Содержание к диссертации
Введение
II. Обзор литературы 12
1. Общая характеристика апоптоза 12
1.1. Роль апоптоза в многоклеточном организме 15
1.2. Морфологические процессы при апоптозе 19
1.3. Молекулярные процессы при апоптозе 21
1.3.1. Каспазы и их участие в апоптозе клеток 21
1.3.2. Пути реализации программированной клеточной гибели 25
2. Нейрогенез и апоптоз в зрелом мозге 33
3. Неапоптотические функции каспаз в нервной ткани 41
4. Участие каспаз в обеспечении механизмов памяти и обучения 44
III. Методы исследования 48
1. Экспериментальные животные и условия их содержания 48
2. Протокол использования веществ 48
3. Экспериментальные модели оценки поведения животных 49
3.1. Экспериментальные исследования на модели водного лабиринта Морриса 49
3.2. Экспериментальные исследования с использованием метода условно-рефлекторного замирания 52
3.3. Экспериментальные исследования с использованием методики угашения акустической стартл-реакции 54
4. Методы количественного определения активности каспазы-3 и межнуклеосомальной фрагментации ДНК в образцах ткани зрелого мозга крыс 57
5. Статистический анализ данных 63
CLASS IV. Результаты собственных исследований 6 CLASS 3
1. Влияние ингибитора активности каспаз z-VAD-fmk на формирование и консолидацию/хранение пространственного навыка в водном лабиринте Морриса 63
2. Действие ингибиторов каспаз z-VAD-fmk и z-DEVD-fmk на формирование, консолидацию/хранение и воспроизведение поведения замирания у крыс 69
3. Влияние специфического ингибитора каспазы-3 z-DEVD-fmk на формирование, хранение и воспроизведение долговременного угашения АСР и условного страха у крыс 74
4. Эффекты интрацеребровентрикулярного введения ингибитора каспазы-3 на биохимические показатели апоптоза в различных структурах зрелого мозга крыс 80
V. Обсуждение результатов 86
Выводы 97
Список использованной литературы 99
- Роль апоптоза в многоклеточном организме
- Каспазы и их участие в апоптозе клеток
- Влияние ингибитора активности каспаз z-VAD-fmk на формирование и консолидацию/хранение пространственного навыка в водном лабиринте Морриса
- Действие ингибиторов каспаз z-VAD-fmk и z-DEVD-fmk на формирование, консолидацию/хранение и воспроизведение поведения замирания у крыс
Введение к работе
Исследования апоптоза (программированной гибели клеток) в мозге относятся к числу наиболее приоритетных и актуальных в современной нейробиологии. Одним из центральных звеньев процесса апоптоза являются каспазы - семейство цистеинсодержащих протеолитических ферментов, расщепляющих пептидную связь у остатка аспартата (Chinnaiyan et al., 1996). Особое внимание уделяют каспазе-3, которую считают узловым фактором терминальной стадии апоптотической гибели нервных и глиальных клеток (Nunez, 1998, Robert et al., 2003, Yuan, Yankner, 2000, Timmer, Salvesen, 2007).
Получены убедительные свидетельства важной роли каспазозависимых процессов апоптоза в патогенезе многих распространенных заболеваний нервной системы (цереброваскулярные, нейродегенеративные заболевания и др.) (Гомазков 2006, Dlamini et al., 2004). Разрабатываются и применяются в клинике новые препараты, оказывающие специфическое воздействие на активность цистеиновых протеаз, в частности, созданные на основе ингибиторов каспаз (Barut et al., 2005; Liu et al., 2005; Narkilahti et al, 2003).
В настоящее время изучение роли каспаз в механизмах обучения и памяти находится на этапе все более активного экспериментального поиска (Гуляева 2003, Sherstnev et al., 2004, 2006; Gemma et al., 2005, Stepanichev et al., 2005; Huesmann, Clayton, 2006). Значительные сложности в разработке данной проблемы обусловлены тем, что факторы, вовлеченные в регуляцию апоптоза, могут принимать участие в других клеточно-молекулярных событиях, протекающих в нервной системе. Это в полной мере касается каспаз, которые непосредственно вовлечены в регуляцию клеточной гибели по типу апоптоза и, вместе с тем, регулируют клеточный цикл, пролиферацию, дифференцировку, а также пластические перестройки клеток мозга (Гуляева, 2003, Cohen, 1997, Concha and Abdel-Meguid, 2002). При экспериментальном изучении указанных вопросов широко используются ингибиторы активности каспаз (Fan et al., 2004). В ряде работ исследовано влияние ингибиторов каспаз на обучение, поведение и память. Так, ингибитор каспазы-1 нарушал выработку обстановочного условнорефлекторного страха у крыс (Gemma et al., 2005). Установлено, что у птиц привыкание к видоспецифической песне сопровождается быстрым (в течение нескольких минут) повышением уровня каспазы-3 в синаптических зонах дендритов нейронов тех отделов переднего мозга, активация которых связана с процессом привыкания (Huesmann, Clayton, 2006). Обнаружено, что ингибитор каспазы-3 блокирует длительную потенциацию в срезах гиппокампа и предотвращает развитие долговременного облегчения синаптической связи идентифицированных нейронов ЦНС виноградной улитки (Bravarenko et al., 2006). При введении в мозг зрелых крыс специфический ингибитор каспазы-3 подавляет консолидацию долговременной пространственной памяти в водном лабиринте Морриса, не оказывая действия на кратковременную память (Dash at al., 2000).
Несмотря на очевидную теоретическую и практическую значимость, работы посвященные изучению участия и роли каспаз мозга в механизмах обучения и памяти сравнительно немногочисленны, а результаты их противоречивы. До сих пор не изучен вопрос о закономерности участия каспаз в нейрохимических механизмах интегративной деятельности мозга, а так же особенности вовлечения этих ферментов в обеспечение различных форм поведения и памяти. Практически отсутствуют данные о действии ингибиторов каспаз на показатели развития и гибели клеток в зрелом мозге. Остается неясным, связаны ли центральные эффекты ингибиторов с изменениями «неапоптозных» функций каспаз, в частности, свойств нейропластичности или влиянием на неонейрогенез и апоптоз.
Роль апоптоза в многоклеточном организме
Считают, что эволюционно апоптоз возник у прокариот как механизм противовирусной защиты популяций и был закреплен у одноклеточных эукариот (Greenberg, 1997). В дальнейшем, с появлением многоклеточных организмов, этот механизм совершенствовался и был использован у растений для реализации таких важных жизненных функций как дифференцировка клеток и тканей в ходе индивидуального развития, защита организма от действия патогенных факторов (Groover et al., 1997; Levine et al., 1996; Pennell, Lamb, 1997; Heath, 1998; Wojtaszek, 1997). У животных и человека апоптоз стал «инструментом» для осуществления наследственного и приобретенного, гуморального и клеточного ответа иммунной системы, элиминирования клеток иммунной системы, невостребованных, состарившихся клеток либо клеток, подвергшихся воздействию мутагенных факторов (Male et al., 1996).
Апоптоз имеет важнейшее значение для нормальной жизнедеятельности беспозвоночных и позвоночных животных. В эмбриональном периоде апоптоз является элементом развития и связан с процессами гисто- и органогенеза (Пальцев, 2002). В норме организм использует этот генетически запрограммированный механизм в эмбриогенезе для уничтожения избытка клеточного материала на ранней стадии развития тканей, например, разрушение клеток в межпальцевых промежутках; разрушение избыточного эпителия при слиянии небных отростков, когда формируется твердое небо; гибель клеток в дорсальной части нервной трубки во время смыкания, что необходимо для достижения единства эпителия двух сторон нервной трубки и связанной с ними мезодермы (Weil et al., 1997). Апоптоз наблюдается также при дифференцировке тканей и органов (гормональнозависимая дифференцировка половых органов из тканевых зачатков). По механизму апоптотической гибели уничтожаются рудиментарные структуры у эмбриона, например, пронефрос (Jacobson et al., 1997, Matalova et al., 2004).
Апоптоз является важной частью метаморфоза насекомых и амфибий. У животных, зародыши которых существуют в виде дефинитивной формы, процессы гистогенеза и органогенеза протекают с участием апоптоза. В период зрелости организма происходит нормологическая смена клеток как часть тканевого гомеостаза при различных морфологических перестройках. При старении происходит естественная гибель клеток. Все названные варианты апоптоза являются закономерными событиями в нормальном онтогенезе, и в этих случаях апоптоз затрагивает не одну клетку, а группу сходных (популяцию) клеток (Steller, 1995).
Таким образом, гибель клеток путем апоптоза рассматривается как необходимое условие нормального существования многоклеточного организма. В формирующихся и обновляющихся популяциях клеток апоптоз выполняет роль фактора, уравновешивающего процессы пролиферации. Многочисленные данные свидетельствует о том, что интенсивность апоптоза выше в начальные периоды онтогенеза, в частности во время эмбриогенеза, а во взрослом организме апоптоз играет наиболее активную роль в интенсивно обновляющихся тканях. Общебиологическое значение апоптоза состоит: в поддержании постоянства численности клеток, определении формы организма и его частей, обеспечении правильного соотношения численности клеток различных типов, удалении генетически дефектных клеток.
Фундаментальные данные о значимости апоптоза для многоклеточного организма и роли этого процесса в поддержании постоянной численности клеток были получены при исследовании нематоды С. elegans. Во время морфогенеза С. elegans происходит программированная гибель 131 клетки. Индукция и осуществление программы апоптоза контролируется набором из 14 генов, из которых один (ced-І) обусловливает выбор апоптотического пути, два (ced-З и ced-4) — его реализацию, а остальные или ингибируют апоптоз, или отвечают за фагоцитоз погибших клеток (Hengartner, Horvitz, 1994, Wu et al.,1999).
Каспазы и их участие в апоптозе клеток
Апоптоз - многоэтапный процесс. Начальный этап - прием сигнала гибели, в виде информации, поступающей в клетку извне или возникающей в самой клетке. Сигнал воспринимается рецептором, подвергается анализу и далее передается молекулам-посредникам. В конечном итоге происходит активация особых ферментов, называемых каспазами. Применительно к клеткам животных и человека апоптоз в большинстве случаев связан с протеолитической активацией каскада каспаз (Самуилов, 2001).
Каспазы — цистеинсодержащие протеолитические ферменты, расщепляющие пептидную связь около остатка аспартата. Впервые были открыты около десяти лет назад и признаны обязательными посредниками апоптотической гибели клетки (Гуляева, 2003). В клетке каспазы существуют в виде неактивных предшественников, состоящих из четырех доменов: NH2-концевого продомена, большой субъединицы (молекулярная масса около 20 кДа), малой субъединицы (около 10 кДа) и линкерного участка, соединяющего большую и малую субъединицы. После протеолитического расщепления зимогена большая и малая субъединицы разъединяются и образуют комплекс (активный энзим), состоящий из двух гетеродимеров большой и малой субъединиц (Wolf, Green, 1999) (схема 1). Будучи активированными, каспазы помимо самоактивации, расщепляют множество белков мишеней, однако действие каспаз специфично, и под их влиянием деградируют только определенные белки и до фрагментов определенной длины. На основе структурной гомологии каспазы подразделяются на подсемейства: 1). Каспазы-1 (каспазы -1,-4, -5). 2). Каспаза-2. 3). Каспазы-3 (каспазы-3, -6-10) (Shi, 2002., Riedl et al., 2001).
По субстратной специфичности различают инициирующие и эффекторные каспазы. Субстраты инициирующих каспаз (к ним относятся каспазы-2, -8, -9, -10 и -12) — латентные формы эффекторных каспаз-прокаспазы-3, -6, и -7. Инициирующие каспазы могут выступать и в роли эффекторных каспаз, что, по-видимому, необходимо для усиления активности каспазного каскада. Так, например, в определенных условиях каспаза-8 может активироваться только после того, как каспаза-9 трансактивирует каспазу-6 (Slee et al., 1999). В активации каспаз принимают участие и другие энзимы, в том числе гранэзим В, катепсины В и G, калпаин и др. (Zhou et al., 1997). Существуют регуляторы, которые блокируют или, напротив, усиливают действие каспаз. К ним относятся белки Вс1-2 (ингибиторы апоптоза: Al, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-XL, Brag-1, Mcl-1 и NR13) и Вах (промоторы апоптоза: Bad, Bak, Вах, Bcl-Xs, Bid, Вік, Віт, Hrk, Mtd). Белки семейства Bcl-2 находятся в постоянном динамическом равновесии, образуя гомо- и гетеродимеры, что, в конечном счете, влияет на развитие апоптоза клеток (Simon et al., 2003).
Известно более семидесяти про- и антиапоптотических белковых субстратов каспаз, которые локализованы в клеточном ядре, цитоплазме и цитоскелете (Nicholson, 1999). Каспазы специфически распознают последовательность, состоящую из четырех аминокислотных остатков и обозначаемую как Р4РзРгРі- Наиболее консервативными в данной последовательности каспазного субстрата являются остаток аспарагиновой кислоты, находящийся в позиции Рь и остаток глутамина в позиции Р3 (Thornberry et al., 1997). В результате гидролиза каспазами биологическая функция их субстратов может активироваться или ингибироваться.
Влияние ингибитора активности каспаз z-VAD-fmk на формирование и консолидацию/хранение пространственного навыка в водном лабиринте Морриса
При анализе данных, полученных в эксперименте при изучении влияния z-VAD-fmk на формирование пространственного навыка в лабиринте Морриса, проводили вычисление коэффициента регрессии (линейной зависимости) времени достижения платформы от номера пробы в каждом из сеансов, а также вычисляли коэффициент регрессии времени достижения платформы в первой попытке для каждого из дней эксперимента от номера сеанса.
Обнаружено, что в течение первых двух дней обучения скорость снижения латентного периода достижения платформы у контрольных и экспериментальных крыс не различались (рис. 8). /и 60 50 40 30 л 1 2 З Рис. 8. Время достижения платформы с постоянным положением в первой пробе сеансов обучения у крыс в условиях внутримозгового введения z-VAD-fmk за 30 минут до начала обучения. По оси абсцисс - дни обучения, по оси ординат - время достижения платформы в первой попытке сеанса обучения в сек: среднее ±SEM (стандартная ошибка среднего). Пунктирная линия - контроль, сплошная линия - введение z-VAD-fmk. - р 0,05 отличия от контроля в динамике снижения латентного периода по результатам дисперсионного анализа с повторными измерениями (repeated measures one-way ANOVA). A - p 0,05 отличия от контроля в динамике снижения латентного периода по результатам регрессионного анализа. Количество животных в каждой из групп п=10.
Так, коэффициент регрессии латентного периода реакции от номера пробы в первый день составил у контрольных животных -6,33±1,45, а у крыс, получавших инъекции ингибитора он равнялся -7,89±1,20 (р 0,1); во второй день обучения - соответственно -3,66±1,26 и -3,64±1,32. Вместе с тем, снижение времени достижения платформы в первой попытке между 1-м и 3-м сеансами у животных, получавших z-VAD-fmk, было выражено значительно больше, чем в контроле — показатели регрессии составляли соответственно -17,58±1,27 и -4,78±2,71 (р 0,01).
При оценке методом дисперсионного анализа с повторными измерениями (repeated measures one-way ANOVA) также выявлено достоверное различие в динамике снижения латентного периода нахождения платформы в первой попытке в ходе трехдневного обучения между контрольной и экспериментальной группами (F(l, 17)=4,5212, р=,04842).
После перемены места положения платформы различий в динамике показателей обучения между контрольной и экспериментальной группами обнаружено не было.
Полученные результаты позволяют предположить, что введение в желудочки мозга ингибитора каспаз широкого спектра действия облегчает формирование долговременной пространственной памяти, не оказывая влияния на кратковременную пространственную память.
Поскольку обнаруженное стимулирующее действие z-VAI)-fmk на долговременную память максимально проявлялось к третьему дню после инъекции, во второй серии экспериментов введение ингибитора проводили за 3 суток до начала обучения. В этих условиях различий между экспериментальной и контрольной группами в показателях формирования долговременной памяти обнаружено не было (рис. 9).
Динамика достижения платформы с постоянным положением в первой пробе сеансов обучения у крыс в условиях внутримозгового введения z-VAD-fmk за 3 дня до начала обучения. По оси абсцисс - дни обучения, по оси ординат - время достижения платформы в первой попытке сеанса обучения в сек: среднее ±SEM (стандартная ошибка среднего). Пунктирная линия - контроль, сплошная линия — введение z-VAD-fmk. Количество животных в каждой из групп п=9.
В экспериментах по изучению «рабочей» памяти (3-х дневное обучение при переменном положении платформы) не было выявлено влияния ингибитора активности каспаз на кратковременную пространственную память: динамика времени достижения платформы в течение каждого из трех сеансов не различалась у контрольных и экспериментальных животных. Вместе с тем, во второй день обучения время
Действие ингибиторов каспаз z-VAD-fmk и z-DEVD-fmk на формирование, консолидацию/хранение и воспроизведение поведения замирания у крыс
Исходное (в день обучения) время замирания в экспериментальной камере до подачи звука и во время предъявления звукового сигнала характеризуют ориентировочно-исследовательское поведение животных, в то время как возрастание времени замирания, наблюдаемое в аналогичных условиях во время сеансов тестирования по сравнению с днем обучения, характеризует долговременную память оборонительного поведения.
«Панкаспазный» ингибитор z-VAD-fmk вводимый за 30 мин до начала обучения, не оказывал действия на исходное время замирания крыс, как до подачи звука, так и во время его предъявления. Вместе с тем, при оценке полученных данных через 48 часов после обучения по критерию Стьюдента и с помощью ANOVA/MANOVA обнаружено возрастание времени замирания при тестировании звуковым стимулом у экспериментальных животных по сравнению с контролем (F=7,32, р 0,03). При тестировании обстановочным стимулом значимых различий между группами животных обнаружено не было (F=0,34, р=0,58) (табл. 1, рис. 12). абсцисс - дни обучения, по оси ординат — время замирания в сек. Пунктирная линия - контроль, сплошная линия - введение z-VAD-fmk. - р 0,05 по сравнению с контролем (ANOVA/MANOVA). Количество животных в каждой из групп п=10.
Сходный результат был получен в опытах с использованием специфического ингибитора каспазы-3 z-DEVD-fmk при его введении за 30 мин до начала обучения (рис. 13). Двухфакторный анализ выявил достоверные различия в динамике формирования поведения замирания на звуковой сигнал между испытуемыми группами (F = 5,61, р 0,04). Вместе с тем, z-DEVD-fmk инъецированный за 30 минут до обучения не оказал влияния на выработку поведения замирания на обстановочный условный стимул (табл. 1). абсцисс - дни обучения, по оси ординат - время замирания в сек. Пунктирная линия - контроль, сплошная линия - введение z-DEVD-fmk. - р 0,05 по сравнению с контролем (ANOVA/MANOVA). Количество животных в каждой из групп п=10.
Ингибиторы каспаз z-VAD-fmk и z-DEVD-fmk при введении в желудочки мозга через 30 мин после обучения не оказывали действия на хранение/консолидацию обстановочного замирания (табл. 2).
В эксперименте по изучению эффектов z-DEVD-fmk введенного за 30 минут до тестирования также не было обнаружено достоверных различий между экспериментальной и контрольной группами животных при тестировании звуковым сигналом и обстановкой, что указывает на отсутствие влияния ингибитора каспазы-3 на воспроизведение выработанного поведения замирания у крыс (табл. 3).
Таким образом, результаты проведенных нами экспериментов демонстрируют сходные и однонаправленные эффекты изученных ингибиторов активности каспаз в условиях их центрального действия на процессы обучения и памяти: z-DEVD-fmk и z-VAD-fmk облегчают формирование поведения замирания на предъявление ключевого стимула (звука), не оказывая влияния на формирование обстановочной памяти, а также на процессы консолидации/хранения и воспроизведения пассивнооборонительного поведения у крыс в модели условно-рефлекторного замирания.
Как было показано ранее, предъявление серии сильных звуковых раздражителей вызывает стартл-реакцию, амплитуда которой снижается по мере предъявления повторных стимулов, т.е. наблюдается феномен кратковременного угашения АСР. При предъявлении животному спустя 24 часа тестирующей серии звуковых раздражителей отмечается снижение средней амплитуды первого ответа по сравнению с аналогичным показателем во время обучения и ускоренное снижение амплитуды ответа при последующем предъявлении стимула - феномен долговременного угашения АСР (Pletnicov et al., 1996; Storozheva, Pletnicov, 1994). Продолжительность замирания у крыс увеличивается при повторном (через 24 часа после первого сеанса) помещении их в экспериментальную камеру, что обусловлено формированием условного страха на экспериментальную обстановку. Рядом авторов убедительно показано, что угашение АСР и формирование условного страха связаны с функциями мозжечка (Sacchetti et al., 2005, Storozheva; Pletnicov, 1994; Supple et al., 1998).
Данные о влиянии z-DEVD-fmk на угашение АСР и динамику поведения замирания, а также других форм поведения во время адаптации к камере представлены в таблице 4.
