитритов и нитратов в крови крысят группы «PTU» значительно ниже, чем в группе «Контроль». Такие данные говорят о возможном нарушении продукции NO в организме 2-недельных крыс с гипотиреозом.
Несмотря на различие в диаметре и максимальной силе сокращения относительные (нормированные на максимальный ответ) сократительные реакции подкожной артерии на МХ у крысят групп «Контроль» (рисунок 30А) и «PTU» (рисунок 30Б) не различались. Также не различались эффекты блокады продукции NO в эндотелии (рисунок 30). Как в контроле (рисунок 30А) так и в группе «PTU» (рисунок 30Б) L-NNA вызывал развитие спонтанного тонического сокращения, наряду с этим наблюдался сдвиг кривой «L-NNA» влево относительно кривой «D-NNA». При наложении графиков друг на друга (рисунок 30В) видно, что соответствующие кривые («L-NNA» или «D-NNA») в группах «Контроль» и «PTU» не различаются. Также между группами «Контроль» и «PTU» не было обнаружено различий в чувствительности гладкой мышцы препаратов с удаленным эндотелием к донору NO (рисунок 30Г).
В артериях брыжейки группы «PTU» (рисунок 31Б) также не наблюдалось изменений относительных (нормированных на максимальный ответ) сократительных реакций в ответ на МХ, по сравнению с группой «Контроль» (рисунок 31А). Однако в отличие от подкожной артерии в артериях брыжейки под действием PTU произошло изменение эффектов блокады NO-синтазы в эндотелии: действие L-NNA на артерии крысят с антенатальным гипотиреозом проявлялось в меньшей степени, чем в контроле. Так, вызванное L-NNA спонтанное тоническое сокращение и сдвиг кривой «L-NNA» в группе «PTU» (рисунок 31Б) были меньше, чем в контрольной группе (рисунок 31А). При наложении двух графиков (рисунок 31В) четко видно, что кривая «L-NNA» для группы «PTU» лежит правее, чем для группы «Контроль», различие между этими зависимостями статистически значимо. Величина вызванного L-NNA тонического сокращения в группе «PTU» также меньше, чем в группе «Контроль».
Наряду с этим в группе «PTU» по сравнению с контролем было обнаружено увеличение реакций артерий брыжейки с удаленным эндотелием к донору NO, что может отражать компенсаторное повышение чувствительности гладкой мышцы к NO при снижении его продукции в артериях крысят с антенатальным гипотиреозом.
Полученные данные дают основание полагать, что тиреоидные гормоны оказывают потенцирующее действие на NO-зависимую регуляцию тонуса артерий брыжейки у крыс в раннем постнатальном онтогенезе.
Похожие диссертации на Регионарная специфичность и механизмы гормональной регуляции продукции оксида азота эндотелием артерий у крыс в раннем постнатальном онтогенезе
