Содержание к диссертации
Введение
CLASS 2. Обзор литературы 1 CLASS 3
2.1. Ренин-ангиотензиновая система 13
2.1.1. Общая характеристика ренин-ангиотензиновой системы 13
2.1.2. Центральная и периферическая ренин-ангиотензиновая система 18
2.1.3. Общая характеристика физиологической активности и механизм действия ангиотензина II и ангиотензина IV 24
2.1.4. Пути и способы введения ангиотензина II и ангиотензина IV в организм с целью исследования физиологической роли этих пептидов 31
2.1.5. Тахифилаксис при введении ангиотензина II и ангиотензина IV 33
2.2. Ангиотензин ii и ангиотензин iv в работе сердечно-сосудистой системы 36
2.2.1. Ангиотензин II и ангиотензин IV в регуляции тонуса сосудов и уровня артериального давления 36
2.2.2. Ангиотензин II и ангиотензин IV в регуляции работы сердца 45
2.3. Ангиотензин ii и ангиотензин iv в регуляции поведения 50
2.3.1. Ангиотензин II и ангиотензин IV в регуляции питьевого? поведения 50
2.3.2. Ангиотензин II и ангиотензин IV в регуляции поведения на модели «tail-flick»-TecT 52
2.3.3. Ангиотензин II и ангиотензин IV в других поведенческих моделях 56
2.4. Индивидуальный подход в исследованиях поведения 66
CLASS 3. Экспериментальная часть 7 CLASS 2
3.1. Объекты и методьшсследования 72
3.1.1. Экспериментальные животные 72
3.1.2. Исследуемые вещества 72
3.1.3. Пути и способы введения ангиотензина II и ангиотензина IV в организм 73
3.1.4. Канюли, их вживление в боковые желудочки мозга крыс и микроинъекции исследуемых веществ 74
3.1.5. Контроль локализации канюль 75
3.1.6. Осмотические мини-насосы, их подготовка и имплантация экспериментальным животным 76
3.1.7. Исследование индивидуальных характеристик животных на модели оборонительного поведения с применением «tail-flick»-TecTa 77
3.1.8. Исследование влияния ангиотензина II и ангиотензина IV на динамику артериального давления и показатели работы сердца у крыс 82
3.1.9. Обучение животных сложному приобретенному навыку добывания воды в специальном автоматизированном устройстве и анализ индивидуальных характеристик его реализации 83
3.1.10. Методы статистической обработки данных 89
3.2. Результаты экспериментальных исследований 90
3.2.1. Анализ участия ангиотензина II и ангиотензина IV (при их внутрибрюшинном и внутрижелудочковом введении) в реализации индивидуальных характеристик оборонитель ного поведения у крыс с применением «tail-flick»-TecTa 90
3.2.1.1. Исследование участия ангиотензина II и ангиотензина IV при системном введении в индивидуальных механизмах оборонительного поведения у крыс на модели «tail-flick»-TecT 93
3.2.1.2. Исследование участия ангиотензина II и ангиотензина IV при внутрижелудочковом введении в индивидуальных механизмах оборонительного поведения у крыс на модели «tail-flick»-TecT 117
3.2.1.3. Общее заключение 139
3.2.2. Изучение влияния ангиотензина II и ангиотензина IV (при их внутрибрюшинном и внутрижелудочковом введении) на динамику артериального давления и показатели работы сердца у крыс с выявленными индивидуальными характеристиками реализации оборонительного поведения 141
3.2.2.1. Влияние ангиотензина-II и ангиотензина IV (при внутрибрюшинном введении) на динамику артериального давле-ния> и показатели работы сердца у крыс с выявленными индивидуальными характеристиками реализации оборонительного поведения, 141
3.2.2.2. Влияние ангиотензина II и ангиотензина IV (при внутрижелудочковом введении) на динамику артериального давления и показатели работы сердца у крыс с выявленными индивидуальными характеристиками реализации оборонительного поведения 148
3. Реализация оборонительного поведения на модели «tail-flick»-TecT и величины артериального давления и частоты сердечных сокращений у крыс 155
CLASS 4. Общее заключение 15 CLASS 6
Определение общих и специфических черт участия ангиотензина II и ангиотензина IV в индивидуальных механизмах приобретенного питьевого поведения крыс 159
1. Исследование участия ангиотензина II и ангиотензина IV при системном пролонгированном введении в реализации индивидуальных характеристик сложного питьевого поведения крыс 161
2. Исследование участия ангиотензина II и ангиотензина IV при внутрижелудочковом введении в реализации индивидуальных характеристик сложного питьевого поведения крыс 185
3. Общее заключение 205
Обсуждение результатов 209
Выводы 239
Список публикаций по теме диссертации 241
Список литературы 243
Условные обозначения 277
- Общая характеристика ренин-ангиотензиновой системы
- Пути и способы введения ангиотензина II и ангиотензина IV в организм
- Осмотические мини-насосы, их подготовка и имплантация экспериментальным животным
- Исследование участия ангиотензина II и ангиотензина IV при системном пролонгированном введении в реализации индивидуальных характеристик сложного питьевого поведения крыс
Введение к работе
Ренин-ангиотензиновая система (РАС) одна из обширных систем организма, обладающая широким спектром физиологической активности. Эффекторными компонентами РАС являются ангиотензины [Е. Savaskan, 2005; О. von Bohlen und Halbach, 2003, 2006].
Ангиотензин II (А-П) - основной физиологически активный пептид РАС. Имеются данные о наличии специфических АТГ и АТг-рецепторов к А-П [D. Т. Dinh et al., 2001; М. D. de Gasparo et al., 2000; W. G. Thomas and F. A. O. Mendelsohn, 2003]. Как известно, А-П - основной- эффекторный пептид РАС. Он вовлекается в механизмы жажды и питьевого поведения [Р. Я. Власенко, 2003; А. В. Котов с соавт., 2002, 2005; J. Т. Fitzslmons, 1998], в регуляцию солевого аппетита [J. Т. Fitzsimons, 1998], облегчает реакции избегания при стимуляции эмоциогенных зон гипоталамуса [В. В. Шерстнев, В. И. Бадиков, 1978], участвует в механизмах эмоционального стресса [I. Armando et al., 2001], становлении алкогольной зависимости [К. В. Судаков, 2004], а также вовлекается в процессы научения и памяти [J. J. Braszko et al., 1988, 2003, 2004, 2006; J. W. Wright et al., 2002, 2004]. На уровне-вегетативных функций А-П вызывает, повышение симпатотонуса [М. D. Hendel and J. P. Collister, 2005; N. Lu et al., 2004]; вазоконстрикцию сосудов [S. Kim and H. Iwao, 2001; R. M. Touyz and E. L. Schiffrin, 2000], снижение тонуса блуждающего нерва [С. Wicher et al., 1999], выделение антидиуретического гормона, синтез и секрецию альдостерона [L. A. A. Camargo et al., 2002; Е. Savaskan, 2005], усиливает пролиферацию и миграцию эндотелиальных и гладкомышечных клеток в стенках сосудов [R. М. Touyz and Е. L. Schiffrin, 2000] и др.
Ангиотензин IV (A-IV) представляет собой 3-8 фрагмент октапептида А-П и долгое время считался неактивным метаболитом [J .L. Lavoie and С. D. Sigmtmd, 2003; J. W. Wright, J. W. Harding, 1997; O. von Bohlen und Halbach, 2003]. Данные последних лет свидетельствуют о том, что" A-IV обладает самостоятельной активностью и вызывает уникальные эффекты [J. W. Wright and J. W. Harding, 1997; О. von Bohlen und Halbach, 2003; O. von Bohlen und Halbach, D. Albrecht, 2006]. Однако к настоящему времени A-IV изучен недостаточно, его функции в физиологическом плане в полной мере не определены [A. L. Albiston et al., 2004]. Установлены лишь пути образования и деградации A-IV [D. Chansel et al., 1998], обнаружены рецепторы к нему и показано, чтоАТ4-рецепторы являются регулированной инсулином аминопептидазой (IRAP) [A. L. Albiston et al., 2001; W. G. Thomas,.?. A. O. Mendelsohn, 2003], определена их локализация в мозге млекопитающих [S. Y. Chai et al., 2001; J. W. Wright, J. W. Harding, 1997]. Структура самого АТ4-рецептора окончательно не ясна, остаетсЯіДО конца неизвестным каскад внутриклеточных процессов, запускаемый при активации АТ4-рецептора [Е. Savaskan, 2005; О. von Bohlen und Halbach, 2003]. Исследования поведенческих эффектов A-IV также немногочисленны. По данным J. Lee et al. (2001, 2004), Е. S. Pederson et al. (2001), J. Tchekala-rova et al. (2001), J. W. Wright et al. (1999, 2002), A-IV при внутрижелудоч-ковом (в/ж) введении улучшает способность к решению пространственных задач у крыс и влияет на память. J. J. Braszko et al. (1988, 2004, 2006) показали, что в/ж введение A-IV стимулирует исследовательское локо-моторное поведение, облегчает запоминание, например, в реакциях пассивного избегания. В основе этого лежат конкретные нейрофизиологические процессы, протекающие с участием A-IV. Так, например, было обнаружено, что A-IV усиливает долговременную потенциацию в поле СА1 гип-покампа [Е. А. К ramar et al., 2001], а также в зубчатой извилине [М. J. Wayner et al., 2001]. Показано, что по сравнению с А-И, в/ж введение A-IV в физиологических дозах не вызывает жажду у необученных животных [J. W. Wright et al., 1988, 1993]. Недостаточно изучено влияние A-IV на мозговой и периферийный кровоток. Показано лишь, что A-IV усиливает мозговой кровоток, вызывая вазодилатацию сосудов [Е. A. Kramar et. al., 1997, 1998]. A-IV при в/ж и системном введении способен вызывать кратковременное повышение системного артериального давления (АД) у крыс [A. D. Кауе et al., 1996; J. A. D. М. Tonnaer et al., 1982]. Эффекты A-IV на периферийный кровоток неоднозначны. Согласно литературным данным, на периферии A-IV может действовать и как вазодилататор [S. Chen eta 1., 2000; Т. A. Hamilton eta 1., 2001; I. Moelleret al, 1999; J. M. Patel et al., 1998], и как вазоконстриктор [S. M. Fitzgerald et al., 1999; Q. Li et al, 1997; L. Loufrani et al, 1999] .
Таким образом, A-II и A-IV обладают широким спектром физиологической активности, эти олигопептиды не только регулируют водно-солевой баланс организма и деятельность сердечно-сосудистой системы (GCC), но и влияют главным образом на оборонительное и питьевое поведение. В связи с тем, что в основе указанных форм поведения лежат разные мотивации, направленность эффектов одного и того же пептида в этих ситуациях может быть различной. Так, установлено, что А-П затрудняет реализацию ноцицеп-тивного оборонительного поведения [J. W. Wright, J. W. Harding, 1997]. На модели «tail-flick» показано, что А-П либо повышает [V. Raghavendra et al., 1999; N. Toma et al, 1997], либо не изменяет [R. A. Cridland, J. L. Henry, 1988; А. В. Котов с соавт., 2005] величины болевых порогов. В то же время А-П инициирует жажду и приобретенное питьевое, поведение животных. A-IV, напротив, облегчает оборонительное поведение [J.W.Wright, J.W.Harding, 1997; О. von Bohlen und Halbach, 2003], однако данные о влиянии A-IV на показатели в «tail-flick»ecTe в литературе нам не встречались. Также не было обнаружено данных о влиянии A-IV на реализацию сложного питьевого навыка. Таким образом, участие А-П и A-IV в реализации оборонительного и питьевого поведения изучено не окончательно и представляет интерес. В литературе обычно исследуются лишь отдельные дозозависимые эффекты ангиотензинов на ту или иную функцию организма. Работ, посвященных исследованию системного действия А-П с учетом индивидуальных реакций животных на их введение, в современной литературе крайне мало (например, Р. Я. Власенко, 2003); а для A-IV нами вообще не обнаружено. В связи с этим, использование индивидуального подхода [П. В. Симонов, 1993; К. В. Судаков, 1997] и рассмотрение поведения каждой особи с системных позиций [П. К. Анохин, 1968; К. В. Судаков, 1997] представляется актуальным и может дать наиболее полное представление об участии вазо-активных пептидов А-П и A-IV в регуляции поведения.
Общая характеристика ренин-ангиотензиновой системы
РАС - одна из полифункциональных и физиологически значимых систем организма. Эффекторными компонентами РАС являются ангиотензины — регуля-торные пептиды (РП) широкого спектра действия. По современным представлениям РАС участвует в регуляции уровня АД и водно-солевого баланса организма, в процессах почечной фильтрации и реабсорбции, вовлекается в процессы научения, памяти и мотивированное поведение. Кроме того, РАС участвует в синтезе ивысвобождении-ряда гормонов (альдостерон, антидиуретический-гормон) и медиаторов (дофамин, серотонин, компоненты опиатной системы), что объясняет широкий спектр физиологического действия ангиотензинов. К настоящему времени показано существование не только гуморальной, но и тканевой РАС, расположенной и функционирующей в центральной нервной системе (ЦНС), сердце, сосудах, надпочечниках, а также в других органах и тканях [А. В. Котов с соавт., 2002, 2005; С. М. Толпыго, 2000; Е. Savaskan, 2005; О. von Bohlen und Halbach, 2003, 2006; J. W. Wright and J. W. Harding, 1997].
Существует 2 номенклатуры для ангиотензинов: в первой используются римские цифры для нумерации ангиотензинов и она наиболее широко используется, а вторая основана на указании последовательности аминокислот, которая составляет ангиотензин I (A-I). Рецепторы? к ангиотензинам принято сокращенно обозначать AT с указанием подтипа, обычно, в виде подстрочного индекса [Т. L. Goodfriend et al., 1996].
Общая схема образования A-II и A-IV в организме представлена на рис. 1. Общим предшественником всех ангиотензинов является ангиотензиноген.
Ангиотензиноген - а2-глобулин, образующийся в печени и состоящий из 452 аминокислотных остатков с молекулярной массой около 50 кД [Р. Я. Власенко, 2003; R. М. Carey et el., 2003; U. N. Das, 2005].
Ренин - фермент, который образуется из проренина и хранится в юкстаг-ломерулярных клетках почечных афферентных артериол. Снижение кровоснабжения почек при падении АД или кровопотере стимулируют высвобождение ренина [Физиология человека, 1996]. Ренин является одноцепочечной ас-партиловой протеазой с периодом полужизни 10-20 минут [U. N. Das, 2005].
Высвобождаясь в кровь, ренин гидролизует пептидную связь в молекуле ангиотензиногена и отщепляет N-концевой декапептид A-I [О. von Bohlen und Halbach, 2003; J. W. Wright and J. W. Harding, 1997]. Данные современной литературы показывают, что существует два принципиально различных механизма превращения ангиотензиногена - зависимый и независимый от ренина, причем первый преобладает в кровяном русле, а второй - в тканях [Р. Я. Власенко, 2003] и, в том числе, в мозге [К. Yanai et al., 2000]. Ренин действует на ангиотензиноген только при значениях рН, близких к нейтральным [Р. Я. Власенко, 2003]. Данные о том, что ренин присутствует в мозге лишь в низких концентрациях, способствовали поиску других ферментов, способных превращать мозговой ангиотензиноген в ан-гиотензины. В мозге крысы было показано существование изоренина, который отличается от ренина почек. Кроме того, катепсин D (совместно с ангиотензин-превращающим ферментом (АПФ)); катепсин G, тонин [К. Yanai et al., 2000], а также капликреин, эластаза, плазмин и тканевой фактор плазминогена обладают способностью превращать ангиотензиноген непосредственно в А-П [Р. Я. Власенко, 2003].
A-I служит субстратом для цинксодержащей дипептидиловой карбокси-пептидазы - АПФ, выявленного в плазме крови, эндотелиальных клетках, сердце, мозге, коре надпочечников, почках, нейронах, лейкоцитах, моноцитах, макрофагах, а также в гемато-энцефалическом барьере (ГЭБ) [U. N. Das, 2005; R. D. Egleton, Т. P. Davis, 2005; R. М. Touyz, Е. L. Schifrrin, 2000]. От A-I под действием АПФ отщепляются 2 терминальные аминокислоты с образованием окта-пептида А-П [О. Von Bohlen und Halbach, 2003], который является основным эф-фекторным пептидом РАС. Эта реакция протекает преимущественно в сосудах легких [Физиология человека, 1996]. Кроме того, A-I под действием пролило-вой и нейтральной эндопептидаз может превращаться в ангиотензин-(1-7); под действием аминопептидазы А- в ангиотензин- Ю) и под действием карбок-сипептидазы А - в А-(1-9) [Р. Я. Власенко, 2003; В. С. Berk, 1998]. Способностью превращать A-I в А-П помимо АЛФ обладает также химаза (40W, 41W) и, в меньшей степени, катепсин G, химостатин-чувствительный А-П-образующий фермент (CAGE), тонин, тканевой активатор плазминогена [Р. Я. Власенко, 2003; В. С. Berk, 1998; Z. J. Cheng et al., 2005; D. T. Dinh et el., 2001; J. L. Lavoie, C. D. Sigmund, 2003]. Физиологические эффекты А-П опосредуются через взаимодействие с АТУ и АТг-рецепторами [W. G. Thomas and F. А. О. Mendelsohn, 2003]. В присутствии аминопептидаз плазмы крови период полужизни А-П составляет не более 1 минуты [U. N. Das, 2005], в ликворе — в среднем около 20 с [R. Н. Abhold, J. W. Harding, 1988], а в тканях - до 20 минут [J. Misumi et al., 1983].
Пути и способы введения ангиотензина II и ангиотензина IV в организм
В работе использовали следующие пути введения А-П и A-IV: в/б, в/ж и системное пролонгированное. При тестировании одних и тех же животных по методике «tail-flick» и в исследованиях по оценке влияния А-П и A-IV на динамику САД и ЧСС применяли однократное в/б (доза 350 мкг/кг) и однократное в/ж введение (300 нг в 3 мкл физиологического раствора).
В экспериментах по изучению участия А-П и A-IV в реализации приобретенного питьевого поведения у крыс использовали системное пролонгированное введение с помощью осмотических мини-насосов (суммарная доза А-П и A-IV на 7 суток — 350 мкг/кг) и пятикратное в/ж введение (разовая доза 300 нг в 3 мкл физиологического раствора, выполняли одно введение в сутки непосредственно перед каждым тестированием). На питьевой модели также проводилась дополнительная» серия экспериментов с А-И-БСА при его системном пролонгированном (суммарная доза на 7 суток - 350 мкг/кг) и пятикратном в/ж введении (разовая доза 300 нг в 3 мкл). В каждом случае доза-для А-П-БСА рассчитывалась по количеству А-П, химически связанному с белком.
Выбранные разовые дозы для А-П при в/б введении [А. В. Котов с соавт., 2002] и при в/ж введении [А. В. Котов, П. А. Шестаков, 1998] были ранее определены как эффективные по критерию дипсогенного действия для крыс линии Вистар. A-IV брали в тех же дозах для сопоставления результатов.
Изготовление и вживление канюль проводили в соответствии с методикой, описанной в работе Р. Я. Власенко (2003). Канюли длиной 8 мм изготавливали из инъекционных игл диаметром 0.8 мм от шприцев «Рекорд». Для защиты от механических загрязнений каждую канюлю закрывали специальным мандреном, который фиксировался на её наружном конце.
Операцию проводили в два этапа. В первый день крыс под эфирным наркозом скальпировали, то есть удаляли мягкие ткани и надкостницу, поверхность черепа обрабатывали 3% раствором перекиси водорода для остановки кровотечения, а затем раствором бриллиантового зеленого. Во второй день крысам под наркозом (для крыс № 21-24 и № 31-35 в качестве наркоза был использован кетамин (внутримышечно, 10 мг/кг); для всех остальных крыс — эфир для наркоза) поверхность черепа протирали слабым спиртовым раствором, смачивали 3% раствором перекиси водорода и затем осторожно зачищали при помощи глазного скальпеля. Чистую кость черепа вновь обрабатывали слабым спиртовым раствором и при помощи специальной иглы осуществляли трепанацию. Каждому животному вживляли одну канюлю в один из боковых желудочков мозга в соответствии со следующими координатами стереотакси-ческого атласа мозга крыс [L. J. Pellegrino et al., 1979]: АР +1.0; L 2.0; Н 2.5. Вживленную- канюлю фиксировали с помощью самотвердеющей пластмассы. «Протакрил-М» (Украина, г. Харьков, АО «Стома»). Для усиления надежности крепления пластмассы к кости черепа, «нашлепку» формировали по всей площади скальпирования, не допуская контакта пластмассы с прилегающими мягкими тканями. После застывания протакрила канюлю закрывали мандреном. Раневые поверхности и прилегающие к ним ткани обрабатывали бриллиантовым зеленым. В послеоперационный период (обычно, 2 дня) крысы находились в индивидуальных клетках при свободном доступе к воде и пище.
Микроинъекции исследуемых веществ осуществляли с помощью мик-рошприца объемом 10 мкл ("Hamilton", USA) со специальным ограничителем. При этом из канюли осторожно извлекали мандрен и осуществляли медленное (в течение 15-20 с) введение раствора исследуемого вещества, затем канюлю вновь закрывали мандреном. В исследованиях на модели «tail-flick» и в экспериментах по оценке динамики САД и ЧСС в/ж введение крысам осуществляли в плексигласовом домике через пропиленный паз по методике, отработанной автором диссертации (рис. 3 В); крыс, задействованных в экспериментах на питьевой установке, осторожно фиксировали рукой.
Функциональная проба. По окончании экспериментов воднонасыщенных крыс помещали в индивидуальные боксы из плексигласа, оборудованные специальными градуированными поилками на 20 минут для адаптации. Затем в/ж вводили им раствор А-П в дозе 300 нг в 3 мкл физиологического раствора. Потребление воды в ответ на введение дипсогенного А-П рассматривали как физиологический контроль правильной локализации канюль [Р. Я. Власенко, 2003].
Морфологический контроль локализации канюль. Животным под эфирным наркозом.в/ж вводили 3 мкл синей туши, и перфузировали через левый желудочек сердца сначала физиологическим раствором в объеме 10мл; а затем 10 мл 10% раствора формалина. Крысу декапитировали и помещали голову в 10% раствор формалина на несколько дней. После этого мозг извлекали из черепной коробки и визуально оценивали точность вживления канюли на фронтальных срезах мозга по локализации пятна туши. Вживление канюли считали успешным при обнаружении туши хотя бы в одном из боковых желудочков мозга крысы [Е. Ю. Макаренко с соавт., 2003].
Осмотические мини-насосы, их подготовка и имплантация экспериментальным животным
Для обеспечения пролонгированного введения растворов исследуемых веществ были использованы осмотические мини-насосы производства фирмы "Alzet", USA (model 2001, срок действия - 7 суток, максимальный объем заполнения 232.7 ± 8.9 мкл, скорость высвобождения 1.067 ± 0.052 мкл / ч).
Осмотические мини-насосы (рис. 2) представляют собой капсулу, мембрана которой по составу является сложным эфиром целлюлозы (длина капсулы 2.5 см, диаметр 0.7 см, вес 1.1 г.). Мини-насосы имеют форму цилиндра, один конец которого полусферической формы, а другой - в виде плоской окружности с отверстием в центре. В комплекте к осмотическим мини-насосам прилагаются регуляторы равномерности тока жидкости, предназначенные для поддержания определенной скорости выхода раствора из помпы. Регулятор представляет собой стержень из нержавеющей стали со съемным полимерным куполообразным колпачком. Колпачок помещается на зафиксированном на металлической трубке наконечнике. Диаметр отверстия на плоской поверхности мини-насосов соответствует диаметру стержня регулятора тока жидкости. После заполнения осмотического мини-насоса исследуемым раствором необходимо до предела вставить трубку регулятора через отверстие капсулы, после этого помпа будет готова к работе [Инструкция к осмотическим мини-насосам].
Согласно инструкции, за сутки до имплантации животным мини-насосы заполняли растворами исследуемых веществ и помещали их в раствор 0.9% натрия хлорида для обеспечения постоянной скорости выхода вещества из помпы во внешнюю среду. Затем осмотические мини-насосы имплантировали всем крысам подкожно: животному в межлопаточной области делался небольшой разрез, через который помещалась помпа, разрез затягивали хирургическим шелком. Операцию проводили под легким эфирным наркозом. На следующие сутки после операции животных брали в эксперимент.
Эксперименты выполнены на 40 крысах-самцах (4 группы по 10 животных в каждой). Исследовали участие А-И и A-IV при в/б и в/ж введениях.
До начала экспериментов проводили предварительную адаптацию крыс к условиям опыта. Для этого животных помещали в плексигласовые «домики» с отверстием для хвоста на 20-25 минут. Процедуру повторяли 3 раза в разные дни. После этого крысы практически переставали проявлять беспокойство при посадке в «домик».
Для оценки оборонительного поведения у крыс использовали методику «tail-flick»ecT (прибор DS20 Socrel, Ugo ba sile, Italy). Прибор «tail-flick» представляет собой прямоугольную платформу, на которой свободно размещается крыса в «домике» со специальным отверстием для хвоста (рис. 3 А). При этом хвост животного находится под лампой прибора на? специальном металлическом «пятачке», в центре которого имеется датчик, который реагирует на свет (рис. 3 Г). Лампа прибора расположена на фиксированном расстоянии от платформы и не подлежит регулировке по высоте. Интенсивность светового луча составляла 9.2 по шкале установки прибора. При включении экспериментатором лампы прибора (посредством нажатия на педаль) сфокусированный луч света направляется на участок хвоста, находящийся на «пятачке». В момент включения лампы на встроенном в прибор секундомере автоматически начинается отсчет времени удержания крысой хвоста на «пятачке». Отведение хвоста в сторону приводит к попаданию светового пучка на фотоэлемент, встроенный в «пятачок» прибора, что автоматически останавливает отсчет времени на дисплее секундомера. Измеренный показатель представляет собой латентный период реакции отведения хвоста - ЛП РОХ. В связи с тем, что в лампе прибора «tail-flick» спектр отцентрирован в инфракрасном диапазоне, перед началом проведения «tail-flick»ecTa, участок хвоста крысы, на который будет наноситься раздражение, рекомендуется окрашивать чёрными чернилами, так как это обеспечивает наиболее быстрый и равномерный нагрев [К. Abe et al., 2003].
В настоящей работе для оценки индивидуальных характеристик оборонительного поведения у крыс использовали оригинальную методику «tail-flick»ecT с одновременной регистрацией ЭКГ [Ю. Б. Абрамов с соавт., 2006], отработанную ранее в лаборатории системных механизмов боли ГУ НИИ нормальной физиологии им. П. К. Анохина РАМН (руководитель -д.м.н. Ю. Б. Абрамов). Исследование проводили по схеме, составленной автором диссертации (рис. 4). Как в контрольном, так и в экспериментальном тестированиях животное сначала помещали в специальный плексигласовый «домик» с отверстием для хвоста и со встроенными датчиками для регистрации ЭКГ (прибор с крысой в «домике» представлен на рис. 3). Сразу после посадки в «домик» крысе окрашивали верхнюю срединную часть хвоста черными чернилами (рис.3 Г) и оставляли в «домике» на 20-25 минут для адаптации. Затем животному выполняли инъекцию физиологического раствора (в 1-ом, контрольном тестировании) или исследуемого вещества (во 2-ом, экспериментальном тестировании) и в последующие 23 минуты осуществляли 7 предъявлений в «tail-flick»ecTe через фиксированные апериодичные временные интервалы. Таким образом, предъявления осуществляли через 2, 4, 7, 10, 16, 20 и 23 минуты от момента инъекции физиологического раствора или исследуемого вещества
Исследование участия ангиотензина II и ангиотензина IV при системном пролонгированном введении в реализации индивидуальных характеристик сложного питьевого поведения крыс
Эксперименты выполнены на б крысах-самцах. Ранее исследование влияния А-П при системном пролонгированном введении на реализацию сложного приобретенного поведения крыс не проводилось. В течение 3-5 месяцев животных обучали сложному навыку добывания воды в специальном АУ. У обученных животных регистрировали исходные контрольные показатели реализации поведения (6 дней), затем оценивали показатели поведения у крыс в воднодепривированном состоянии на фоне системного пролонгированного введения А-И (5 дней), в последующем этих же животных тестировали в воднонасыщенном состоянии на фоне системного пролонгированного введения А-П (2 дня) и, наконец, у крыс регистрировали показатели поведения в последействии вновь в воднодепривированном состоянии (4 дня). Данный подраздел диссертации является составной частью дипломной работы автора диссертации (руководитель по физиологической части диплома -вед.н.с. лаборатории физиологии мотиваций ГУ НИИ НФ им П. К. Анохина РАМН к.м.н. С. М. Толпыго). Результаты исследований по пролонгированному введению А-И изложены в публикациях № 3, 4, 5, 9 и 10 по списку работ, опубликованных по теме диссертации. Исследование выполнено под руководством к.м.н. С. М. Толпыго, оборудование для экспериментов подготовлено и проверено к.б.н. Е. И. Певцовой.
По результатам оценки исходных контрольных показателей в группе крыс, которым пролонгированно вводили А-П (рис. 40, 41), число результативных актов находилось на стабильном уровне и составляло в среднем 6 актов, нерезультативные акты не наблюдались. Не. отмечались обращения к шторке, возникновения вертикальных стоек, инициации груминга, проявлений смещенных, стрессовых, невротических реакций, вздрагиваний, вокализации, а также уринации и дефекаций. В 94±7 % случаев крысы длительно не задерживались в стартовом отсеке, а практически сразу после выхода с тредбана стремились вновь повторить поведенческий акт. Частота возникновений катаний на диске в контроле составляла 36±6 %, катаний на тредбане — 23±7 %. В процедуре «допаивание» колебания объемов потребляемой сво-боднодоступной воды по данным 6 дней контрольного тестирования были? незначительны (16.9±1.7 мл/15 мин).
По числу результативных питьевых актов, выполняемых за время тестирования в АУ (по контрольным значениям), 4 особи, совершавшие в среднем 7.2±0.4 акта (крысы № 43, 44, 45 и 46) были охарактеризованы как животные с высоким уровнем мотивации, другие 2, совершавшие 4.5±0;8 акта (крыса № 42) и 2.2±0.4 акта (крыса № 41), - как особи со средней и низкой мотивацией соответственно.
Было обнаружено, что в условиях водной депривации постоянное поступление в организм А-П вызывало снижение числа результативных поведенческих актов у крыс независимо от уровня их мотивации (в среднем по группе с 6 до 4 актов, р 0.05, рис. 40). В то же время, у некоторых животных наблюдалось появление в отдельные дни тестирования единичных нерезультативных актов, а именно у крыс № 42 (средний уровень мотивации) и 43 (высокий уровень мотивации).
Наряду с этим, во время тестирования в АУ в воднодепривированном состоянии на фоне поступления в организм А-П у отдельных животных отмечались единичные проявления вертикальных стоек, инициации груминга и продолжительных застываний. Психоэмоциональные проявления в виде вертикальных стоек в условиях водной депривации наблюдались только у крысы № 43 с высоким уровнем мотивации, поэтому на рис. 40 видимых отклонений кривой экспериментального тестирования от кривой контрольных значе ний не наблюдается. Проявление реакций груминга выявлено у животного со средней мотивацией (крыса № 42) и с высокой мотивацией (крыса № 45). Длительные застывания отмечены у крыс № 41, 42, 43 и 45, т.е. независимо от уровня мотивации (индивидуальный пример для крысы № 43 на рис. 42). Однако у крыс с низкой мотивацией частота застываний была выше (рис. 40). Рассмотрим структуру поведенческого акта у крыс (рис. 41).
