Введение к работе
Актуальность исследования Известно, что в долговременных формах пластичности важную роль играют ионы кальция (Hawkins R D et al, 1993, Schaffhausen J H et al, 2001, Balaban P M et al, 2004) Ионы Ca2+ участвуют в регуляции разнообразных нейрональных процессов, что обусловлено их специфическими физико-химическими характеристиками, благодаря которым они являются наиболее универсальными внутриклеточными посредниками (Костюк П Г и др , 1998, Бухараева Э А и др , 2001, Зефиров А Л , Ситдикова Г Ф , 2002, Rizzuto R et al, 2002, Rusakov D A , 2006) Ионы Ca2+, осуществляя связь между электрическими явлениями, происходящими в поверхностной мембране клетки, и реакциями, протекающими внутри нее, принимают непосредственное участие в интегративной деятельности нервной клетки (Berndge М J, 1998, Verkhratsky А , 2005) Исключительно высокая способность внутриклеточной среды связывать Са2+ определяется наличием в ней эффективных буферных систем Они состоят главным образом из Са2+-связывающих белков (Костюк П Г, 1986, Впш М, Carafoli Е, 2000) Все Са2+-связывающие белки классифицируют на три группы EF-hand белки, Са2+/фософолипид-связывающие белки и Са2+-запасающие белки (Braunewell К -Н , Gundelfmger Е D , 1999, Северин ЕС и др , 2001) Интенсивно исследуются в последнее время функции такого Са2+-связывающего белка, как белок S100 (Heizmann С W et al, 2002, Donate R, 2003)
S100 - это группа белков, характеризуемых наличием Са2+- связывающих доменов и наличием таких фундаментальных свойств как ткане- (мозго-) специфичность, эволюционная стабильность- и способность связывать Са2+, взаимодействуя с ними (Baudier J , et al, 1986, Kubista H et al, 1999, Santamana-ICisiel L et al, 2006) Эволюционная стабильность этого белка была отмечена еще в первых исследованиях его распределения в тканях разных животных S100 обнаруживаются у всех позвоночных (Moore В W, 1973) и у многих беспозвоночных (Donate R , 1999), например, у виноградной улитки (Jankovic В D , 1985, Штарк МБ, 1985, Kubista Н et al, 1996) Функции белков S100 можно разделить на внутриклеточные и внеклеточные (Donate 4R, 1999, 2003) Внутриклеточные функции белков S100 разделяются по следующим разделам регуляция фосфорилирования белков, регуляция ферментативной активности, регуляция Са2+-гомеостаза, регуляция динамики цитоскелета и его компонентов Внеклеточные функции белков S100 разделяются по следующим разделам нейротропные эффекты дисульфидно-связанного димера белка S100, участие этого белка в дегенеративных заболеваниях, участие в формировании когнитивного поведения и ряд других функций Белок S100B является успешным маркером
мозговых нарушений (Anderson RE et al, 2001, PelmkaL E et al, 2004, Delgado P et al, 2006)
Оксид азота (IS) (NO) является внутри- и межклеточным посредником, выполняющим различные сигнальные функции (Schuman Е М , Madison D V , 1994, Ванин А Ф , 1998, Реутов В П и др , 1998, Уразаев А X , Зефиров А Л , 1999) В последние годы NO-синтезирующие нейроны обнаружены и в нервной системе беспозвоночных, в том числе моллюсков (Huang Е Р , 1997, Gelperm A et al, 2000) Показано, что серотонин и доноры NO взаимно усиливают эффекты друг друга (Дьяконова ТЛ, 2000) Найдены доказательства, что белок S100B производит нейротоксический эффект m vitro, вызывая апоптоз как в нейрональных, так и глиальных клетках за счет активации NO-синтазной активности (Ни J et al, 1996) Имеющиеся результаты предполагают, что пока белок S100B удерживается внутри клетки на физиологическом уровне экспрессии он оказывает протекторный эффект, в то время как повышение или понижение его концентрации будут нарушать нормальное протекание процессов в клетке (Scotto С et al, 1998)
Молекулярные механизмы сохранения следов памяти широко исследуются в контексте взаимоотношений ассоциативного обучения с сенситизацией как элементарной формой обучения, при которой животное учится усилению ответной реакции на ранее неэффективный стимул, следующей за нанесением сильных стимулов в другом участке (Балабан П М , Захаров И С , 1992, Гайнутдинов X Л и др., 2002) В настоящее время большое внимание привлекает такая нейробиологическая модель долговременных модификаций поведения как долговременная сенситизация (ДС) (Cleary L J et al, 1998, Philips G T et al, 2006) Она позволяет успешно исследовать мембранные механизмы формирования устойчивых очагов возбуждения в нервной системе животного (Castellucci V F et al, 1986, Гайнутдинов X Л , Береговой Н А , 1994, Никитин В П , Козырев С А , 1995, Antzoulatos Е G, Byrne J Н, 2007) ДС, являясь видонеспецифическим феноменом, т е присущим животным разного уровня организации (Кэндел Э, 1980, Antzoulatos EG et al, 2006), позволяет проводить исследование реакций высших животных на относительно простых объектах или моделях, удобных для анализа
Таким образом, анализ литературы показывает, что роль Саг+-связывающего белка S100B, кальциевой системы, а также NO в проявлении долговременных эффектов сенситизации на уровне поведения животного и характеристик нейрональной мембраны выяснены недостаточно и их исследования являются актуальными
Цель и основные задачи исследования. Целью работы явилось исследование эффектов действия антител к Са2+-связываюш,ему белку S100B на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки и на нарушения локомоции тепловым стрессом и сенсорной изоляцией у нематоды С elegans В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи
-
провести анализ эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на формирование долговременной сенситизации у виноградной улитки,
-
исследовать мембранные механизмы и роль оксида азота в развитии эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на формирование долговременной сенситизации,
-
провести анализ эффектов действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на нарушения локомоции у нематоды С elegans тепловым стрессом,
-
исследовать эффекты действия антител к Са2+-связывающему белку S100B на нарушения локомоции у нематоды С elegans сенсорной изоляцией
Положения, выносимые на защиту
-
Введение антител к Са2т-связывающему белку S100 в разведении 10"12 перед началом формирования долговременной сенситизации оказывает протекторный эффект на оборонительное поведение виноградной улитки Найдено, что данный протекторный эффект сопровождается частичным восстановлением мембранного и порогового потенциалов командных нейронов и уровня синтеза оксида азота в нервной системе и сердце виноградной улитки
-
Преинкубация нематоды С elegans в среде, содержащей антитела к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10"12, повышает как базовую термостабильность локомоции С elegans, так и эффективность быстрой адаптации червей к переносимому организмом повышению температуры среды (вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированного повышением температуры)
Научная новизна Впервые обнаружено, что введение антител к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10"12 препятствует формированию ДС оборонительных реакций у виноградной улитки без влияния на двигательную активность животного Впервые найдено, что при предварительном введении антител к Са2"*-связывающему белку S100 при нанесении электрошоков улитке мембранный и пороговый потенциалы командных нейронов имеют более высокое значение, чем после ДС Экспериментально методом ЭПР спектроскопии показано, что после формирования ДС в нервной системе и сердце виноградной улитки происходит снижение продукции NO Впервые найдено, что протекторный эффект
антител к Са -связывающему белку S100 у виноградной улитки сопровождается частичным восстановлением уровня синтеза N0 в нервной системе и сердце
Впервые показано, что преинкубация С elegans при 20С в среде, содержащей антитела к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10"12, вызывает увеличение среднего времени появления ошибок моторной программы плавания, индуцированного повышением температуры до 36С Впервые показано, что ингибитор синтеза белков циклогексимид не оказывает влияния на эффективность адаптации С elegans к высокой температуре, т е экспрессия генов стрессовых белков не может быть причиной повышения термостабильности локомоции С elegans двухчасовой экспозицией к температуре +30С Впервые показано, что AS 100 в разведении 10"12 замедляют развитие нарушений спонтанной локомоции сенсорной изоляцией, причем максимальный протекторный эффект AS 100 наблюдается в первые 30 минут изоляции
Научно-практическая ценность Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли Са2+-связывающих белков в механизмах пластичности и в изменениях поведения Протекторный эффект антител к Са2+-связывающему белку S100 в разведении 10"12 при применении перед началом формирования нейробиологической модели тревожности и депрессивного состояния позволяет определить пути поиска фармакологических веществ, способных влиять на нарушения поведения Полученные результаты, видимо, свидетельствуют, что дисбаланс Са2+-связывающего белка S100 может привести к торможению или изменению хода определенных процессов, развивающихся при формировании пластических перестроек в организме и, особенно при патологических процессах Полученные результаты позволяют составить более полное представление о роли NO в механизмах ДС Полученные результаты могут помочь в выборе стратегии применения фармакологических веществ при нарушениях поведения и деятельности нервной системы Полученные результаты используются при чтении курсов лекций в КГУ и ТГГПУ.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kaliningrad, 2003 г), Международной научной конференции «Актуальные проблемы экологической физиологии, биохимии и генетики животных» (Саранск, 2005 г), 9-ой и 10-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых (Пущино, 2005, 2006 гг), 9-ой Всероссийской конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2006 г), Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kazan, 2006 r), VIII Всероссийском
симпозиуме "Растущий организм" (Казань, 2006 г), Международном симпозиуме "Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции клеточных функций в норме и при патологии" (Гродно, 2006 г), Самойловских чтениях (Казань, 2007 г), XX съезде физиологического общества имени И П Павлова (Москва, 2007 г), International Conference "Modern Developments in Magnetic Resonance Imaging and Spectroscopy in Medicine" (Kazan, 2007 г )
Реализация результатов исследования Материалы исследования отражены в 4 статьях, опубликованных в рецензируемых журналах, и в 16 тезисах докладов
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа объемом 142 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания объекта и методов исследования, главы результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы Список цитируемой литературы включает 275 источника, из них 173 - иностранных авторов Диссертация иллюстрирована 30 рисунками
