Содержание к диссертации
Введение
Б) Литературный обзор 9
1. Вводная часть 9
2. Биосинтез и процессинг нейропептидов 13
3. Нейропептиды беспозвоночных 16
4. Кальцийсвязывающие белки с EF-hand доменом 24
5. Белки-предшественники в командных нейронах виноградной улитки 26
6. Интерференция РНК. Морфолино олигонуклеотиды. 31
В) Материалы и методы 34
1. Микроэлектродная регистрация внутриклеточной активности 34
2. Получение и очистка поликлональпых антител 35
2.1. Иммунизация 35
2.2. Получение и очистка антисыворотки 36
2.3. Иммуноаффинная хроматография 36
2.4. Двойная иммунопреципитация в геле (метод Оухтерлони) 37
2.5. Преципитация по Гейдельбергу 37
2.6. Твердофазный иммуноферментный анализ 37
3. Методы иммунохимии и работы с белком 38
3.1. Равновесный микродиализ 38
3.2. Метод "overlay-blotting" 39
3.3. Метод "shift assay mobility" 39
3.4. Иммуноблоттинг растворов белков и пептидов 40
3.5. Окрашивание антителами whole-mount препаратов 40
4. Электронная микроскопия 41
5. Методы работы с нуклеиновыми кислотами 43
5.1. Полимеразная цепная реакция (PCR) 43
5.2. Рестрикция 43
5.3. Очистка ДНК через легкоплавкую агарозу 43
5.4. Лигирование 44
5.5. Приготовление компетентных клеток 44
5.6. Трансформация 45
5.7. Выделение плазмид 45
5.8. PCR с колоний 46
5.9. Приготовление зонда к м РНК 46
5.10. Гибридизация in situ на whole-moun t препаратах 47
Г) Цель и задачи работы 49
Д) Результаты 50
1. Исследование паттерна транскрипции гена preHelixSFamid 50
1.1. Картирование транскрипции 51
1.2. Паттерн транскрипции при пищевой депривации 56
1.3. Изменение паттерна транскрипции в онтогенезе 58
2. Транскрипция HCS1 63
3. Ультраструктура командных нейронов 70
4. HCS2 75
4.1. Кальцийсвязывающие свойства HCS2 75
4.2. Получение и проверка специфичности антител 76
4.3. Процессинг HCS2 79
4.4, Гомология HCS2 с другими белками 90
5. Селективная блокада генной экспрессии в одиночных идентифицированных нейронах виноградной улитки 97
Е) Обсуждение 103
Ж) Выводы 109
3) Список литературы 110
И) Публикации по теме диссертации 125
К) Благодарности 128
- Биосинтез и процессинг нейропептидов
- Микроэлектродная регистрация внутриклеточной активности
- Приготовление зонда к м РНК
- Изменение паттерна транскрипции в онтогенезе
Введение к работе
Одной из важнейших проблем современной физиологии является изучение функции генов, которые в большом количестве описаны у животных и человека. Надежды, связанные с появлением нокаутных животных с дефицитом по одному гену оправдались, когда изучались гены с известной на молекулярном уровне функцией, и контроль выключения этой функции проводился на субклеточном уровне. Однако попытки проанализировать роль генов в поведении и обучении столкнулись с тем, что нокаут отдельных генов часто приводит к включению компенсаторных механизмов, которые могут скрыть, изменения, вызванные отсутствием экспрессии изучаемого гена (Crusio, 1996; Gerlai, 1996; Lathe, 1996; Wagner, 1994). Новые методы избирательного блокирования трансляции отдельных генов. сейчас интенсивно развиваются и уже внесли свой вклад в развитие некоторых областей биологии. Возможность успешного использования одного из этих методов - метода инъекции морфолино олигонуклеотидов показана нами на идентифицированных нейронах оборонительного поведения. Третий подход -корреляционный. Он успешно использовался при изучении сенсорной регуляции ранней генной экспрессии в зрительной коре млекопитающих (Kaczmarek, Chaudhuri, 1997). Исследовался общий уровень экспрессии ранних генов в области коры, включающей миллионы нейронов, большая часть которых не идентифицирована по выполняемым ими функциям. Что касается генов, локально экспрессирующихся в ЦНС в физиологически идентифицированных нейронах, изучение их экспрессии впервые начато в нашей лаборатории (Bogdanov et al.f 1994). Была обнаружена экспрессия отдельных генов в группах нейронов, участвующих в реализации определенного типа поведения.
Физиологические воздействия на молекулярные механизмы экспрессии генов должны быть особенно важны в нервной системе, в которой экспрессируется наибольшее количество генов, и где такие воздействия оказывают существенное влияние на пластичность нервных клеток и синапсов. Довольно подробно изучено влияние отдельных генов на формирование нервной системы в эмбриогенезе, экспрессия ранних генов fos и jun семейств в нейронах (Anokhin K.V., Sudakov К.V., 2003), С другой стороны, остается почти не изученным вопрос об экспрессии
генов, кодирующих белки, принимающих непосредственное участие в организации поведенческого акта, таких как предшественники нейропептидов и иейрогормонов. Почти ничего не известно о влиянии физиологических факторов на транскрипцию, трансляцию и. белковый процессинг таких предшественников, а также об их экспрессии в эмбриогенезе. Можно предположить, что экспрессия большинства таких генов не постоянна, и, скорее всего, зависит от влияния факторов, связанных с определенным типом поведения, в организации которого принимают участие данные молекулы- Проверить правильность данного утверждения можно лишь на объекте с хорошо исследованной на клеточном уровне физиологией поведения. При этом изучаемые нейроны должны отвечать следующим условиям: описано их участие в определенном тиле поведения; крупные размеры таких нейронов и высокий уровень экспрессии белков-предшественников должны сделать возможным использование биохимических и молекулярно-биолопических методов, параллельно с физиологическими исследованиями. Существенным является условие отсутствия экспрессии изучаемых генов в большинстве других клеток нервной системы. Всем этим требованиям отвечают отдельные группы идентифицированных нейронов виноградной улитки, с найденными в них продуктами экспрессии нескольких генов, кодирующих предшественники нейропептидов. Это гигантские командные интернейроны париетального ганглия, принимающие участие в оборонительном поведении, и экспрессирующие-белки-предшественники HCS1 и HCS2 (helix command neuron-specific). Отдельные нейроны педального, буккального и церебрального ганглиев, участвующие в пищевом поведении улитки и экспрессирующие предшественник preHelixSFamid.
Биосинтез и процессинг нейропептидов
Что такое нейропептиды? Очевидное определение нейропептидов было бы -пептиды, обнаруживаемые в нервной системе. Это включило бы очень большое количество пептидов и коротких белковых последовательностей с различными функциями. Однако в литературе этому слову обычно придают более ограниченное значение: нейропептид - это пептид, который может быть высвобожден из нейрона как сигнальная молекула. Эта сигнальная молекула будет иметь трансмитгерный или модуляторный эффект в другой возбудимой клетке, а иногда и в собственной. Нейропептид является всегда пептидом с низким молекулярным весом, то есть состоит из сравнительно небольшого числа. аминокислотных остатков, обычно между 4 и 30, и редко больше чем 40 остатков. Нейропептиды представлены в центральной ив периферической нервной системе позвоночных, и в ганглиях беспозвоночных. Они встречаются во всех группах животных, обладающих нервной системой, даже в такой простой, как у Coelenterates (Thorndyke et al., 1988; Holmgren et al, 1994).
Нейротрансмиттерное действие нейропептидов было обнаружено намного раньше, чем таковое большинства других типов нейромедиаторов. Нейропептиды встречаются во всех типах нервов, включая сенсорные нервы (вещество Р), болевые нервы (эндорфины), нервы автономной нервной системы (нейрокинин А, гастрин-высвобождающий пептид, VIP, РАСАР), соматомоторные нервы (например, проктолин беспозвоночных). По-видимому, в отдельном нейроне каждый нейропептид всегда сосуществует с другим нейротрансмиттером. Им может быть один из классических медиаторов, или другой нейропептид. Нейропептиды обычно функционируют через медленные метаботропные рецепторы, связанные с G-белками и часто выполняют модуляторные функции в постсинаптической клетке. Молекулы нейропептидов присутствуют не только в нервной системе. Сходные молекулы часто присутствуют в эндокринных клетках и выбрасываются оттуда, действуя как гормоны (Solcia et al, 1989). Примером такого «регуляторного пептида» является холецистокинин (ССК), В этом случае, один из продуктов альтернативного сплайсинга, молекула предшественника ССК8, экспрессируется и высвобождается в нейронах, в то время как другой, ССКЗЗ, преобладает в эндокринных клетках (Dockray et я/., 1980).
Нейропептиды синтезируются так же, как все другие пептиды и белки. ДНК в ядре кодирует матричную РНК, которая оставляет ядро, и транспортируется в цитоплазму, где служит матрицей при биосинтезе полипептида на рибосомах шероховатого эндоплазматического ретикулума. Этот полипептид — предшественник активного пептида, назван препропептидом. Часть препропептида отщепляется от формирующегося пропептида, а часть пропептида расщепляется, формируя активные нейропептиды (Рис.ІА). В случае нейропептида это происходит в аппарате Гольджи, и активные пептиды упаковываются в секреторные гранулы, отпочковывающиеся от аппарата Гольджи и транспортируемые аксональным транспортом в терминаль аксона. Предшественник пептида (препропептид) часто имеет три компонента: сигнальную последовательность приблизительно из 16-30 аминокислотных остатков на N-конце, одну или больше последовательностей нейропептида, и одну или несколько спейсерных частей (также называемых фланкирующими частями) (Рис. 1В). Присутствие сигнального пептида позволяет препропептиду проходить в эндоплазматический ретикулум в течение синтеза. Спейсерные части удлиняют синтезирующийся пептид так, чтобы его длина была достаточна для того, чтобы пройти через мембраны, и продвигаться внутри эндоплазматического ретикулума
{Dores et al., 1996). Они могут увеличивать длину молекулы от нескольких аминокислот до 10 раз конечного активного продукта. Спейсерные части отщепляются от конечного активного пептида в специфических местах основных одиночных остатков (аргинин, лизин) или в двух смежных основных остатков аминокислот.
Гидрофобный лидер — один из самых распространенных типов сигнального пептида. Такие пептиды, как и сигнальные участки белковой молекулы, служат сигналами сортировки белков в клетке., Центральная часть сигнального пептида, обычно образована 5-Ю гидрофобными аминокислотными остатками. Данная структура позволяет белку пройти через мембрану ЭПР и обычно сразу отщепляется протеазами, как только белок окажется в ЭПР (Andrews et al., 1987). Сигнальный пептид не всегда располагается в N-концевой части, у белков-предшественников FMRF-амида, интерлейкина 1, последовательность гидрофобных аминокислот расположена в центральной части белковой молекулы (Schaefer et а/., 1985). Дальнейшая судьба белка в ЭПР зависит уже от другого сигнального пептида, который может находиться в С-концевой части молекулы. Такой пептид состоит всего из четырех аминокислот, обычно это -Lys-Asp-Glu-Leu-COO". Если данный пептид присутствует в белковой молекуле, белок остается в ЭПР. Если такого пептида нет, белок транспортируется в аппарат Гольджи. (Blobel, 1980; Garoff, 1985).
Мутации в генах ведут к изменениям в аминокислотной последовательности, и объясняют различия в структуре нейропептидов у различных видов животных. Чем больше отдалены два вида, тем большее количество замен может быть найдено в одном и том же нейропептиде. Биологически активная часть нейропептида обычно наиболее сохранная часть. Нейропептиды также формируют семейства из близко связанных пептидов, где несколько членов могли произойти из одной разновидности. Пептиды одного семейства обладают высоким сходством первичной структуры, схожими или близкими функциональными особенностями. (Holmgren et al, 2001).
Известно уже более тысячи нейропептидов, а количество ежегодно открываемых постоянно растет. Такое огромное разнообразие пептидов нервной системы, возникшее в процессе эволюции не случайно. Оно связано со сложностью организации и количеством функций, выполняемых нервной системой. Нейропептиды имеют особое значение в межклеточной сигнализации, лежащей в основе пластичности нервной системы. Функционально они занимают место между классическими медиаторами для малых нейропептидов и нейрогормонами для крупных пептидов. Для первых характерно малое время воздействия и небольшие расстояния до клеток-мишеней. Вторые характеризуются длительным воздействием и часто довольно длинными путями распространения.
Микроэлектродная регистрация внутриклеточной активности
Перед иммунизацией диализовали необходимое количество белка (по 300 мкг на каждого кролика) в однократном растворе PBS и добавляли равный объём полного адъюванта Фрейнда. Кроликов иммунизировали подкожно (в 3-5 мест вдоль спины) и внутримышечно (в голень). Место инъекции предварительно освобождали от волосяного покрова и смазывали спиртом.
Повторно кроликов иммунизировали через месяц с неполным адъювантом Фрейнда, затем каждую неделю до появления специфических антител. Наличие в крови антител к введенному иммуногену оценивали с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа.
Кровь отбирали из ушной маргинальной вены, по 50 мл от каждого кролика. Около места отбора крови уши кроликов смазывали орто-ксилолом. Периодически образующиеся сгустки крови снимали с помощью марли. Сыворотку собирали в сухой (вода вызывает гемолиз), стеклянный стакан и хранили два часа при комнатной температуре. Затем сыворотку центрифугировали 20 мин (37С; 3000g). Образовавшийся супернатант аккуратно отбирали и хранили при -20С.
Для удаления веществ, связывающихся с активными группами сорбента и препятствующих иммобилизации 3 мг белка-антигена диализовали против 0,1 М NaHC03, рН 8.5, содержащего 0,5М NaCl. Предварительно 500 мг BrCN-активированной сефарозы (Pharmacia) помещали в 1 мМ раствор НС1. Через 5 мин смолу переносили на стеклянный фильтр GI и промывали 200 мл 1 мМ раствора НС1 в течение 10 мин. Сефарозу смешивали с раствором белка и инкубировали при +4С в течение ночи при постоянном перемешивании. Оставшиеся свободными активные группы носителя блокировали 6 ч при +4С 0,05М раствором глицина, при постоянном перемешивании. Смолу с антигеном переносили на колонку со стеклянным фильтром. Не ковалентно связавшийся белок смывали 0,1М раствором ацетата натрия (рН 4.0) и ОД М раствором бората натрия (рН 8.0), содержащих 0,5М NaCl (всего три цикла). Полученный иммуносорбент уравновешивали раствором PBS и хранили при +4С в присутствии 0,02% азида натрия. Количество белка на носителе рассчитывали как разность количества взятого белка и смытого буферами в процессе промывания сорбента.
Сыворотку крови со специфическими антителами многократно пропускали через колонку с одним из пептидов HCS2, пришитым к BrCN-активированной сефарозе. Затем антитела элюировали 6М мочевиной. Полученный раствор диализовали против однократного раствора PBS при +4С (три раза) и концентрировали на роторном испарителе SpeedVac Concentrator AS260. Концентрацию антител измеряли на спектрофотометре.
Обезжиренные стекла, расположенные строго горизонтально, заливали горячим раствором 1% агара в IX PBS. В остывшем геле сделали лунки объемом по 40 мкл при помощи семи-луночного штампа. Центральную лунку заполнили раствором антигена с известной концентрацией. Шесть периферийных лунок заполнили растворами антител с отличающимися концентрациями. Гель поместили во влажную камеру и оставили на ночь при комнатной температуре. По окончании диффузии агар отмывали от непрореагировавших белков в течение двух суток раствором IX PBS (три смены). Затем гель высушили и окрасили 0,1% раствором кумасси с 25% изопропанолом и 10% уксусной кислотой в течение 30 мин. Избыток красителя отмыли 25% изопропанолом и 10% уксусной кислотой.
Различные количества чистого антигена смешивали с эквивалентным количеством антисыворотки. Пробы доводили до постоянного объема 150 мкл 20 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 8,0). Контрольные пробы содержали такие же количества антисыворотки в отсутствии антигена. Пробы инкубировали 30 мин при комнатной температуре и ночь при +4С. Образовавшийся преципитат осаждали центрифугированием (10 тыс. об/мин, 15 мин, +4С). Преципитаты дважды промывали 0,5 мл раствора PBS и определяли в них количество белка по методу Лоури. Количество иммунного преципитата рассчитывали, вычитая из общего количества белка в осадке, количество неспецифически агрегировавшего белка, известное по контрольным пробам.
Твердофазный иммуноферментный анализ антител основан на определении количества антител, присоединившихся к сорбированному на плашке антигену, с помощью конъюгата антивидовых антител и пероксидазы. Измеряемая ферментативная активность пероксидазы пропорциональна количеству присоединившихся антител.
В лунки 96-луночного планшета для иммуноферментного анализа вносили по 100 мкл раствора антигена в концентрации 5 мкг белка на I мл раствора IX PBS, и инкубировали 1 ч при 37С или ночь при +4С. Избыток антигена отмывали три раза раствором PBS, содержащим 0,05% твина PTW и вносили по 100 мкл антисыворотки в концентрации от 2-3 нг/мл до 1-2 мкг/мл в растворе PBS с 0,1% твином (титрование с разведением 1:3). После инкубации при +37С 1 ч, не связавшиеся антитела, отмывали пять раз по 150 мкл PTW (0,05%) со встряхиванием на шейкере. Для выявления антител, присоединившихся к антигену, в лунки вносили по 100 мкл конъюгата антивидовых антител с пероксидазой хрена в растворе PTW (0,1%) и инкубировали 1 ч при +37С. Отмывка пять раз по 150 мкл PTW (0,05%) со встряхиванием на шейкере.
Для измерения каталитической активности пероксидазы в лунки вносили по 100 мкл свежеприготовленного субстратного раствора: на 10 мл цитратно-фосфатного буфера, одна таблетка ОФД (орто-фенилендиамин) и 20 мкл 30% перекиси водорода. Развитие окраски происходило в темноте в течение 15-30 мин при легком перемешивании и +20С. Величину оптического поглощения определяли на спектрофотометре при 492 нм, относительно поглощения в лунках, в которые не добавляли антител к антигену. Окрашивание останавливали раствором Зн НС1 (по 20 мкл на лунку).
Микродиализ проводили в эппендорфе для ПЦР, используя его крышку для раствора белка - 40 мкл ("внутренняя камера"), раствор ЭГТА наносили на дно эппендорфа ("внешняя камера"). Затем на крышку положили диализную мембрану и эппендорф закрыли. После чего на центрифуге (lOOOg, 2с) стряхнули раствор ЭГТА на диализную мембрану, обеспечивая, таким образом, максимальное соприкосновение двух растворов. Равновесие между двумя растворами устанавливается за ночь (на +4С).
Через 12 часов ставили диализ с Tris-HCl (по ЮОмкл с трёхкратной сменой в течение 8ч), чтобы освободить раствор с белком от ЭГТА, и уже после этого вносили во "внешнюю камеру" раствор с 45СаС12 (40мкл). Инкубировали в течение ночи на +4С. При одинаковых количествах (по 10 6 М) изучаемых белков степень связывания кальция зависит от структуры белковой молекулы.
Приготовление зонда к мРНК
Для исследования роли изменения синаптической активации командных нейронов на экспрессию гена HCS1, мы выполнили in situ гибридизацию на пяти группах изолированной ЦНС виноградной улитки (по три в каждой). Первую (контрольную) группу инкубировали трое суток в физиологическом растворе, вторую и третью (опытные) в том же растворе, но с добавлением MgCb- На ЦНС третьей группы в течение десяти часов апплицировали серотонин (модель оборонительного поведения). Концентрация серотонина в физиологическом растворе была 10 5 в течение 30 мин. Затем серотонин отмывали 30 мин; всего десять циклов. Четвертая опытная группа повторяла третью, но ЦНС инкубировали в растворе без MgCb. Пятая опытная группа - представляла собой модель оборонительного поведения in vivo. В течение трех дней по два раза в день животным инъецировали серотонин по 100 мкл 10 3 на 10 гр. веса (в среднем по 400 мкл). Таким образом, концентрация серотонина в межклеточной жидкости составила около 10 5. Кроме этих инъекций животному на второй день отрезали хвост.
В первой (контрольной) группе экспрессия HCS1 была выявлена в группе мелких нейронов плеврального и педального ганглиев, а также в крупном метацеребральном нейроне MtC 6. Во второй (опытной) группе экспрессия была выявлена лишь в одной из двух симметричных клеток MtC 6. Следовательно, блокада рецепторов ионами магния препятствует экспрессии данного гена. Также ген почти не экспрессируется в норме, при отсутствии внешних по отношению к командным нейронам раздражителей. В моделях оборонительного поведения in vitro и in vivo (третья, четвертая и пятая опытные группы) наблюдается максимальная экспрессия гена HCS1. Окрашиваются мелкие клетки плеврального и педального ганглиев, крупный нейрон метацеребрального ганглия MtC 6, а также гигантские интернейроны париетального ганглия LPa3 и РРаЗ (Рис.15).
Таким образом, в экспрессии гена HCS1 в командных нейронах прослеживается так называемая down-регуляция экспрессии, когда ген почти не экспрессируется в отсутствие определенного типа поведения. Максимальная экспрессия HCS1 происходит лишь при оборонительном поведении.
Ультраструктуру командных нейронов изучали с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (совместно с Н.Н. Лучинской, МГУ; лабораторией электронной микроскопии ИМБ РАН). Исследовали сому командных нейронов, срезы предварительно обрабатывали глутаральдегидом и осмиевой кислотой. Выделить нейрон вместе с аксоном было невозможно.
Ультраструктура гигантских интернейронов париетального ганглия (Рис. 16) имеет некоторые особенности, отличающие их от других клеток нервной системы, что связано со специфическими функциями, выполняемыми данным типом нейронов. 1) Большие размеры ядра, занимающего почти три четверти объема сомы. По-видимому, это связано как с большим количеством генетического материала (командные нейроны полиплоидны), так и с высоким уровнем транскрипции. Ядро имеет изрезанные края. По всему пространству ядра располагаются крупные блоки компактного хроматина. 2) Сильное развитие гранулярного эндоплазматического ретикулума (ГЭПР). В данном типе мембранных органелл происходит транспорт секреторных белков синтезируемых рибосомами ГЭПР к аппарату Гольджи (АГ). В компартментах ретикулума также происходит отщепление пептидазои сигнального пептида (гидрофобного лидера) синтезируемых белков. Такое развитие ГЭПР свойственно нейросекреторньтм клеткам с высоким уровнем синтеза нейрогормонов. В случае с командными нейронами париетального ганглия показана их высокая белоксинтезирующая активность в отношении предшественников нейропептидов (FMRFamid, HCS1, HCS2). Кроме этого, ГЭПР служит основным внутриклеточным депо кальция, что может косвенно служить доказательством значительной роли этого вторичного посредника в данном типе клеток. 3) Как следствие высокого развития ГЭПР - хорошо развитый аппарат (комплекс) Гольджи в командных интернейронах. Он состоит из стопок мембран, от транс-области которых отпочковываются многочисленные элктроноплотные секреторные везикулы диаметром около 100 нм. Ламеллоподобные вакуоли в цитоплазме командных нейронов. 4) Параллельно клеточной мембране располагаются группы митохондрий. Большое количество этих органелл образует несколько слоев вдоль плазмалеммы. Все митохондрии вытянутой формы с хорошо развитыми кристами. Такое развитие и количество данных органелл указывает на высокий уровень биоэнергетических процессов в командных нейронах, необходимых в частности для синтеза и транспорта белковых молекул. 5) В цитоплазме гигантских нейронов обнаружено большое количество вакуолей размером около 1 мкм с необычной ламеллоподобной структурой как с электроноплотным содержимым, так и без него. Также встречаются ламеллоподобные образования, состоящие из стопок мембран. Подобные ламеллярные тела описаны и у других видов моллюсков, например в гигантских нейронах тритонии (Боровягин, Сахаров, 1968; Nolte et al, 1965). Пока функция таких структур неизвестна, однако существуют предположения о взаимосвязи ламеллярных структур с комплексом Гольджи. Возможно, в клетках, где идет интенсивный синтез и секреция, подобные образования служат резервом мембран для АГ (Simson et ah, 1963). Ультратонкий срез нейрона РРаЗ (норма). Фиксация глутаральдегидом и тетроксидом осмия. Обозначения: V - вакуоли, G - комплекс Гольджи, SV - секреторные везикулы, GER - гранулярный эндоплазматический ретикулум. Масштабный отрезок равен 1 мкм. Также мы исследовали ультраструктуру командных нейронов после воздействий, увеличивающих экспрессию HCS2: аппликации серотонина (Рис.17), обрезание хвоста улитки (Рис.18) или инкубация выделенной ЦНС в физиологическом растворе в течение 72 часов (Рис.19). Первые два воздействия вызывали нарушение однородности цитоплазмы, происходила небольшая фрагментация ГЭПР с образованием пузырьков, покрытых слоем рибосом, а также некоторое увеличение числа вакуолей, в частности, ламеллопоподобных.
Изменение паттерна транскрипции в онтогенезе
В правом плевральном ганглии аплизии иммуноцитохимически были показаны клетки, содержащие белок-предшественник СР2 (мозговой пептид 2; Vilim et al., 2001). Местоположение этих клеток не соответствует местоположению CNP4 иммунореактивных нейронов. Также в плевральном ганглии найдены пептиды Mytilus, ингибирующие высвобождение пептидов (МІР; Fujisawa et al., 1999). Сравнение наших результатов и местоположения MIP-содержащих нейронов, показывает существенное перекрывание, включая гигантский плевральный нейрон 1. Пептиды М1Р-семейства состоят из шести аминокислотных остатков и характеризуются общей последовательностью в С-концевой части -Pro-X-Phe-Val-NH2 (Fujisawa etaL, 1991). Различие в последовательности пептидов М1Р-семейства и пептидов CNP группы, вместе с наблюдением, что только МІР иммунореактивные нейроны, расположенные в плевральном ганглии также CNP4 иммунореактивны, предполагают колокализацию этих пептидов. В каждом плевральном ганглии аплизии, количество МІР иммунопозитивных клеток было 10-12 (Fujisawa et al, 1999), в то время как CNP4 иммунопозитивных нейронов было 20-25, что также свидетельствует о частичной колокализации этих пептидов.
Также обнаружены МІР иммунореактивные нейроны в прудовике Lymnaea stagnalis и в улитке Helix pomatia (Elekes et al., 2001). Идентифицированные гигантские париетальные интернейроны в Helix, экспрессирующие ген HCS2, не являются МІР иммунореактивными. МІР иммунопозитивные нейроны найдены лишь в буккальных ганглиях Helix, которые не содержат клеток экспрессирующих HCS2 ген. Частичное перекрывание HCS2 и МІР иммунореактивных нейронов имеется в плевральном, педальном и церебральном ганглиях Helix. Таким образом, паттерны МІР и HCS2 иммунореактивных нейронов не перекрываются полностью в Helix.
Когда происходит стимуляция ЦНС при оборонительном поведении, HCS2 экспрессируется в плевральных нейронах Helix, а также в серотонинергических педальных клетках, которые могут быть вовлечены в оборонительное поведение (Balaban et al., 2001). Паттерн экспрессии HCS2 предполагает вовлечение CNP пептидов в оборонительное поведение. Подробно исследованы эффекты пептидов MIP-семейства на периферические и центральные нейроны аплизии (Fujisawa et al., 1999; McDearmid et al., 2002) и Helix (Kiss et al., 1999; Elekes et aL, 2000). МІР вызывал подавление спонтанных сокращений глотки у аплизии и Helix (Fujisawa et al., 1999; Elekes et ai, 2000), и ингибировал электрически вызванные тетанические сокращения мускула ретрактора члена аплизии (Fujisawa et at., 1999). В Helix (Elekes et ai., 2000) инъекция МІР в полость тела, индуцировала короткий период гиперактивности. Эти результаты свидетельствуют о возможном участии МІР-содержащих нейронов в поведении избегания, о котором известно, что оно у травоядных улиток подавляет другие виды поведения (пищевое, сексуальное). Предполагаемая роль CNP4 в поведении избегания в Helix, соответствует предполагаемой колокализации с МІР пептидами.
Исследование эффектов МІР на плевральных сенсорных нейронах апплизии (McDearmid et ah, 2002) показало новый тип пептидозависимого выходящего тока, который в основном был вызван увеличением калиевой проводимости. Таким образом, МІР-содержащие и возможно СКР4-содержащие нейроны не только морфологически входят в контакт с первичными сенсорными нейронами, являющимися посредниками в реакции; отдергивания хвоста, но пептиды синтезируемые в этих нейронах вызывают определенный эффект на VC клетки, что предполагает участие МІР и CNP4 иммунореактивных клеток в оборонительном поведении апплизии. Вентрокаудальные нейроны, иннервирующие хвостовую область, образуют моносинаптические связи с хвостовыми мотонейронами в ипсилатеральной части педального ганглия (Walters et al., 1983). Вентрокаудальные нейроны аплизии активируются стимуляцией дискретных областей хвоста. Стимуляция рецептивных полей на всем протяжении поверхности тела, вызывает синаптически опосредованные гиперполяризационные ответы, что, возможно,, представляет афферентное ингибирование (Walters et al., 1983). В апплизии, в областях, занятых CNP4 иммунореактивными нейронами, были описаны две клетки, ингибирующие VC нейроны (Xu et aL, 1994), а одна из ингибирующих клеток содержала FMRFamid. Существенно, что гигантские СКР4-содержащие нейроны оборонительного поведения Helix, также содержат FMRF-amide (Elekes et aL, 1990). Таким образом, у апплизии МІР-содержащие нейроны в плевральном ганглии образуют функциональные связи с плевральными VC нейронами. По-видимому, они секретируют МІР и CNP пептиды при оборонительном поведении, модулируя рефлекс отдергивания хвоста.
Одним из подходов к изучению функции какого-либо гена является его селективная блокада с исследованием последствий такого воздействия. Как уже было сказано, включение компенсаторных механизмов, свойственное методу нокаута, вызывает необходимость поиска методов блокады генной экспрессии у взрослых животных. Мы испытали три основных метода селективной блокады генной экспрессии, на одиночных нейронах виноградной улитки. В качестве блокируемого гена был взят HCS2, который имеет высокий уровень экспрессии, обеспечивающий стабильную детекцию белкового продукта методами иммунохимии (вестерн-блоттинг и whole-mount иммунохимия). Кроме того, данный ген экспрессируется в двух парах гигантских нейронов, что делает возможным использовать клетки одного животного и в опыте, и в контроле, максимально уменьшив влияние различий между отдельными особями в уровне экспрессии.
Антисмысловую мРНК HCS2 синтезировали с ТЗ промотора плазмиды pBSK П+, в которую предварительно был заклонирован изучаемый ген. Получаемая мРНК кэпировалась для повышения устойчивости к деградации в нейронах. мРНК после переосаждения растворялась в воде с конечной концентрацией 1 мкг/мкл и инъецировалась в командные нейроны париетального ганглия. Через трое суток ЦНС улитки фиксировалась и окрашивалась антителами к белку HCS2. Изменения в уровне экспрессии данного белка обнаружено не было. Такие же результаты дал второй испытанный нами метод селективной блокады экспрессии HCS2, а именно использование двуцепочечной мРНК (dsRNA). Инъекция была в среднем по 20пг и 50пг dsRNA в один из командных нейронов париетального ганглия (инкубация 14, 24 и 36 часов). Экспрессию детектировали методами вестерн-блоттинга и whole-mount иммунохимии. Как было сказано в литературном обзоре, успех использования методов интерференции РНК существенно зависит от наличия в клетках изучаемого животного специфических механизмов, запускающих расщепление мРНК к которой вырабатывается комплементарная антисмысловая РНК или двуцепочечная РНК. Наши эксперименты показывают отсутствие таких механизмов в командных нейронах париетального ганглия виноградной улитки.
