Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
Меланокортиновая система 10
Природные меланокортины 10
Рецепторы меланокортинов 18
Эндогенные антагонисты МС рецепторов 27
Физиологические эффекты меланокортинов 29
Стероидогенная активность 30
Меланокортины и пигментация 31
Ноотропные эффекты меланокортинов 32
Влияние меланокортинов на двигательную активность
и эмоциональное состояние животных 38
Нейропротекторные и нейротрофические эффекты меланокортинов:
- регенерация нервов и протекторное влияние меланокортинов 41
- влияние меланокортинов на развивающуюся нервную систему 45
Действие меланокортинов на сердечно-сосудистую систему 50
Влияние меланокортинов на болевую чувствительность 52
Взаимодействие меланокортинов с опиоидной системой 55
Влияние меланокортинов на иммунную систему 58
Влияние меланокортинов на пищевое поведение и вес тела
Влияние меланокортинов на половое поведение 71
Регуляция функции экзокринных желез 73
Влияние меланокортинов на медиаторные системы мозга 74
Синтетические аналоги меланокортинов 78
Семакс - аналог актг4-ю пролонгированного действия 83
Экспериментальная часть материалы и методы исследования 92
Методы оценки двигательной активности, исследовательского поведения, уровня тревожности и депрессивных составляющих поведения животных
Методы оценки способности животных к обучению
Методы оценки уровня физической выносливости
Методы оценки болевой чувствительности животных
Исследование изменений поведения и болевой чувствительности животных, вызванных стрессогенным воздействием
Регистрация электрокардиограммы крыс
Статистическая обработка данных
Результаты и обсуждение
Оценка спектра физиологической активности семакса
Глава 1 Исследование ноотропных эффектов семакса в различных экспериментальных условиях
Глава 2 Изучение влияния семакса на исследовательскую активность и эмоциональное состояние животных
Глава 3 Исследование нейропротекторных эффектов семакса на фоне нарушений дофаминергической системы мозга крыс
Глава 4 Исследование отставленных поведенческих эффектов хронического неонатального введения семакса детенышам белых крыс
Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение первой недели постнатального развития крыс
Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение второй недели постнатального развития крыс
Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение второй-третьей недель постнатального развития крыс
Отставленные эффекты хронического интраназального введения семакса в течение второй-третьей недель постнатального развития крыс
Исследование влияния однократного введения семакса на поведение и способность к обучению детенышей белых крыс
Исследование отставленного воздействия используемых экспериментальных манипуляций в неонатальный период развития детенышей белых крыс
Глава 5 Исследование кардиотропных эффектов семакса
Глава 6 Исследование влияния семакса на болевую чувствительность животных 97 98
6.1 Изучение анальгетических эффектов семакса в различных 196 экспериментальных моделях
6.2 Исследование влияния АКТГ4.10 на болевую чувствительность 204 животных
6.3 Исследование анальгетических эффектов семакса на фоне фармакологически вызванных изменений серотонинергической и 2Л7 опиоидной систем
Глава 7 Исследование взаимодействия семакса с опиоидной системой 215
7.1 Влияние семакса на анальгезию, вызванную введением морфина 215
7.2 Влияние семакса на стресс-вызванную анальгезию 217
II Изучение зависимости эффектов синтетических меланокортинов от структуры
Глава 8 Исследование ноотропных эффектов фрагмента семакса гексапептида EHFPGP 227
Глава 9 Изучение ноотропных эффектов продуктов ферментативной деградации семакса 239
Глава 10 Влияние модификации N-концевой области молекулы на ноотропные эффекты аналогов семакса 246
10.1 Зависимость выраженности ноотропного действия аналогов семакса от N-концевого аминокислотного остатка
10.2 Влияние модификации N-концевой области молекулы на длительность ноотропного действия аналогов семакса
Глава 11 Изучение нейротропных эффектов структурного аналога АКТГ5.7 - трипептида ERP 273
Глава 12 Зависимость анальгетической активности синтетических меланокортинов от структуры 280
Заключение 288
Выводы 304
Список цитируемой литературы
- Физиологические эффекты меланокортинов
- Влияние меланокортинов на половое поведение
- Исследование изменений поведения и болевой чувствительности животных, вызванных стрессогенным воздействием
- Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение первой недели постнатального развития крыс
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной физиологии и фармакологии является разработка и исследование новых нейротропных лекарственных препаратов Создание фармакологических средств, стимулирующих когнитивные функции мозга и способных оказывать нейропротекторное действие в условиях различных патологий центральной нервной системы, особенно важно в настоящее время Это определяется увеличением стрессорной нагрузки и длительным психическим напряжением, сопровождающим многие сферы деятельности человека Все это, наряду со многими другими факторами, приводит к росту различных неврологических заболеваний [Середенин, 2006] При разработке новых эффективных и безопасных лекарственных препаратов исследователи обращаются к использованию эндогенных регуляторов организма, в первую очередь регуляторным пептидам В настоящее время показано, что вещества пептидной природы являются прямыми или опосредованными регуляторами многих важных физиологических процессов в организме [Ашмарин и др, 2002, 2006] Область биологической активности регуляторных пептидов чрезвычайно широка Вещества этой группы определяют состояние кровеносной, иммунной и других систем Важную роль играют пептиды в регуляции состояния центральной нервной системы Одним из активно исследуемых классов эндогенных пептидных регуляторов являются АКТГУМСГ-подобные пептиды, объединяемые в настоящее время термином меланокортины (МК) Интерес к данным соединениям вызван тем, что пептиды этого класса обладают широким спектром физиологической активности Многочисленные эксперименты, проводившиеся в последние десятилетия как в нашей стране, так и за рубежом, показали, что МК, помимо известного гормонального действия, улучшают обучение и внимание, влияют на мотивационные процессы, ускоряют регенерацию в нервно-мышечной системе, оказывают протекторное действие при повреждениях в ЦНС, воздействуют на развитие нервной системы, модулируют половое поведение, оказывают противовоспалительное и жаропонижающее действие, взаимодействуют с опиоидной системой, влияют на болевую чувствительность и сердечно-сосудистую систему, вызывают снижение потребления пищи и веса тела, влияют на функционирование экзокринных желез [Starowicz, Przewlocka, 2003, Adan, Gispen, 1997, Catania et al, 2000, Cone, 2005,] Использование коротких фрагментов природных гормонов позволило отделить эндокринные (кортикотропные и меланотропные) свойства исходных молекул от их экстрагормонального действия
2 Однако, несмотря на многочисленные исследования нейротропной активности МК и их рецепторов, механизмы, лежащие в основе различных эффектов пептидов этого класса, во многом остаются неясными [Adan, Gispen, 2000, Wikberg, 2000]
Доказательство широкого спектра физиологической активности МК и открытие семейства их рецепторов предоставило новые возможности для исследования веществ, потенциально применимых в клинике при различных патологиях [Adan, Gispen, 1997, Catania et al, 2000, Cone, 2005] Препятствием для использования природных МК в клинике является низкая биодоступность этих пептидов при системном введении Для создания лекарственных препаратов на основе АКТГ-подобных пептидов необходимо было разработать их стабилизированные аналоги, лишенные гормональных эффектов [Wikberg, 2000] Многими исследователями были предприняты попытки создания высокоэффективных аналогов фрагментов АКТГ путем различных модификаций первичной структуры молекулы В ходе этих экспериментов были разработаны аналоги природных МК, лишенные гормональных эффектов, обладающие выраженной биологической активностью и высокой устойчивостью к действию протеаз В результате многолетних исследований был разработан аналог АКТГ4-10 пролонгированного действия - семакс, структура которого включает в себя фрагмент АКТГ4-7 и трипептид Pro-Gly-Pro [Пономарева-Степная и др, 1984] Исследования активности этого пептида в экспериментах на животных показали, что он улучшает память и внимание, обладает антигипоксическим и антигеморрагическими эффектами, способствует уменьшению тяжести клинических и нейрофизиологических проявлений экспериментального ишемического инсульта [Ashmarm et al, 1995] Клинические исследования показали его высокую эффективность при лечении интеллектуально-мнестических расстройств различного генеза, а также при профилактике и лечении постнаркозных мнестических нарушений Введение семакса оказывает выраженное позитивное действие при лечении инсульта [Ашмарин и др, 1997] На сегодняшний день этот пептид является единственным широко используемым в клинике лекарственным нейротропным препаратом, разработанным на основе фрагментов АКТГ Несмотря на то, что лекарственные препараты, разработанные на основе семакса, уже более 10 лет используются в клинической практике, исследования физиологических эффектов этого пептида, направленные на выяснение механизмов его действия и на расширение спектра клинического применения препарата, продолжаются
До настоящего времени не определен спектр физиологической активности семакса, не выяснены механизмы, лежащие в основе его пролонгированного
действия, не изучена зависимость структура - активность для отдельных составляющих биологической активности препарата, не выявлено значение отдельных структурных элементов молекулы для сохранения его неиротропных эффектов Изучение нейропротекторных эффектов семакса на экспериментальных моделях различных патологических состояний позволит расширить возможности клинического применения этого препарата Кроме того, практически все исследования эффектов данного пептида проводили в экспериментах на взрослых животных, поэтому актуальной задачей является оценка вероятных последствий воздействия семакса на развивающийся мозг с целью определения его возможных отставленных эффектов Также важной задачей является оценка ноцицептивных эффектов семакса в норме и на фоне изменения активности различных медиаторных систем Полученные данные могут способствовать выяснению механизмов действия и расширению клинического применения лекарственного препарата семакс
Цели и задачи исследования. Целью представленной работы являлось изучение спектра физиологической активности семакса и оценка зависимости эффектов препарата от структуры
Перед нами были поставлены следующие задачи
исследование зависимости ноотропных эффектов семакса от времени, дозы, способа введения и вида подкрепляющего раздражителя,
изучение влияния семакса на исследовательскую активность и эмоциональное состояние животных,
исследование протекторного действия пептида на фоне фармакологически-вызванных нарушений дофаминергической системы мозга,
оценка последствий хронического неонатального введения семакса детенышам белых крыс,
изучение влияния семакса на параметры сердечного ритма крыс,
исследование влияния семакса на болевую чувствительность животных,
изучение взаимодействия пептида с опиоидной системой мозга,
исследование влияния модификации N-концевой области молекулы семакса на сохранение и длительность его ноотропного действия,
изучение зависимости анальгетических эффектов ряда синтетических МК от структуры
4 Научная новизна В представленной работе впервые детально исследованы физиологические эффекты гептапептида семакс в экспериментах на животных Изучено ноотропное действие пептида в различных экспериментальных моделях при внутрибрюшинном и интраназальном способах введения в организм Выявлена анксиолитическая и антидепрессантная активность препарата В работе исследованы эффекты семакса на фоне фармакологически вызванных нарушений дофаминергической системы мозга Показано, что интраназальное введение препарата способствует функциональному восстановлению животных при МФТП-вызванной модели нарушения этой системы Исследованы эффекты семакса в период развития нервной системы животных, полученные результаты свидетельствуют о модулирующем влиянии семакса на развитие нервной системы Впервые проведено исследование влияния семакса на параметры сердечного ритма крыс Изучено анальгетическое действие гептапептида семакс в экспериментах на животных, проведено сопоставление антиноцицептивного действия препарата в различных экспериментальных моделях При исследовании механизмов влияния семакса на болевую чувствительность животных впервые показана роль серотонинергической и опиоидной систем в реализации анальгетических эффектов семакса Продемонстрированы антиопиоидные свойства семакса, которые были отмечены как на фоне активации эндогенной опиоидной системы, так и при введении экзогенных опиоидов Показано, что семакс более эффективно улучшает обучение животных при интраназальном, чем при внутрибрюшинном введении, что доказывает преимущество интраназального способа введения пептида в организм Впервые изучены физиологические эффекты семакса в дозах, соответствующих рекомендованным для однократного введения дозам препаратов "Семакс 0,1%" и "Семакс 1%" Впервые исследованы ноотропные эффекты продуктов ферментативной деградации семакса, что позволило высказать предположения о механизмах его пролонгированного действия Исследована зависимость ноотропных и анальгетических эффектов ряда синтетических аналогов меланокортинов от структуры Доказана важная роль N-концевого аминокислотного остатка для сохранения нейротропной активности пептида
Основные положения, выносимые на защиту
1 Аналог АКТГ4.ю гептапептид семакс, как и природные меланокортины, обладает широким спектром нейротропной активности Этот препарат оказывает ноотропное, нейропротекторное, анксиолитическое, антидепрессантное, анальгетическое и антиопиоидное действие, влияет на развитие нервной системы В
5 основе перечисленных эффектов семакса могут лежать различные механизмы, в частности, увеличение экспрессии неиротрофических факторов в мозге и изменение функциональной активности системы биогенных аминов
2 В основе пролонгированного действия семакса лежит выраженная физиологическая активность и высокая протеолитическая устойчивость продуктов его ферментативной деградации Модификация N-концевой области молекулы семакса приводит к изменению как ноотропной, так и анальгетической активности пептида, что может быть связано с изменением скорости и путей протеолитической деградации пептида
Теоретическая и практическая значимость работы Полученные данные позволяют расширить представления о нейротропных воздействиях синтетических аналогов меланокортинов, способствуют определению спектра биологической активности аналога АКТГ4-ю семакса и выяснению механизмов, лежащих в основе эффектов этого пептида, позволяют сделать предположения о зависимости нейротропных эффектов меланокортинов от структуры Полученные результаты могут послужить основой для расширения спектра применения лекарственных препаратов, разработанных на основе пептида семакс Эти препараты могут быть использованы для лечения патологий у детей в ранний постнатальный период, в терапии болезни Паркинсона, в качестве анксиолитического и антидепрессантного средства и, возможно, в наркологической практике
Апробация работы Основные положения работы были представлены на Российских и международных научных конференциях и симпозиумах, в том числе 5-th Meeting of the European Behavioral Pharmacology Society (UK, 1994), 1-й съезд Российского научного общества фармакологов (Волгоград, 1995), Meeting of European Neuroscience, (Berlin, Germany, 1998), конференция "Роль нейромедиаторов и регуляторных пептидов в процессах жизнедеятельности" (Минск, Беларусь, 1999), II и III Российский конгресс по патофизиологии (Москва, 2000, 2004), XXX Всеросийское совещание по проблемам высшей нервной деятельности (С -Петербург, 2000), XVIII, XIX и XX съездах физиологического общества им И П Павлова (Казань, 2001, Екатеринбург, 2004, Москва, 2007), 7-th Regional Meeting of European College of Neuropsychopharmacology (2002), III съезд биохимического общества (С -Петербург, 2002), Российский симпозиум по химии и биологии пептидов (Москва, 2003, С -Петербург, 2005), 2-й Съезд Российского Научного Общества фармакологов (Москва, 2003), научная конференция «Нейрохимия
фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), I съезд физиологов СНГ (Сочи, 2005), 5-th Forum of European Neuroscience (Vienna, Austria, 2006) Результаты диссертационной работы были представлены на совместном заседании кафедры физиологии человека и животных биологического факультета МГУ им MB Ломоносова и Отдела химии физиологически активных веществ института молекулярной генетики РАН (май 2007 г)
По теме диссертации опубликовано более 90 печатных работ, в том числе 31 статья в рецензируемых журналах, получено 2 патента на изобретение
Работа выполнена при финансовой поддержке Программы фундаментальных исследований Президиума РАН "Молекулярная и клеточная биология", Программы "Ведущие научные школы РФ", Российского фонда фундаментальных исследований
Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы Работа изложена на 345 страницах, содержит 132 рисунка и 18 таблиц Список литературы включает 478 источников
Физиологические эффекты меланокортинов
К семейству природных меланокортинов (МК) относятся АКТГ, а-, Р-, у-МСГ и фрагменты этих гормонов. Все природные МК образуются из 31-36-кДа белка-предшественника - проопиомеланокортина (ПОМК) [Eipper et al., 1980; Розен, 1994]. х-МСГ был впервые выделен из гипофизарного экстракта в 1955 году, как один из первых пептидных гормонов. Далее была описана аминокислотная (а.к.) последовательность АКТГ и Р-МСГ. Анализ а.к. последовательности выделенных пептидов показал, что а-МСГ является фрагментом молекуля АКТГ, а Р-МСГ - частью последовательности р-липотропина. В конце семидесятых годов была определена структура предшественника этих пептидов - прогормона ПОМК [Nakanishi et al., 1979], а позже было обнаружено, что мРНК этого белка экспрессируется не только в гипофизе, но и в других регионах мозга и в периферических тканях [Wikberg, 1999; Gantz, Fong, 2003].
ПОМК состоит из 264-267 аминокислотных остатков и содержит в себе последовательности не только АКТГ и всех трех видов МСГ, но также липотропина, а-, р - и у-эндорфинов и Met-энкефалина [Nakanishi et al., 1979; Мертвецов, 1999]. Основным регионом, в котором экспрессируется этот белок, являются передняя и промежуточная доли гипофиза. Концентрация ПОМК мРНК в гипофизе на один-два порядка превышает ее концентрацию в других регионах мозга [Slominski et al., 2000]. В гипофизе человека в норме ПОМК синтезируется только кортикотрофами передней доли, так как промежуточная доля у взрослого человека отсутствует. В передней доле гипофиза человека синтезируется ПОМК мРНК, которая транслируется в молекулу ПОМК, состоящую из 267 а.к. Эта молекула начинается с 26-а.к. сигнального пептида, необходимого для переноса белка через мембрану эндоплазматического ретикулюма, после чего пептид отщепляется [Raffin-Sanson et al., 2003].
Иммунохимические исследования показали широкое распространение меланокортинов в различных структурах ЦНС [Gantz, Fong, 2003; Slominsky et al., 2000]. MK могут попадать в мозг благодаря ретроградному кровотоку от гипофиза. Однако гипофиз не является единственным источником МК - синтез этих пептидов происходит также непосредственно в тканях мозга, где обнаружены ПОМК-содержащие нейроны [Tonnaer et al., 1982]. Клеточные тела данных нейронов локализованны главным образом в вентромедиалыюй части гипоталамуса, в частности, на уровне аркуатного ядра и, в меньшей степени, в дорсальном гипоталамусе и амигдале, а также в ядре солитарного тракта в стволе мозга [Gantz, Fong, 2003]. В этих нейронах экспрессируется ПОМК мРНК идентичная гипофизарной и синтезируется ПОМК, который служит предшественником мозговых р-эндорфина, сс-МСГ и других пептидов [Gee et al., 1983; Raffin-Sanson et al., 2003]. Гипоталамические нейроны образуют сеть разветвленных волокон, проникающих в различные структуры головного мозга. Самая высокая концентрация ПОМК обнаружена в медиальной субстанции: области, локализованной в переднем перивентрикулярном гипоталамусе, откуда исходит гипофизарный портальный тракт, подходящий к передней доле гипофиза. Другие нервные волокна идут в амигдалу и лимбическую систему к околоводопроводному серому веществу, тегментуму, голубому пятну, гиппокампу и неокортексу. В мозге крыс высокие концентрации МК обнаружены в нижних ядрах ствола мозга, в околоводопроводном сером веществе, дорсальном ядре шва; средние - в голубом пятне, парабранхиальных ядрах, большом ядре шва и ядре солитарного тракта. Предполагается, что МК в ядре солитарного тракта имеет местное происхождение, а ретикулярная формация продолговатого мозга может получать МК-содержащую иннервацию от соответствующих нейронов гипоталамуса и продолговатого мозга [Глебов, Горячева, 1990; Starowicz, Przewlocka, 2003]. Меланокортины были обнаружены также во многих периферических тканях, таких как органы кровообращения, почки, желудочно-кишечный тракт, поджелудочная железа, надпочечники, легкие, селезенка, семенники, яичники, плацента и кератиноциты и меланоциты кожи [Eberle, 1988; Wikberg, 1999]. Многими исследователями показано существование ПОМК мРНК в различных типах тканей помимо перечисленных выше, однако в большинстве случаев экспрессия белка качественно и количественно отличается от той, что наблюдается в гипофизе - образуется в низких концентрациях укороченная нефункциональная мРНК, которая в ПОМК не транслируется [Raffin-Sansonetal.,2003].
У большинства млекопитающих идентифицирован единственный ген ПОМК. В геноме человека этот ген локализован в коротком плече хромосомы 2 [Owerbach et al., 1981]. Исключение составляет геном мыши, который содержит два неаллельных гена, кодирующих мРНК ПОМК - а- и р-гены. Однако только один из них (а-ген) оказался функционально активным, а другой - псевдогеном [Slominski et al., 2000; Мертвецов, 1999]. Показано, что мутации, нарушающие трансляцию гена ПОМК у человека, приводят к тяжелой глюкокортикоидной недостаточности, а также, гипоглекемии, ожирению, которое развивается с первых лет жизни, красно-оранжевой окраске волос и светлой коже [Krude, Gruters, 2000].
В процессе аксонального транспорта ПОМК подвергается серии протеолитических расщеплений и химических трансформаций, которые приводят к образованию различных биологически активных пептидов. Расщепление ПОМК происходит по парам основных а.к. остатков (Arg-Lys, Lys-Arg, Lys-Lys, Arg-Arg); в последовательности белка присутствует 8 пар и 1 квадриплет таких остатков [Raffin-Sanson et al., 2003]. В зависимости от типа тканей и региона мозга происходит разрыв различных сайтов протеолитического расщепления и, следовательно, образование различных пептидных продуктов [Eipper, Mains, 1981].
Посттрансляционный процессинг ПОМК осуществляется специфическими ферментами - прогормонконвертазами РС1 и РС2, которые относятся к семейству сериновых протеаз. Ферменты РС1 и РС2 узнают пары основных аминокислот и разрывают связи между ними. Затем карбоксипептидаза Е отщепляет С-концевые основные а.к. остатки [Zhou, Mains, 1994]. Альтернативность процессинга ПОМК показана для передней и промежуточной долей гипофиза. Хотя структура ПОМК одинакова в обеих долях гипофиза, протеолитический процессинг приводит к образованию различных пептидных продуктов [Eipper, Mains, 1980]. В передней дозе гипофиза присутствует только РС1, под действием этого фермента расщепляется 4 сайта. В результате в передней доле образуется 6 пептидов - N-терминальный пептид (NT), соединительный пептид (СП), АКТГ, р-липотропин и небольшие количества у-липотропина и р-эндорфина, т.к. последний сайт расщепления подвергается незначительному воздействию. В других регионах (промежуточной доле гипофиза, гипоталамусе, коже) присутствуют оба фермента, и их совместное действие приводит к расщеплению связей между всеми парами основных а.к. остатков и образованию более коротких пептидов. Из NT образуется у-МСГ, из АКТГ - а-МСГ и CLIP (corticotrophin-like intermediate lobe peptide, кортикотропиноподобный пептид промежуточной доли), из Р-липотропина - Р-МСГ, р-зндорфині-зі и р-зндорфині.27 (рис. 1) [Zhou et al., 1993]. В зависимости от сайта расщепления N-концевого пептида образуется один из видов у-МСГ (yi-, у2- или 7з-МСГ), которые отличаются друг от друга длиной аминокислотной последовательности. 71-МСГ и уг-МСГ представляют собой 11- и 12- а.к. пептиды, соответственно, в уз-МСГ пролонгирована С-концевая область. In vivo амидирование С-концевого остатка глицина в уг-МСГ приводит к образованию уі-МСГ [Oosterom et al., 1999].
Молекулы меланокортинов филогенетически очень древние и характеризуются высокой степенью консервативности, они незначительно изменились за последние несколько сотен миллионов лет. Кроме того, отмечено большое межвидовое сходство в структуре этих пептидов [Catania, Lipton, 1993]. Сопоставление а.к. последовательности ПОМК животных различных видов показал, что у всех млекопитающих биологически активные домены в белке-предшественнике расположены сходным образом и ограничены с обеих сторон парами положительно заряженных аминокислот. Исключение составляют ПОМК мыши и крысы, в которых одна пара а.к. остатков Arg-Arg заменена на Arg-Pro, в результате чего 71,2-МСГ не могут образоваться в ходе процессинга ПОМК [Smith, Funger, 1988]. Сравнительный анализ также показал, что степень консервативности а.к. последовательности ПОМК неравномерна по всей длине белка-предшественника, причем границы консервативных и вариабельных участков четко совпадают с границами биологически активных доменов белка [Мертвецов, 1999].
Влияние меланокортинов на половое поведение
Ряд структурных изменений, в том числе замена С-концевой СООН-группы, позволил получить два новых аналога фрагментов АКТГ - НОЕ 427 и ORG 31433 (рис. 8), которые оказались в 10-100 раз мощнее, чем ORG 2766. Однако, так же как и ORG 2766, в малых дозах эти пептиды облегчают выработку условных рефлексов, а в больших - нарушают процесс сохранения навыка. ORG 31433 существенно ускоряет функциональное восстановление после повреждения прилежащего ядра 6-OHDA [Wolterink et ah, 1991]. НОЕ 427 более устойчив к действию протеаз, чем ORG 2766, обладает большей липофильностью и, вероятно, поэтому более эффективен по сравнению с другими синтетическими аналогами при исследовании памяти и способности к обучению. Этот пептид при подкожном введении ликвидирует у крыс амнезию, вызванную электрошоком, улучшает обучение и память в различных тестах [Hock et al., 1988]. Показано, что даже единичное введение НОЕ 427 людям пожилого возраста с нарушением когнитивных функций, а также пациентам с болезнью Альцгеймера оказывало небольшое, по достоверное положительное влияние на внимание и настроение больных [Sieqfried, 1991].
Был синтезирован и исследован еще один аналог АКТГ4-ю - BIM-22015 (рис. 8). Изучение эффектов этого пептида на фоне повреждения фронтальной коры показало, что животные, получавшие BIM в течение 20 дней после операции, не отличались по уровню обучаемости от ложиооперированных в тесте водный лабиринт. Также исследовались долговременные эффекты BIM-22015, когда инъекции препарата прекращали за 30 дней до начала обучения. И в этом случае BIM оказывал нормализующее действие на оперированных животных [Attella et al., 1992].
Все перечисленные выше аналоги фрагментов АКТГ содержат D-аминокислоты. Однако введение в состав молекулы неприродных аминокислот ведет к появлению у пептида новых биологических свойств, которые в ряде случаев, нельзя считать полезными. В частности, накопление в стареющем организме неприродных D-аминокислот может, по мнению ряда авторов, быть причиной возникновения злокачественных новообразований. Кроме того, как уже указывалось, терапевтический диапазон аналогов АКТГ, содержащих D-аминокислоты, очень узок - введение доз 0.5-1.0 нг/кг ускоряет обучение, тогда как увеличение дозы всего до 5.0 нг/кг приводит к ухудшению сохранения навыка. Возможно именно по этой причине эти аналоги в настоящее время используются только в клинических экспериментах и лекарственные препараты на их основе не разработаны [Ашмарин и др., 1997]. Таким образом, включение энантиомеров природных аминокислот хоть и усиливает действие пептидов, но одновременно приводит к целому ряду неблагоприятных побочных последствий. Следовательно, необходимо было разработать принципиально иной способ продления "жизни" фрагментов АКТГ в организме. Открытие и клонирование МС рецепторов открыло пути идентификации их природных агонистов и антагонистов, а также синтетических соединений, проявляющих аффинность к МС рецепторам. Наибольшее внимание было уделено разработке синтетических аналогов а-МСГ. Одним из широко используемых синтетических пептидов является меланотан-1 - (Nle , D-Phe )a-MSH или NDP-MSH (структура аналогов представлена в табл. 2), который является наиболее мощным из линейных аналогов меланокортинов [Sawyer et al., 1980]. NDP-MSH проявляет свойства агониста MCR и обладает высокой аффинностью ко всем типам МС рецепторов, кроме MC2R. Степень его аффинности к MCR можно представить следующей последовательностью: MC1R MC3R MC4R MC5R.
Исследование структуры а-МСГ привели к разработке циклического пептида -меланотана-И (МТ-ІІ). MT-II активирует МС рецепторы, он является сильным, но не селективным агонистом рецепторов 3, 4 и 5 типа [Al-Obeidi et al., 1989]. Показано, что фрагмент а-МСГ с 6 по 9 а.к. - His6-Phe7-Arg8rp9, заключенный в лактамовое кольцо меланотана-И, является активным центром при взаимодействии с меланокортиновыми рецепторами. N-концевая область МТ-П - Ac-Nle , не включенная в лактамовое кольцо, является структурной особенностью определяющей селективность МТ-И к MC3R-MC5R человека. Данная последовательность не оказывает влияния на связывание, аффинность и активацию MC4R, но, вероятно, она необходима для полной aKTHBau,raiMC5R [Bednarek et al., 1999]. Показано, что МТ-Н при периферическом введении стимулирует меланогенез, а при центральном введении ингибирует потребление пищи [Wikberg et al., 2000]. Клинические исследования показали положительное действие МТ-П при лечении нарушения половой функции у мужчин [Wessellsetal., 1998].
Модификация молекулы МТ-Н привела к разработке SHU9119, который является селективным антагонистом MC3R и MC4R [Hurby et al., 1995]. SHU9119 представляет собой циклический лактамовый пептид. Позже был синтезирован еще один синтетический антагонист MCR-HS014, селективный антагонист MC4R [Wikberg, 1999]. Степень селективности данного лиганда к рецепторам 4 типа в 20, 30 и 200 раз выше, чем к МСЗ, МС1 и МС5 рецепторам, соответственно. Однако оба аналога, являясь антагонистами MC3/4R, проявляют агопистические свойства по отношению к МС рецепторам 1 и 5 типов. SHU9119 и HS014 широко используются в исследованиях механизмов, лежащих в основе различных эффектов МК пептидов и их рецепторов. Оба соединения при центральном введении увеличивают потребление пищи и вес тела [Wikberg et al., 2000].
В 1998 году был синтезирован и исследован селективный антагонист MC4R -HS024. Этот аналог связывался с MC4R с субнаномолярных концентрациях. HS024, также как SHU9119 и HS014, является антагонистом МСЗ и МС4 рецепторов, однако, в отличие от этих пептидов, по отношению к MC1R и MC5R, он также является антагонистом [Kask et al., 19986]. Внутримозговое введение HS024 также приводило к увеличению потребления пищи [Wikberg, 2001].
Дальнейшие исследования привели к разработке новых циклических МК аналогов: HS963, IIS964, HS005 и HS006, которые можно описать общей формулой [Cys4-X7-Cysn]a-MSH4-n, отличающейся только в 7 позиции [Schioth et al., 19986, Kask et al., 1998a]. В дальнейшем на основе HS964 были разработаны аналоги HS007, HS009 и HS011, в которых были сделаны замены в 5, 6 и 10 положениях. Исследование аффинности этих аналогов к MCR позволило авторам сделать заключение о важной роли последовательности АКТГб_9 (His -Phe7-Arg ip9) для связывания с рецепторами [Starowicz, Przewlocka, 2003].
Позднее были разработаны высоко селективные агонисты MC1R - MS05 и MS09. Оба пептида являются полными агонистами MC1R. MS09 более активен, однако его селективность по отношению к MC1R меньше, чем у MS05. MS05 привлекает внимание исследователей как возможное противовоспалительное средство [Brzoka et al., 1999].
Другим селективным агонистом MC1R является линейный аналог AKTIYcc-MCTV ю - НР-228. Этот аналог связывается с теми же рецепторами, что и а-МСГ (т.е MC1R и MC3-5R), однако наибольшая активность была показана в отношении MC1R. Исследования показали, что НР-228 способен снижать уровень TNF-a и IL-6 в крови мышей, которым вводили бактериальный ЛПС. Кроме того, введение этого пептида снижало отек конечности, вызванный введением каррагинана. НР-228 также снижал гиперальгезию и жар, вызванные введением IL-бр или ЛПС. В настоящее время проводятся клинические исследования аналога НР-228 [Wikberg, 2001].
Таким образом, за последние десятилетия разработано, синтезировано и исследовано большое количество синтетических агонистов и антагонистов меланокортиновых рецепторов. Применения этих соединений в экспериментах способствовало выяснению функций МС рецепторов различных типов. Однако большинство из этих соединений не может быть использовано в клинической практике, что связано с их низкой биодоступностью при периферическом введении. Хотя небольшие пептиды, такие как MT-II, способны, вероятно, проникать через ГЭБ, парентеральный способ введения этого препарата делает маловероятным его клиническое применение. Таким образом, необходима разработка синтетических аналогов МК, высокоэффективных при неинвазивных способах введения в организм [Wikberg, 2001].
Исследование изменений поведения и болевой чувствительности животных, вызванных стрессогенным воздействием
В наших экспериментах были использованы две модели нарушения функционирования ДА системы - введение нейротоксина МФТП и блокада ДА рецепторов галоперидолом.
МФТП, нейротоксин, избирательно поражающий дофаминергические нейроны черной субстанции, при системном введении вызывает паркинсонические симптомы у человека, нечеловекообразных обезьян и некоторых грызунов. К симптомам паркинсонизма относятся: ригидность, акинезия, дискинезия и снижение реакции на внешние стимулы [Schneider et al, 1998]. Эти симптомы могут проявляться не сразу после инъекции МФТП, т.к. при повреждении структур, обеспечивающих дофаминергическую функцию, активируются мощные компенсаторные механизмы, недопускающие резкого срыва системы. При восстановлении неврологического статуса у животных, которым вводили МФТП, уровень ДА в стриатуме доходит до уровня, который наблюдался в период до проявления симптомов [Dravid et al, 1984]. Возможность компенсации и восстановления нейрональных функций связана с перемежающейся активностью функционирующих структур [Крыжановский, 1973-1988], т.е. в норме, в морфологически и функционально однородном пуле моноаминергических нейронов структур мозга в каждый момент времени существуют популяции активно работающих нейронов, нейронов с более низкой активностью и молчащих клеток. При действии патогена эти структуры поражаются в различной степени. Наличие неповрежденных или малоповрежденных нервных элементов обеспечивает сохранение или восстановление функции [Крыжановский, 1995]. Одним из компенсаторных механизмов является усиление обмена ДА неповрежденными нейронами. О повышении интенсивности синтеза дофамина и усилении его высвобождения в ткани стриатума свидетельствует увеличение уровня его метаболитов [Bernheimer et al, 1973].
Проведенные нами эксперименты показали, что интраназальное введение семакса ослабляет нарушения поведения, вызванные однократной инъекцией нейротоксина МФТП. Введение пептида в меньшей дозе - 50 мкг/кг уменьшало выраженность нарушений поведения, вызванных введением нейротоксина, однако эффекты семакса в этой дозе были недостоверны. В большей дозе - 200 мкг/кг инъекции пептида в значительной мере нормализовали поведение животных. Крысы, которым вводили семакс в этой дозе, характеризовались более высокой двигательной и ориентировочной активностью и сниженным уровнем тревожности по сравнению с животными, получавшими только МФТП. Следовательно, интраназальное введение семакса способствует функциональному восстановлению животных с нарушениями ДА-ергической системы мозга. Однако для достижения значимого эффекта необходимо использовать большую дозу пептида, чем в случае ноотропного действия [Ashmarin et al, 1995].
Протекторные эффекты семакса на фоне действия МФТП могут осуществляться за счет различных механизмов. Показано, что введение семакса влияет на содержание и обмен моноаминов в мозге животных [Еремин и др., 2002, 2004а, б]. Модулирующее влияние пептида на ДА-ергическую систему мозга может лежать в основе нейропротекторного действия семакса при МФТП-вызванных нарушениях. Усиление синтеза и увеличение выброса ДА неповрежденными нейронами может привести к увеличению концентрации медиатора в стриатуме до уровня, характерного для бессимптомной стадии паркинсонизма. Показано также, что семакс увеличивает выживаемость нейронов в первичных культурах базальных ядер переднего мозга и усиливает экспрессию генов нейротрофических факторов NGF и BDNF в культурах глиальных клеток [Shadrina et al., 2001]. Кроме того, интраназальное введение пептида крысам приводит к увеличению содержания BDNF в гиппокампе и базальных ядрах переднего мозга [Долотов и др., 2003; Dolotov et al., 2006а, б]. Следовательно, наблюдаемые нами эффекты могут быть связаны с нейротрофической активностью семакса, обуславливающей ослабление повреждения и восстановление функции обратимо поврежденных ДА-синтезирующих нигростриатных нейронов.
Таким образом, в основе нейропротекторных эффектов семакса при МФТП-вызванных нарушениях ДА-ергической системы мозга может лежать как усиление компенсаторных процессов, необходимых для функционального восстановления, так и увеличение выживаемости нейронов.
Для оценки возможного модулирующего влияния семакса на ДА систему мозга нами иследовались эффекты этого пептида на фоне блокады ДА рецепторов галоперидолом. Галоперидол - один из наиболее активных нейролептиков, обладает седативным действием в основном за счет блокады ДА-рецепторов. Психотропный эффект галоперидола также связан со способностью блокировать центральные сс-адренорецепторы и с нарушением процесса обратного захвата и депонирования норадреналина [Sibley et al., 1993; Машковский, 1997]. Наибольшей аффинностью галоперидол обладает по отношению к Д2-типу ДА-рецепторов, несколько меньшей к Д4 и ещё более низкой к Д1 и ДЗ ДА-рецепторам [Florijn et al, 1997; Brand et al, 1996]. Острое введение препарата достоверно снижает уровень связывания с Д2-типом рецепторов в стриатуме крыс [Sakata et al, 1992]. При блокаде ДА-рецепторов галоперидолом нарушается выработка условных рефлексов у крыс. Помимо влияния на обучение животных отмечено также угнетающее действие галоперидола на двигательную активность.
В проведенных нами экспериментах введение галоперидола в дозе 200 мкг/кг приводило к снижению двигательной и исследовательской активности животных. Нами также показано угнетающее действие галоперидола на обучение крыс. Предварительное введение семакса в дозе 50 мкг/кг нормализует формирование условного рефлекса, нарушенного инъекцией галоперидола. При этом семакс в дозах 50-600 мкг/кг практически не влияет на снижение двигательной активности и ориентировочно-исследовательской реакции, вызванные введением галоперидола. На основании полученных результатов можно заключить, что введение семакса нормализует формирование условного рефлекса, нарушенного блокадой ДА-рецепторов, но не компенсирует угнетающего действия блокатора на двигательную активность животных.
Можно предположить, что в основе нормализующих эффектов семакса в случае нарушения ДА системы мозга галоперидолом или МФТП лежат различные механизмы. Эффекты семакса на фоне МФТП-вызванных нарушений, вероятно, связаны с его нейропротекторной и нейротрофической активностью [Shadrina et al., 2001; Долотов и др., 2003; Dolotov et al., 2006а, б], обуславливающей ослабление повреждения и восстановление функции обратимо поврежденных дофаминсинтезирующих нейронов. В основе нормализующего действия семакса на выработку условного рефлекса, нарушенного введением галоперидола, может лежать компенсаторное влияние других нейромедиаторных (в частности, норадренергической) систем.
Отставленные эффекты хронического внутрибрюшинного введения семакса в течение первой недели постнатального развития крыс
В следующей серии экспериментов для выяснения механизмов анальгетического действия семакса изучалось влияние пептида на болевую чувствительность животных на фоне блокады серотониновых и опиоидных рецепторов.
Для блокады серотониновых рецепторов использовали ципрогептадин в дозе 1 мг/кг. Болевую чувствительность животных оценивали в тесте "сдавливание задней лапы". Введение семакса в дозе 500 мкг/кг вызывало достоверное повышение болевого порога относительно контрольной группы с 30 по 60 мин (Fi.22=4.66; р 0.04) (рис. 79). Ципрогептадин не влиял на болевую чувствительность животных на протяжении всего времени эксперимента (Fi.20=0.001; р 0.96). В группе животных, которым вводили ципрогептадин за 10 мин до инъекции семакса, не было зарегистрировано достоверного изменения болевой чувствительности относительно контроля (Fi.23=1 -33; р 0.26). Кроме того, отмечалась тенденция к снижению болевого порога в группе животных с совместным введением препаратов относительно группы, получавшей только инъекцию пептида с 45 по 60 мин после введения пептида (Fi,23=3.87; рО.06). Следовательно, предварительное введение ципрогептадина препятствует развитию анальгетического действия семакса.
Для блокады опиоидных рецепторов использовали налоксон в дозах 1 или 5 мкг. Исследование влияния налоксона на болевую чувствительность крыс показало, что введение блокатора в дозе 1 мг/кг (рис. 80) не вызывает изменения болевого порога животных относительно контрольных значений (Fi.38=0.04; р 0.84). Введение семакса (500 мкг/кг) приводило к значимому повышению болевого порога в течение всего времени регистрации (Fj.39=4.16; р 0.05). Влияние семакса, ципрогептадина и их совместного введения на болевую чувствительность крыс в тесте "сдавливание задней лапы". По оси абсцисс - время после введения пептида; по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту. В каждой группе по 13-15 крыс. Достоверные отличия от контроля отмечены (р 0.05).
Влияние семакса, налоксона (1 мг/кг) и их совместного введения на болевую чувствительность крыс в тесте "сдавливание задней лапы". По оси абсцисс -время после введения пептида; по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту. В каждой группе по 20 крыс. Достоверные отличия от контроля отмечены (р 0.05), отличия группы с введением семакса от группы с совместным введением препаратов - отмечалось достоверное снижение болевой чувствительности по сравнению с контролем с 30 по 75 мин (Fi.36=5.07; р 0.03). При этом через 15 мин после введения пептида величина болевого порога в этой группе животных была достоверно ниже, чем в группе крыс, получавших только семакс (р 0.05). Следовательно, предварительное введение налоксона в дозе 1 мг/кг незначительно ослабляет развитие анальгетического эффекта семакса.
Введение налоксона в дозе 5 мг/кг также не влияло на болевую чувствительность животных (Fi.37=0.35; р 0.56) (рис. 81). Введение семакса в дозе 500 мкг/кг приводило к повышению порога болевой чувствительности относительно контроля через 15-120 мин после инъекции (Fi,37=8.31; р 0.007). В группе с совместным введением препаратов увеличение порога болевой чувствительности относительно контроля наблюдалось только с 45 по 120 мин (Fi.36=4.33; р 0.04). В этой группе крыс с 15 по 45 мин болевая чувствительность была выше, чем в группе животных, получавших инъекцию пептида (Fi.37=4.98; р 0.03). Следовательно, предварительное введение налоксона в дозе 5 мг/кг, также как и в дозе 1 мг/кг, ослабляет анальгетическое действие семакса, при этом эффект блокатора более выражен.
Влияние семакса, налоксона (5 мг/кг) и их совместного введения на болевую чувствительность крыс в тесте "сдавливание задней лапы". По оси абсцисс -время после введения пептида; по оси ординат - величина болевого порога в процентах к максимально возможному эффекту. В каждой группе по 20 крыс. Достоверные отличия от контроля отмечены (р 0.05), (рО.01). Достоверные отличия группы с введением семакса от группы с совместным введением препаратов
Исследование влияния семакса на болевую чувствительность животных в различных экспериментальных моделях показало, что в/б введение пептида приводит к повышению болевого порога в тестах "сдавливания задней лапы", "горячая пластина" и тесте "корчей, вызванных введением уксусной кислоты". В тесте "отдергивание хвоста" изменения болевой чувствительности крыс под действием препарата в исследованных дозах зарегистрировано не было.
Реакция на болевой раздражитель, регистрируемая в тесте "отдергивание хвоста", осуществляется за счет двигательного рефлекса, который замыкается на уровне спинного мозга. Однако по данным некоторых авторов рефлекторное отдергивание хвоста может включать не только активацию структур спинного мозга, но и более высоких отделов. Так, было показано, что у спинальных животных (через 48 ч после операции) сильная интенсивность раздражающего стимула, приводящая к отдергиванию хвоста у интактных животных за 2 с, вызывала рефлекторную реакцию спинальных животных за тот же промежуток времени. Слабая интенсивность раздражающего стимула, приводящая к отдергиванию хвоста у интактных животных через 4-5 с, не вызывала рефлекторного отдергивания хвоста у оперированных животных за 10 с (максимальное время предъявления раздражителя) [King et al, 1997]. В описанном эксперименте в тесте "отдергивания хвоста" раздражение наносили сфокусированным световым пучком с нарастающей интенсивностью. В наших экспериментах хвост погружали в воду с фиксированной температурой 56С. Мы сразу предъявляли животному сильный раздражающий стимул, и, таким образом, попадали в область раздражителей большой интенсивности, при действии которых рефлекторный ответ опосредуется структурами спинного мозга. Поэтому, отсутствие влияния семакса на болевую чувствительность в этом тесте свидетельствует о том, что пептид не блокирует проведение болевого стимула на спинальном уровне.
В тесте "горячая пластина" реакцией на болевой раздражитель является облизывание задней лапы - поведенческая реакция. Регуляция такого поведения осуществляется на уровне головного мозга. В тесте "сдавливания задней лапы" происходит монотонное возрастание нагрузки на конечность, в этом случае избавление от болевого раздражителя может происходить не только за счет сгибательного рефлекса, а представлять собой сложную поведенческую реакцию (особенно при повторном предъявлении болевого раздражителя) [Bars et al, 2001]. Таким образом, как в тесте "горячая пластина", так и в тесте "сдавливания задней лапы" регистрируемые нами ответы на болевой раздражитель являются поведенческими реакциями, регуляция которыми осуществляется головным мозгом.
В тесте "корчи" в ответ на введение химического раздражителя (уксусной кислоты) наблюдаются рефлекторные сокращения брюшной стенки, регуляция которыми, согласно литературным данным, опосредуются через структуры ствола головного мозга [Zimmer et al, 1998]. Хотя этот тест называют моделью висцеральной боли, полностью висцеральной, видимо, ее нельзя считать. По своей природе эта боль близка к той, которая возникает при перитоните. Этот тест довольно чувствителен. В нем можно отметить эффекты не только сильных и слабых анальгетиков, но и ряда других соединений, не обладающих анальгетическим действием, таких как адренергические блокаторы, антигистаминные препараты, мышечные релаксанты, ингибиторы моноаминоксидаз и нейролептики [Bars et al, 2001]. Поэтому положительный результат в этом тесте не всегда означает наличие анальгетической активности у исследуемого соединения, но в совокупности с другими тестами, подтверждает ее.
Таким образом, результаты, полученные нами в различных экспериментальных моделях, свидетельствуют о том, что воздействие семакса на болевую чувствительность животных осуществляется при участии супраспинальных механизмов ноцицепции. Анализ полученных результатов и сопоставление их с данными литературы [Li et al, 1990; Walker et al, 1980; Walker, 1981] позволяют предположить, что анальгетические эффекты семакса, также как и анальгетические эффекты АКТГ, МСГ, их фрагментов и аналога ORG 2766, связаны с центральными механизмами регуляции болевой чувствительности.
При исследовании анальгетических эффектов семакса нами использовались болевые раздражители различной природы - термическое (тест "горячая пластина" и тест "отдергивание хвоста"), механическое (тест "сдавливания задней лапы") и химическое (тест "корчи") раздражение. Увеличение болевого порога под действием пептида в тестах "горячая пластина", "сдавливания задней лапы" и "корчи" свидетельствует о том, что анальгетические эффекты семакса не зависят от природы болевого раздражителя.
