Содержание к диссертации
Введение
1. Синаптическая передача как основа сигнализации в мозге 12
1.1. Функциональная роль пресинаптического окончания 13
1.1.1. Функции потенциала действия 14
1.1.2. Модуляция потенциала действия 16
1.1.3. Модуляция пресинаптического высвобождения 17
1.1.3.1. Модуляция нейротрансмиттерами . 17
1.1.3.2. Модуляция специфическими веществами 19
1.1.3.3. Модуляция через изменение ионных концентраций 20
1.2. Функциональная роль постсинаптического окончания 21
1.2.1. Постсинаптические рецепторы 22
1.2.1.1. Ионотропные рецепторы постсинаптического окончания 23
1.2.1.2. Метаботропные рецепторы постсинаптического окончания 25
1.2.2. Cинаптическая пластичность 26
1.2.3. Морфологические основы пластичности. 28
2. Роль астроглии в синаптической передаче 32
2.1. Функции астроцитов в нервной системе 32
2.1.1. Трофическая функция 33
2.1.2. Метаболическая функция 33
2.1.3. Регуляция локального кровотока 34
2.1.4. Поддержание гомеостаза астроцитами 35
2.1.5. Поддержание гомеостаза нейропередатчика в синаптической щели астроцитами 36
2.2. Механизмы и функции кальциевой сигнализации в астроцитах 37
2.2.1. Активация рецепторов на мембране астроцитов 37
2.2.1.1. Метаботропные рецепторы глутамата 38
2.2.1.2. Пуринергические рецепторы 38
2.2.2. Роль ИТФ и ионов кальция 39
2.2.3. Пути удаления кальция из цитоплазмы астроцита 39
2.2.3.1. Первично-активный транспорт 40
2.2.3.2. Вторично-активный транспорт 40
2.3. Высвобождение глиотрансмиттеров 41
2.3.1. Везикулярное кальций-зависимое высвобождение 41
2.3.2. Кальций-независимое высвобождение 42
3. Роль внеклеточного матрикса мозга в синаптической передаче 44
3.1. Компоненты внеклеточного матрикса мозга и их взаимодействия 45
3.2. Влияние компонентов матрикса на синаптическую передачу 48
3.3. Влияние компонентов матрикса на обучение и память 51
Выводы к обзору литературы 52
Материалы и методы 55
1. Приготовление срезов гиппокампа 55
2. Иммуногистохимия 55
3. Электрофизиология 56
3.1. Электрическая стимуляция и запись полевых возбуждающих постсинаптических потенциалов (пВПСП) 56
3.2. Патч-кламп астроцитов и измерение К+ тока 57
3.3. Измерение влияния К+ вытекающего через NMDA рецепторы на пресинаптическое высвобождение 57
3.4. Регистрация долговременной потенциации (ДВП) 58
3.6. Измерение соотношения AMPA/NMDA токов 59
3.7. Измерение спонтанных и миниатюрных ВПСП 59
3.8. Измерение спонтанных, миниатюрных ТПСП и тонического ГАМКергического тока 59
3.9. Измерение парной депрессии тормозных токов 60
3.10. Измерение потенциации тормозных токов при высокочастотной стимуляции 60
3.11. Запись соотношения ВПСТ и ТПСТ 61
3.12. Измерение клеточной возбудимости 61
3.13. Запись калиевого тока через SK каналы 62
4. Двухфотонная микроскопия 62
4.1. Кальциевый имиджинг на астроцитах 62
4.2. Изучение парной депрессии AMPA токов 64
5. Реактивы и химические вещества 64
6. Анализ данных и статистическая обработка 65
Результаты 66
Глава 1. Модуляция пресинаптического высвобождения накоплением К+ при активации синаптических NMDA рецепторов 66
1.1. Роль NMDA рецепторов в синаптической пластичности. 67
1.2. Роль NMDA рецепторов в накоплении К+ в синаптическом пространстве 68
1.3. Роль NMDA рецепторов и выходящего через них калия на потенциацию ВПСП 72
Выводы к главе 1: 75
Глава 2. Изучение кальциевой сигнализации в астроцитах в условиях синаптической активации 76
2.1. Воздействие глутамата высвобожденного при фотостимуляции на распределение кальциевых сигналов в астроцитах 79
2.2. Воздействие глутамата высвобожденного при электрической стимуляции на распределение кальциевых сигналов в астроцитах 81
2.3. Изучение роли метаботропных рецепторов глутамата (mGluRs) в генерации кальциевых сигналов в астроцитах 84
2.4. Изучение роли метаботропных рецепторов глутамата (mGluR) в генерации кальциевых сигналов в астроцитах при синаптической активации 86
2.5. Воздействие низкочастотной электрической стимуляции на распределение кальциевых сигналов в астроцитах 87
Выводы к главе 2 91
Глава 3. Роль внеклеточного матрикса (ВКМ) в синаптической передаче и пластичности в гиппокампе 94
3.1 Удаление ХСПГ ферментом хондроитиназой АВС 95
3.2. Влияние ХСПГ на долговременную потенциацию 97
3.3. Влияние ХСПГ на тормозную синаптическую передачу 99
3.5. Влияние ХСПГ на возбуждающую синаптическую передачу 104
3.6. Влияние удаления ХСПГ на парную депрессию AMPA токов 108
3.7. Влияние ХСПГ на возбудимость СА1 пирамидных нейронов и параметры потенциалов действия 109
3.8. Влияние ХСПГ на возбудимость СА1 пирамидных нейронов при блокировании SK каналов 116
3.9. Влияние удаления ХСПГ на ток через SK каналы 119
3.10. Влияние активации SK каналов на NMDA-рецептор-опосредованного тока при удалении ХСПГ 122
3.11. Влияние ХСПГ на долговременную потенциацию при блокировании SK каналов 123
3.12. Влияние ХСПГ на долговременную потенциацию при блокировании SK каналов и ROCK- киназы 125
3.13. Влияние ХСПГ на кальциевую динамику в астроцитах 127
Выводы к главе 3: 129
Заключение к работе 131
Список цитируемой литературы
- Модуляция нейротрансмиттерами
- Поддержание гомеостаза астроцитами
- Влияние компонентов матрикса на обучение и память
- Изучение роли метаботропных рецепторов глутамата (mGluRs) в генерации кальциевых сигналов в астроцитах
Модуляция нейротрансмиттерами
Передача нервных импульсов является ключевой функцией нейронов, которая осуществляется с помощью передачи возбуждения от клетки к клетке через специализированные контакты – синапсы. Синапсы различают двух типов: электрические и химические. Первый тип представляет собой щелевые контакты между мембранами соседних клеток, представленные порой, составленной из коннексонов, каждый из которых состоит из 6 субъединиц коннексинов. Они передают электрический сигнал в обоих направлениях непосредственно через движение ионов. Кроме того, через них могут диффундировать и небольшие молекулы участвующие во внутриклеточной сигнализации [13]. Такой тип синапсов характерен для развивающегося мозга и при развитии замещается химическими синапсами. Принцип передачи сигнала в химическом синапсе заключается в том, что электрический сигнал, возникший в одной клетке, трансформируется в химический сигнал через высвобождение химического посредника – нейромедиатора. Затем нейромедиатор вызывает возникновение электрического сигнала в другой клетке. Различают три основных элемента химического синапса: пресинаптическое окончание (пресинапс), синаптическую щель, постсинаптическое окончание (постсинапс). Для химического синапса характерна передача сигнала только в одном направлении, что приводит к специализации отростков нейронов. Выделяют аксоны - отростки имеющие расширения «бутоны» с везикулами заполненными нейропередатчиком для его высвобождения и дендриты - отростки воспринимающие сигналы с других клеток. По дендритам сигналы распространяются к соме клетки, где происходит интеграция входных сигналов [13,14]. Еще одно важное отличие химического синапса в том, что он имеет высокую степень пластичности, и позволяет обрабатывать и создавать более широкий спектр сложных сигналов, обуславливая возможность выполнения сложных когнитивных функций. Синаптическая пластичность – это способность синапсов усиливаться или ослабляться со временем в ответ на увеличение или снижение их активности [15]. Она может различаться по длительности и направлению: ослабление или усиление в зависимости от активации пресинаптического или постсинаптического механизма. Кратковременные процессы обычно связаны с изменениями в функционировании пресинаптического окончания, а долговременная пластичность — с модификациями в постсинаптическом окончании.
Пресинаптическое окончание выполняет роль источника сигнала в синаптической передаче и представляет собой расширение на аксоне (аксональный бутон), в котором хранятся синаптические везикулы, заполненные нейропередатчиком [16]. Пресинаптическое окончание характеризуется наличием активной зоны, специализированного участка, с которым связаны везикулы, готовые к высвобождению, где происходит их слияние с мембраной [17]. В пресинаптическом окончании хранится ограниченное количество везикул с нейропередатчиком. Для предотвращения истощения запаса существует процесс повторного использования везикул за счет процесса неполного слияния везикул с мембраной, когда после высвобождения нейропередатчика везикула втягивается обратно с затратой энергии. Процесс слияния везикул с мембраной осуществляется с помощью SNARE комплекса – комплекса белков участвующих в прикреплении везикул к мембране. SNARE комплекс включает в себя такие белки, как синаптобевин, SNAP-25, синтаксин и синаптотагмин. Эти компонеты SNARE комплекса отвечают за регуляцию, прикрепление и слияние везикул с мембраной. Ключевая роль триггера для слияния принадлежит синаптотагмину, поскольку он является сенсором входящего Са2+. При связывании синаптотагмина с Са2+ происходит изменение конформации белков SNARE комплекса и происходит слияние везикулы с мембраной и высвобождение нейропередатчика [18–20]. Известно, что Са2+ входящий в цитоплазму создает локально высокие концентрации кальция - микродомены, как в пресинапсе, так и в постсинапсе. В пресинапсе это необходимо для запуска слияния везикул [21,22]. Основным сигналом для входа кальция является электрический сигнал - потенциал действия (ПД). Так посредством экзоцитоза, осуществляется передача электрического сигнала в виде ПД от одного нейрона к другому, где электрический сигнал трансформируется в химический. Генерация ПД является ключевым способом передачи сигналов в мозге.
ПД впервые был описан и измерен в экспериментах Ходжкина и Хаксли на гигантском аксоне кальмара в 1939 году. ПД – это кратковременный электрический сигнал возбуждения распространяющийся вдоль клеточной мембраны. У ПД выделяют несколько фаз (Рис. 1, a): 1) деполяризация, обусловленная током Na+, 2) овершут или пик ПД, 3) реполяризация, обусловленная током К+, включая быструю и медленную посгиперполяризацию (бПГП и мПГП) (Рис. 1, b) [23,24]. ПД имеет несколько критических параметров: 1) порог генерации - значение потенциала на мембране при котором скорость изменения потенциала достигает некоторой величины, пороговое значение может зависеть от предыдущей активности клетки; 2) полуширина ПД - отражает эффективность активации К+ каналов, т.к. активация Na+ каналов происходит лавинообразно с высокой скоростью; 3) амплитуда - рассчитывается от величины потенциала покоя до овершута и определяется инактивацией Na+ каналов и активацией К+ каналов; 4) амплитуда постгиперполяризации - определяется величиной К+ тока при активации кальций-зависимых калиевых каналов.
Поддержание гомеостаза астроцитами
Все эксперименты были выполнены с использованием линии мышей C57BL/6J, возрастом 28-35 дней. Все процедуры были выполнены в соответствии с нормами по работе с животными, установленными Институтом Мозга RIKEN, Япония. Животные анестезировались 2-бромо-2-хлоро-1,1,1-трифлюроэтаном и декапитировались, затем выделялся гиппокамп из обеих полушарий мозга и помещался в чашу микротома (Microm НМ 650V; Thermo Fisher Scientific), со специальным раствором для резки, содержащим в (мМ): NaCl-87; КС1 -3; MgS04 - 8,48; Nal-bPCU - 1,24; NaHCCb - 26,2; СаСЬ - 0, 5; D-глюкоза - 11, при температуре 4С. Осмолярность всех внеклеточных растворов составляла 295 ± 3 мОсм, рН -7.4, все растворы насыщались карбогеном (95%-О2, 5%-СО2). Толщина приготовляемых срезов составляла 350 мкм, после чего они восстанавливались в растворе для хранения, содержащим в (мМ): NaCl 119; КС1 -3; MgS04 -1, 3; NaFbPC -1; NaHCCb - 26, 2; СаСЬ- 1; MgCb -1,6; D-глюкоза -1, при температуре 34С, в течении 1 часа. Для экспериментов с удалением матрикса после приготовления, срезы помещались в камеру с 3 мл того же раствора для инкубации при температуре 37С на 2 часа. Для контрольных срезов добавлялось 0,2% альбумина бычьей сыворотки (Invitrogen), а для удаления внеклеточного матрикса добавлялись 0,2% альбумина бычьей сыворотки и 0.2и/мл хондроитиназы АВС Proteus vulgaris (Amsbio, UK) (ХАВС), фермента удаляющего молекулы хондроитин сульфата. В экспериментах с ингибированием ROCK-киназы, ЮиМ специфичного ингибитора Y-27632 (Sigma-Aldrich Co.), также добавлялось в инкубационный раствор.
Для экспериментов с удалением матрикса после инкубации в контроле и после применения ХАВС срезы толщиной 350 мкм фиксировались 4% раствором парафармальдегида в течение суток, после чего из них готовились срезы толщиной 40 мкм. Срезы промывались 3 раза фосфатным буфером, и затем при наличии сахарозы для криопротекции при замораживании-размораживании, затем инкубировались в 5% фосфатном буфере с 5% козьей сывороткой и 0,2% тритон-100 в течении 1 часа для предотвращения неспецифичного связывания. Далее, в течение суток срезы инкубировались при 4С с биотинилированным Wisteria Floribunda агглютинине (WFA) (Sigma, 1:400) в фосфатном буфере с 2,5% козьей сывороткой. Затем, в течение суток срезы обрабатывались стрептавидином связанным с флуоресцентным красителем Alexa-488 (Invitrogen, 1:300). Далее изображения получались с помощью конфокальной микроскопии.
Электрическая стимуляция и запись полевых ВПСП (пВПСП) Для электрической стимуляции срезов использовались биполярные электроды из нержавеющей стали (FHC, Bowdoinham, США) устанавливаемые в область коллатералей Шаффера (КШ) в str. radiatum на расстоянии не менее 200 м от места где проводилась запись. Второй электрод устанавливался в str. oriens для антидромной стимуляции (АДС). Регистрирующий микроэлектрод вытягивался из капилляров стекла при помощи пуллера Sutter instruments P-97 (Sutter instruments, Novato, США), сопротивлением 3-5 М. Данный электрод для регистрации пВПСП заполнялся раствором для записи, и устанавливался в область дендритов пирамидных нейронов поля СА1 гиппокампа. Амплитуда стимула подиралась так, чтобы амплитуда пВПСП была 30-50% от максимальной. Наклон пВПСП и амплитуда популяционного спайка (ПС) использовались для анализа. Тетаническая стимуляция КШ для изучения пластичности проводилась пачками по 4 стимула длительностью 0,2 мс, подающихся с интервалом 10 мс. Пачки повторялись 10 раз с интервалом 200 мс [204]. Использовалось одно повторение. Протокол для STDP (spikeiming dependent plasticity) проводился при стимуляции в течении 10 мин КШ и АДС с задержкой 10 мс каждые 6 с.
Записи патч-кламп в режиме целой клетки проводились с СА1 пирамидных нейронов с использованием такого же стеклянного микроэлектрода, заполняемом раствором, состав которого зависел от экспериментальной задачи. Потенциал клетки удерживался на -70мВ, если не указано иное. Осмолярность всех внутриклеточных растворов составляла 290 ± 5 мОсм, а значение pH доводилось гидроксидом основного компонента внутриклеточного раствора до значения 7.2.
Для и патч-клампа астроцитов регистрирующий электрод заполнялся раствором содержащим (в мМ): KCH3SO3 -130; NaCl – 8; Na2-фосфокреатин-10; HEPES -10; аскорбат Na -3; NaГТФ – 0.5; MgAТФ – 2. Астроциты из str.radiatum идентифицировались по нескольким параметрам: низкому мембранному потенциалу -83±3 мВ, низкому входному сопротивлению 17±4 М и линейной вольт-амперной характеристике. К+ ток регистрировался при отдельной стимуляции КШ или АДС аксонов в str. oriens, а затем при парной их стимуляции. Ответы на стимуляцию КШ и АДС складывались для сравнения с экспериментально полученными данными при парной стимуляции. После транспортерного тока высчитывалась максимальная амплитуда К+ тока, усредняя по 5 мс интервалу, т.к. К+ ток медленный и длится секунды. Данный эксперимент был сделан в стандартном растворе для записи и в присутствии блокатора NMDA рецепторов D-APV (50 мкМ).
Влияние компонентов матрикса на обучение и память
Однако торможение могло измениться после тетанической стимуляции. Поэтому, далее были изучены вызванные ТПСТ после и по время тетанической стимуляции на потенциале реверсии для АМРА и NMDA опосредованных токов в контроле (п=6) и после ХАВС (п=8). Сравнивались вызванные ТПСТ после и во время тетанической стимуляции в присутствии блокаторов MCPG, CGP, NBQX, APV во внеклеточной среде, и QX314C1 во внутриклеточном растворе. На Рис. 26, а изображены примеры ответов на одиночные стимулы до и после высокочастотной стимуляции. Однако, достоверной разницы в амплитуде ТПСП до и после тетанической стимуляции обнаружено не было (Рис. 26, Ь). Средняя нормированная амплитуда ответов после высокочастотной стимуляции для последних 5 мин записи достоверно не отличаются между контролем(1,06±0,27) и после обработки ХАВС (0,66±0,22) (Рис. 26, с) (тест Манна-Уитни, р=0,11). На Рис. 26, d изображены примеры отдельных пачечных ответов при высокочастотной стимуляции. Нормированная на одиночный стимул площадь под кривой ответов в пачках также достоверно не отличаются между контролем(9,93±2,81) и после обработки ХАВС (5,03±1,39) (Рис. 26 е) (тест Манна-Уитни, р=0,09). Также амплитуда пачечных ответов при высокочастотной стимуляции достоверно не отличается при высокочастотной стимуляции (Рис. 26 f). Нормированная на одиночный стимул амплитуда в контроле (3,07±0,44) и после ХАВС (2,10±0,46) пачечных ответов тоже достоверно не отличается (Рис. 26 g) (тест Манна-Уитни, р=0,075). Эти результаты указывают, что тормозная синаптическая передача после высокочастотной стимуляции не изменилась после удаления ХСПГ.
Данные результаты говорят о том, что спонтанная и вызванная высокочастотной стимуляцией тормозная синаптическая передача не изменяется после удаления ХСПГ. И снижение возникновения ДВП в этих условиях не связано с изменениями в тормозной синаптической передаче. Поэтому далее мы решили сравнить соотношение тормозной и возбуждающей синаптических передач после удаления ХСПГ, и базовое торможение (тоническую ГАМКд проводимость).
Влияние хондроитиназы ABC на вызванные ТПСТ после высокочастотной стимуляции в пирамидных нейронах СА1 гиппокампа после удаления ХСПГ; а - ответы на одиночные стимулы до и после высокочастотной стимуляции; b - нормированная амплитуда ответов после высокочастотной стимуляции достоверно не отличается; с - средняя нормированная амплитуда ответов после высокочастотной стимуляции для последних 5 мин записи достоверно не отличаются; d- примеры отдельных пачечных ответов при высокочастотной стимуляции; e - нормированная на одиночный стимул площадь под кривой ответов в пачках достоверно не отличаются; f – амплитуда пачечных ответов при высокочастотной стимуляции достоверно не отличается; g - нормированная на одиночный стимул амплитуда пачечных ответов достоверно не отличается. Результаты представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего, - (p 0.05), - (p 0.01), - p 0.001, N.S. – данные статистически не различаются).
Для изучения влияния ХСПГ на соотношение возбуждения и торможения сначала записывался комбинированный ответ при стимуляции коллатералей Шаффера ВПСТ и ТПСТ (Рис. 27 a), затем в перфузию добавлялся РТХ (1 мкМ) и записывался ВПСТ. Из комбинированного ответа вычитался ВПСТ для получения чистого ТПСТ (Рис. 27 b). Амплитуды и площадь под кривой сравнивались в контроле (n=7) и после ХАВС (n=7). В результате оказалось, что соотношение амплитуды ВПСТ и ТПСТ не различается в контроле и ХАВС (Рис. 27 c). Соотношение площадей под кривой ВПСТ и ТПСТ также не различается в контроле и ХАВС (Рис. 27 d). Данные результаты говорят о том, что после удаления ХСПГ соотношения возбуждения и торможения не изменяется в контроле и ХАВС. Далее было проведено сравнение тонической проводимости в СА1 пирамидных нейронах в контроле (n=6) и после ХАВС (n=6). Для этого сравнивались относительные изменения тока фиксации при блокировании ГАМКА рецепторов PTX (100мкМ) в присутствии блокаторов MCPG, CGP, NBQX, APV во внеклеточной среде и QX314Cl во внутриклеточном растворе. Оказалось, что значительного изменения тока фиксации не происходит в контроле и ХАВС (Рис. 27 e). Что говорит о том, что базовое торможение также не зависит от удаления ХСПГ.
В результате, рассмотрение основных свойств тормозной синаптической передачи не показало достоверных различий между контролем и ХАВС, что позволяет сделать вывод о том, что тормозная синаптическая передача не изменяется при удалении ХСПГ и ее свойства не зависят от наличия или отсутствия ХСПГ. Однако, все же свойства возбуждающей синаптической передачи могли измениться, например такие как соотношение NMDA/AMPA токов или вероятность высвобождения глутамата. Такие изменения способны повлиять на снижение возникновения ДВП после удаления ХСПГ. Поэтому в следующих экспериментах были проверены свойства возбуждающей синаптической передачи.
Поскольку, другим возможным механизмом снижения ДВП могло быть изменение возбуждающей синаптической передачи, сначала сравнилась вероятность высвобождения глутамата в пирамидных нейронах СА1, измеряя для этого соотношение вызванных ВПСТ в ответ на парную стимуляцию. В режиме фиксации потенциала, сначала подавался одиночный, а затем парный стимул, с варьирующим межстимульным интервалом (Рис. 28, а). Затем оба ответа нормировались и из парного стимула вычитался одиночный, далее высчитывалось соотношение амплитуд. Оказалось, что после обработки срезов хондроитиназой АВС, соотношение ответов на парную стимуляцию достоверно не изменилось для всех межстимульных интервалов: 20, 50, 100, 150 мс (Тест Манна-Уитни, р=0,344, р=0,468, р=0,288, р=0,228, соответственно) в контроле (п=6) и после ХАВС (п=6) (Рис. 28, а). Среднее соотношение стимулов при парной стимуляции для всех межстимульных интервалов: 20, 50, 100, 150 мс соответственно в контроле 1,68±0,14, 1,60±0,09, 1,47±0,076, 1,37±0,04, и после ХАВС 1,60±0,11, 1,64±0,13, 1,42±0,08, 1,33±0,09. Данный результат указывает, что вероятность высвобождения глутамата не изменяется после удаления ХСПГ.
Изучение роли метаботропных рецепторов глутамата (mGluRs) в генерации кальциевых сигналов в астроцитах
Поскольку возникновение структурной пластичности после удаления ХСПГ может быть связано со структурной пластичностью и увеличением размера шипиков, то было предположено, что в этот процесс может быть вовлечен ROCK-киназа зависимый путь [228]. Этот путь представлен ГТФазой: Rho ассоциированной киназой, активация которой приводит к реорганизации цитоскелаета [229]. Увеличение размера шипиков приводит к увеличению потенциации [226], поэтому необходимо было проверить эффект ХСПГ на активность ROCK-киназы.
Долговременная потенциация после удаления ХСПГ при пятикратной тетанической стимуляции не различается в контроле и ХАВС при блокировании SK каналов и ROCK-киназы; а - ДВП после удаления ХСПГ в ответ на стимуляцию одиночными стимулами не различается с контролем. В -количество возникающих ПД после удаления ХСПГ при тетанической стимуляции не различается с контролем; с - наклон ВПСП после удаления ХСПГ при тетанической стимуляции не различается с контролем. Результаты представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего, -(p 0.05), - (p 0.01), - p 0.001, N.S. – данные статистически не различаются).
Для изучения этого эффекта проводилась запись ДВП не только в присутствии апамина, но и ингибитора ROCK-киназы Y-27632 10 мкМ. Y-27632 присутствовал, как при инкубации срезов, так и при записи ДВП. Оказалось, что уровень ДВП в контроле и при удалении ХСПГ оказался одинаковым (Рис. 38, a). При этом число возникающих ПД (Рис. 38, b) и наклон (Рис. 38, c) при пятикратной тетанической стимуляции не различается в контроле и ХАВС. Увеличение ВПСП в контроле составило 85±26%, а после ХАВС 78±33% (тест Манна-Уитни, p=0,50).
Таким образом, при удалении ХСПГ возникает структурная пластичность связанная с активацией ROCK-киназа-зависимого пути. Это приводит к перестройке цитоскелета и увеличению размера шипика, что вызывает увеличение ДВП после удаления ХСПГ. Т.е. использование ферментов удаляющих ХСПГ при травмах нервной ткани оказывает значительное влияние на функционирование нейронов, в частности на базовые механизмы синаптической передачи и пластичности, которые необходимо учитывать при терапевтических воздействиях. Данный результат является очень важным поскольку использование ферментов удаляющих ХСПГ применяется при травмах нервной ткани [180,230,231]. Однако, кроме влияния на нейроны, удаление ХСПГ может оказывать эффект и на астроглию.
Изучение влияния ХСПГ на астроглию является необходимым, так как астроциты выполняют ряд важнейших функций по обеспечению жизнедеятельности нейронов [126]. При отсутствии способности генерировать распространяющиеся электрические сигналы, астроциты способны генерировать кальциевые сигналы, которые имеют важную физиологическую роль [130,174]. Для того, чтобы изучить изменения функционирования астроцитов при удалении ХСПГ, проводилось изучение распределения кальциевых событий в астроцитах в контроле (п=6) и после ХАВС (п=5). В результате, в условиях удаления ХСПГ оказалось, что для Smax не изменяется в контроле (2,02±0,11) и после ХАВС (2,19±0,13) (Рис. 39, а) (Тест Манна-Уитни, р=0,086). В тоже время происходит увеличение длительности кальциевых событий после ХАВС (3,14±0,12) по сравнению с контролем (2,60±0,14) (Рис. 39, Ь) (Тест Манна-Уитни, р=0,011). Не изменяется частота кальциевых событий в контроле (32,10±6,65 Гц) и после ХАВС (27,32±4,89 Гц) (Рис. 39, с) (Тест Манна-Уитни, р=0,26).
Анализ кальциевых событий в астроцитах в контроле и после удаления ХСПГ; а - максимальной площади кальциевых событий не различается в контроле и ХАВС; b - длительности кальциевых событий в ХАВС. Значительно ниже чем в Sham; с - частота кальциевых событий не различается в контроле и ХАВС. Результаты представлены в виде средних значений ± стандартная ошибка среднего, - (р 0.05), - (р 0.01), -р 0.001, N.S. - данные статистически не различаются).
Это может указывать на изменение свойств возникновения и распространения кальциевых сигналов в астроцитах вследствие удаления ХСПГ, или о нарушениях в регуляции внутриклеточного Са2+, что может оказывать значительное влияние на синаптическую передачу. Таким образом, удаление ВКМ имеет сложный комплексный эффект не только на нейроны, но и на кальциевую сигнализацию в астроцитах. При этом происходит увеличение их длительности, что может приводить к существенным последствиям, т.к. кальциевые осцилляции запускают ряд биохимических функций, а увеличение присутствия Са2+ в цитоплазме может существенно повлиять на них.
Схема влияния удаления ХСПГ на синаптическую передачу; 1 -снижение долговременной потенциации при удалении ХСПГ; 2 - увеличение активности SK каналов, которая снижает возбудимость нейронов; 3 -потенциация, возникающая через ROCK-киназа-зависимый путь; 4 - Тормозная синаптическая передача не изменяется при удалении ХСПГ; 5 - Возбуждающая синаптическая передача не изменяется при удалении ХСПГ; 6 - Удаление ВКМ вызывает увеличивает длительность кальциевых событий в астроцитах, не влияя на их максимальную площадь и частоту.
