Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1.1. Болезнь Альцгеймера 9
1.1.1. Формы болезни Альцгеймера 10
1.1.2. Роль бета-амилоида и белка тау в цитотоксическом влиянии на нейроны 11
1.1.3. Гипотеза митохондриального каскада 12
1.2. Факторы риска развития болезни Альцгеймера 14
1.2.1. Патология сердечно-сосудистой системы 14
1.2.2. Повышенный уровень холестерина как фактор риска развития БА 14
1.2.3. Сахарный диабет и болезнь Альцгеймера 14
1.2.4. Роль тяжёлых металлов и алюминия в патогенезе БА 15
1.3. Роль обонятельной системы в генезе болезни Альцгеймера 16
1.3.1. Строение обонятельного анализатора 17
1.3.2. Операция удаления обонятельных луковиц и ее последствия на поведенческом, биохимическом и морфологическом уровнях 20
1.4. Аберрантный цикл и нейрогенез при болезни Альцгеймера 23
1.4.1. Нейрогенез во взрослом мозге 23
1.4.2. Факторы, влияющие на интенсивность неирогенеза и выживаемость неиральных прогениторов 24
1.4.3. Нейрогенез в мозге при БА 27
1.5. Клеточная терапия и перспективы ее применения при болезни Альцгеймера 29
1.5.1. Влияние возраста реципиента на выживаемость донорских стволовых клеток 29
1.5.2. Клеточная терапия нейродегенеративных заболеваний 36
Материалы и методы исследования 32
Результаты 48
Обсуждение результатов 82
Заключение 90
Выводы 93
Список литературы
- Роль бета-амилоида и белка тау в цитотоксическом влиянии на нейроны
- Патология сердечно-сосудистой системы
- Строение обонятельного анализатора
- Клеточная терапия и перспективы ее применения при болезни Альцгеймера
Роль бета-амилоида и белка тау в цитотоксическом влиянии на нейроны
До недавнего времени цитотоксичность Р-амилоида, приводящая к дегенерации синапсов и дендритов, и опосредованное гиперфосфорилированием тау нарушение структуры синапсов рассматривались как два независимых события, действующих в основном в зонах дендритов и аксонов, соответственно. Токсические эффекты Р-амилоида в настоящее время считаются опосредованными рецепторами на постсинаптической мембране; основными кандидатами на роль этих рецепторов являются а-7 ацетилхолиновый рецептор, прионовые белки и ионотропные рецепторы глутамата (в основном NMDA рецептор). В частности, сенситизация NMDA рецептора Р-амилоидом и последующая эксайтотоксичность считается центральным механизмом ММОАрецептор-опосредуемой токсичности (3-амилоида [Snyder et al., 2005]. Глутамат, главный возбуждающий нейромедиатор в головном мозге млекопитающих, взаимодействует с множеством постсинаптических рецепторных субъединиц. NMDA-рецепторы являются уникальными среди глутаматных рецепторов по своей зависимости и высокой проницаемости для ионов кальция. Известно, что NMDA-рецепторы играют важную роль в процессах обучения и памяти. Роль Р-амилоида связана с длительной гиперактивацией NMDA-рецепторов с последующим увеличенным входом Са2+ в клетку и развитием свободнорадикального окисления нейрональных мембран [Anderson et al., 1995; Wilkinson, 2001; Яхно, 2002]. Однако известно, что Р-амилоид через активацию тау-протеинкиназы 1 вызывает гиперфосфолирирование тау-белка с последующим образованием нейрофибриллярных клубков (НФК) [Busciglio et al., 1995]. Появление НФК свидетельствует о разрушении микротрубочек и нейрофиламентов, что ведет к гибели клеток. Однако НФК присутствуют не только в мозге больных Б А, но и при других нейродегенеративных патологиях, поэтому их образование не является специфическим признаком БА [Степаничев и др., 2002; Яхно, 2002]. Кроме классической функции тау как стабилизатора микротрубочек, была также продемонстрирована его роль как белка, связующего различные мембранные белки с цитоскелетом, в частности тирозинкиназу FYN (нерецепторная тирозинкиназа src-семейства, участвующая в регуляции клеточного роста) [Lee et al., 1998]. FYN регулирует активность NMDA рецепторов и гиперфосфорилирование тау, которое в свою очередь приводит к сенсибилизации NMDA рецепторов, увеличивая их чувствительность к Р-амилоиду [Inner et al., 2010]. Гиперфосфориляция тау также приводит к нарушению аксонального транспорта, в том числе транспорта митохондрий, который наряду с дисфункцией митохондрий положен в основу гипотезы митохондриального каскада при спорадической форме БА [Rhein et al., 2009; Stamer et al., 2002].
Гипотеза митохондриального каскада проводит чёткую границу между спорадической и наследственной формами БА. Центральным событием в данной гипотезе считается повреждение митохондриального генома и мутации в ядерных генах, кодирующих митохондриальные белки, что приводит к снижению функции митохондрий, генерации активных форм кислорода и выходом цитохрома с последующей активацией апоптоза [Swerdlow and Khan, 2004]. В пользу данной гипотезы говорят исследования, выявившие ухудшение функции митохондрий больных БА в гибридной п системе, а также связывающие мутации в митохондриальных генах с риском развития БА [Swerdlow et al., 2007]. Также существуют данные о том, что риск развития БА выше у индивидуумов, матери которых болели БА, что согласуется с наследованием митохондрий по материнской линии [Mosconi et al., 2007].
Среди ферментов электронтранспортной цепи митохондрий, которые демонстрируют полиморфизм при БА - белки пируватдегидрогеназного комплекса, кетоглутаратдегидрогеназного комплекса и цитохромоксидаза (СО). Ген СО также накапливает мутации со старением, что приводит к снижению ее активности. Таким образом, рассмотрение спорадической БА с точки зрения дисфункции митохондрий позволяет объяснить явную корреляцию ее развития с возрастом [Corral-Debrinksi et al, 1994].
Гипотеза митохондриального каскада, однако, не исключает роль (3-амилоида в спорадической форме БА, но предлагает иную иерархию событий, в которой митохондриальная дисфункция приводит к накоплению Р-амилоида, который, в свою очередь, нарушает функционирование митохондриальной электронтранспортной цепи. В пользу такого хода событий говорят исследования цибрид с митохондриями нейронов больных БА, которые в культуре клеток выделяли во внеклеточную среду Р-амилоид [Khan et al., 2000]. Активные формы кислорода регулируют активность у-секретазы (комплекса, осуществляющего протеолитическое выщепление Р-амилоида), и активируют экспрессию ВАСЕ1-протеазы, катализирующей лимитирующую стадию протеолиза АРР с образованием Р-амилоида. В случае наследственной формы заболевания Р-амилоид, как предполагается, является инициатором митохондриальной дисфункции, как в классической теории амилоидного каскада [Swerdlow and Khan 2009].
Гипотеза митохондриального каскада также рассматривает гиперфосфорилирование тау как событие, являющееся результатом митохондриальной дисфункции. Фермент киназа гликогенсинтазы Зр (GSK3P) координирует стабильность цитоскелета и запасание глюкозы, регулируя, таким образом, деление и рост клетки. Было показано, что GSK3P напрямую фосфорилирует тау и предрасполагает клетку к делению в условиях стимуляции трофическими факторами и низкого энергетического уровня. В этих условиях GSK3P активируется и вызывает выход из G0 фазы клеточного цикла [Hooper et al, 2008]. Активация клеточного цикла с последующей апоптической гибелью нейрона - событие, часто происходящее в мозге БА.
Рассмотрение БА с точки зрения митохондриальной дисфункции также объясняет неудачи применения терапии, направленной на уменьшения уровня Р-амилоида, к больным спорадической БА. Гипотеза предполагает, что накопление Р-амилоида является следствием нарушения функции митохондрий и может представлять собой регуляторный механизм, вышедший из-под контроля. На это указывают неоднозначные данные по сложной сигнальной функции Р-амилоида как регулятора апоптоза, клеточной смерти, деления клеток и образования синапсов. Таким образом, рассмотрение Р-амилоида исключительно как клеточного токсина и попытка убрать его из системы может привести к еще большему ее нарушению или, по крайне мере, не решит проблему митохондриальной дисфункции и факторов, ее вызывающих.
Патология сердечно-сосудистой системы
Эксперименты по трансплантации стволовых клеток в мозг животных различного возраста показали, что среда мозга старых животных менее дружелюбна по отношению к созревающим стволовым клеткам. Так, свежевыделенные зародышевые стволовые клетки гиппокампа, введённые в желудочки крыс трех возрастных групп (молодые, среднего возраста и старые), приживаются одинаково, однако спустя 30 дней после инъекции выживает примерно 20% клеток. Однако, в случае, когда гиппокамп животных был предварительно повреждён каиновой кислотой, 70% клеток приживаются в мозге молодых животных, тогда как у животных среднего возраста и старых животных это число равно 30% [Suh et al., 2009]. Предположительно, повреждение гиппокампа каиновой кислотой у молодых животных вызывает экспрессию ростовых факторов, тогда как такая реакция снижена у старых животных и животных среднего возраста. Предварительная инкубация стволовых клеток с BDNF, NT-3 и ингибиторами каспазы увеличивала выживание клеток до 51% у крыс среднего возраста и до 63% у старых крыс. Такая зависимость выживания клеток от ростовых факторов согласуется с резким падением уровня некоторых из них при возрастном переходе от молодого к среднему возрасту; однако другие исследования говорят о постепенном снижении выживаемости трансплантируемых стволовых клеток при старении [Zaman and Shetty, 2002]. В последнее время успешно разработана техника внутримозговой трансплантации ЭНТ. Пересадку делают стереотаксически, руководствуясь атласами мозга человека и животных [Ваколюк Н. П., 1979; Paxinos G. et al., 1982]. Для трансплантации используют кусочки фетального мозга [Bjorklund A. et al., 1980], суспензии диссоциированных клеток [Schmidt R.H. et al., 1981], культивированные клетки мозга и глионейронные агрегаты [Victorov I. V. et al., 1990; Yanai J. et al., 1995 a, b], криоконсервированную ткань эмбрионального мозга [Jensen S. et al., 1984]. Ткань мозга зародыша трансплантируют внутрь паренхимы различных структур и отделов мозга (интрапаренхимально) [Cenci М. A. et al., 1990, 1997], в искусственно сделанную полость в мозге (интракавитально) [Клещинов В. Н. и др., 1990; Gonzalez М. F. et al., 1987], в спинной мозг (интрамедуллярно) [Demierre В. et al., 1990], в периферический нерв [Sievers J. et al., 1989], в полости желудочков мозга (интравентрикулярно) [Rosenstein J. М. et al., 1978], на поверхность коры мозга [Chang F.-L. F. et al., 1986], в цереброспинальную жидкость, на поверхность мягкой мозговой оболочки (субарахноидально) [Brightman М. W., 1983], эндолюмбально [Миронов Н. В. и др., 1996].
Большой массив данных по исследованию возможностей клеточной терапии на животных моделях нейродегенеративных заболеваний говорит о том, что трансплантация стволовых клеток различного типа, а также соматических клеток, которые с помощью генетической инженерии запрограммированы на выделение определённых факторов, например, ростовых факторов, может приводить к функциональному восстановлению повреждённых систем и к улучшению нарушенных когнитивных функций [Hwang et al., 2009]. Однако из-за противоречивости результатов таких исследований, недостаточного понимания некоторых базовых процессов биологии стволовых клеток и их роли в репарации систем при патологии во взрослом возрасте, а также наличия других нерешенных проблем, на сегодняшний день большинство способов лечения на основе применения клеточных технологий находится на стадии клинического тестирования, а применение клеточной терапии для лечения БА находится на стадии ее исследования на животных [Lindvall and Kokaia, 2010].
Трансплантация стволовых клеток способна положительно влиять на процесс нейродегенерации за счёт ряда механизмов. Однако, несмотря на значительный прогресс в данном направлении, центральной проблемой остаётся возможность трансформации трансплантированных клеток в раковые опухоли. Этого перерождения можно избежать путём использования для пересадки не плюрипотентных стволовых клеток, а частично дифференцированных предшественников - нейробластов, которые имеют возможность образовывать только определённый тип клеток и характеризуются очень низкой пролиферативной способностью [Lindvall and Kokaia, 2010].
Существует несколько источников стволовых клеток как материала для трансплантации. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) выделяют из бластоцисты и выращивают в культуре клеток; эти клетки могут поддерживаться в пролиферирующем состоянии в течение нескольких лет и способны дифференцироваться в любые клетки организма. С помощью манипуляций ростовыми факторами в сочетании с сортировкой клеток проточной цитометрией из культуры ЭСК можно получать довольно чистые нейрональные стволовые клетки или, например, клетки-предшественники олигодендроцитов или дофаминэргических нейронов [Kawasaki et al., 2002]. Однако, большинство исследований по трансплантации нейробластов, созданных в культуре ЭСК, свидетельствует о развитии у животных рака. По-видимому, это происходит по двум причинам: во-первых, долгая пролиферация клеток в клеточной культуре приводит к нестабильностям генома, и, во-вторых, из-за несовершенства методов сортировки в трансплант могут попадать недифференцированные клетки, которые могут давать начало опухолям. Наконец, причиной перерождения может быть использование чистых культур с отсутствием межклеточного матрикса, обеспечивающего «кросс-ток» клеток, характерного для микрообъема любой нормальной ткани. Нейрональные стволовые клетки, полученные из взрослого или зародышевого мозга, пролиферируют в культуре клеток в присутствии таких ростовых факторов, как FGF-2 и EGF. Нейрональные стволовые клетки, выделенные из зародышевого мозга - единственный тип стволовых клеток мозга, применённых в клинических испытаниях на людях [Schwarz and Schwarz, 2010)] Эти клетки применялись для трансплантации в черную субстанцию пациентов с болезнью Паркинсона, а также для лечения инсульта, болезни Баттона и болезни Пелицеуса - Мерцбахера [Tamaki et al., 2009]. В этих клинических испытаниях НСК продемонстрировали функциональную интеграцию, долговременное выживание и явный положительный эффект на течение заболевания.
Мезенхимальные стволовые клетки красного костного мозга применяются для лечения гематологических заболеваний в течение многих лет. Важным преимуществом МСК является возможность относительно простого их выделения из собственного красного костного мозга пациента и использование для автологической трансплантации. Существуют также данные о том, что эти клетки могут дифференцироваться в нейроны [Yu Q et al., 2013]. МСК могут также положительно влиять на нейродегенеративный процесс за счёт трофической поддержки. Недавнее клиническое исследование с пересадкой МСК в стриатум больных БП показало, что эти клетки могут улучшать состояние больных [Venkataramana et al., 2010].
Относительно новое и популярное направление в биологии стволовых клеток - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPS cells). Их открытие было сделано, когда обнаружилось, что путем переноса с помощью ретровирусных векторов в фибробласты 4 транскрипционных факторов (с-тус, oct4, klf2, and sox2) можно перепрограммировать их в клетки стволовой природы, способные пролиферировать и дифференцироваться в широкий спектр типов клеток [Takahashi et al., 2006].
Строение обонятельного анализатора
Сопоставление динамики клеточной пролиферативной активности в различных зонах у ОБЭ животных показало (Рис.11), что для структур, в которых пролиферативная активность является обычным явлением, отмечается ее максимум через три недели после операции бульбэктомии с последующим спадом пролиферации. Для височной коры, для которой в норме не характерна пролиферативная активность, отмечается максимум появления иммуннопозитивных BrdU ядер с запозданием - лишь через 4 недели после операции бульбэктомии, затем, к 8-ой неделе наблюдается снижение пролиферативной активности в этой структуре. Важно отметить, не только временные различия в активации пролиферативной активности под действием бульбэктомии в изучаемых структурах, но и в интенсивности этого процесса. Наиболее выражено активация пролиферации после бульбэктомии проявилась в субвентрикулярной зоне, менее интенсивно она проходила в височной коре.
Полученные в этом разделе результаты показали, что под влиянием бульбэктомии развивается не только процесс нейродегенерации, но параллельно инициируется и пролиферативная активность, являющаяся первой стадией нейрогенеза, что, по-видимому, направлено на компенсацию утраченных функций в результате массированной гибели нейронов в структурах, связанных с обонятельной луковицей. Можно предположить, что биологически активные соединения, выделяемые в межклеточное пространство дегенерирующими нейронами и глией могут служить инициаторами активации дремлющих прогениторных клеток. Для проверки этого предположения представляло интерес исследовать эффекты трансплантации фетальной ткани разных мозговых структур, отличающихся потенциалом пролиферативной активности, на поведенческие и морфологические проявления нейродегенеративного процесса, вызванного операцией бульбэктомии.
Влияние трансплантации фетальних клеток обонятельной луковицы на уровень пространственной памяти бульбэктомированных мышей.
Через 6 месяцев после ольфакторной бульбэктомии (ОБЭ) была проведена операция трансплантации фетальной ткани обонятельной луковицы. Через 2 месяца после операции трансплантации животных обучали навигационному рефлексу в водном лабиринте Морриса. В течение 6 дней (по 4 сеанса ежедневно) мышей обучали находить в одном из отсеков бассейна погруженную под воду платформу. По окончании обучения тестирование пространственной памяти у животных проводили в течение 1 минуты при отсутствии спасательной платформы. Анализировали время, проведённое животными в отсеках водного лабиринта, а также число заходов в них. Результаты поведенческих экспериментов представлены в таблице 4. Таблица 4. Результаты Post-hoc анализов данных тестирования пространственной памяти у ЛО, ЛО+Т, БЭ, БЭ+ТМ и БЭ+Тмышей. Достоверность отличия показателей в отсеке обучения к соответствующим показателям в индифферентных отсеках: -р 0,05; -р 0,01; . р 0,001
LSD следует, что группа БЭ животных не способна выделять сектор, в котором при обучении находилась спасательная платформа, в то время как группа ЛО животных посещала отсек обучения достоверно чаще, чем другие отсеки и достоверно больше времени проводила в нем во время сеанса тестирования памяти. Трансплантация фетальных клеток обонятельной луковицы в паренхиму фронтальной коры БЭ животным приводила к восстановлению у них способности идентифицировать отсек обучения, что свидетельствует об улучшении пространственной памяти. БЭ животные, подвергшиеся трансплантации ткани мозжечка, так же как и группа контрольная группа БЭ животных были не способны отличать отсек обучения от индифферентных отсеков (рис.12 и 13) [Самохин и др., 2005]. ло
Число заходов (%) в сектора лабиринта Морриса. Трансплантация фетальных клеток обонятельной луковицы, но не мозжечка в паренхиму коры вызывает улучшение пространственной памяти, тестируемой через 2 месяца после их введения. У булъбэктомированных мышей. БЭ - булъбэктомированные животные, ЛО - ложнооперированные животные; ЛО+Т и БЭ+Т - трансплантация фетальных клеток обонятельной луковицы во фронтальную кору; БЭ+ТМ мыши с трансплантацией фетальных клеток мозжечка во фронтальную кору. Достоверность отличия показателей индифферентных отсеках от отсека обучения - р 0,05; - р
Время пребывания в отсеках водного лабиринта. Трансплантация фетальных клеток обонятельной луковицы, но не мозжечка в паренхиму коры вызывает улучшение пространственной памяти булъбэктомированных мышей через 2 месяца после их введения. Обозначения как нарисуеке 12. Влияние трансплантации фетальних клеток обонятельной луковицы на морфо-функциональное состояние нейронов височной коры и гиппокампа бульбэктомированных мышей.
Анализ состояния нейронов проводился в полях гиппокампа и височной коре - структурах, наиболее поражаемых у БЭ животных и при БА и играющих основную роль в процессах обучения и памяти.
На рисунках 14, 15 и 16 представлены микрофотографии срезов височной коры и гиппокампа (поля СА1-СА2, САЗ-СА4) мышей всех экспериментальных групп: Л О, БЭ, Л О и БЭ с трансплантацией в паренхиму фронтальной коры фетальной ткани обонятельной луковицы (ЛО+ТОЛ) и (БЭ+ТОЛ) соответственно; БЭ с трансплантацией ткани мозжечка (БЭ+ТМ) в кору. Видно, что во всех исследованных структурах ЛО животных подавляющее большинство нейронов характеризуется средней интенсивностью окраски цитоплазмы, равномерно распределенным тигроидом, а также центрально расположенным ядром с чётко различимым ядрышком, что соответствует морфологии здорового нейрона. У БЭ животных наблюдаются многочисленные патологические изменения в нейронах по типу пикноза, цитолиза, кариолизиса или вакуолизации. В пикноморфных нейронах ярко выражен хроматолиз, утолщение и фрагментация отростков и укрупнение глыбок тигроида. На последней стадии пикноза клетки имеют неровную угловатую форму, вид шелухи или палочки. Нейроны с кариолизисом характеризуются смещением ядра к внешней мембране клетки, часто наблюдается полный или частичный лизис ядра. Нейроны с развившимся цитолизом имеют эктопично расположенное ядро и лизированный тигроид, контуры клеток исчезают. Вакуолизированные нейроны имеют выраженные лакуны в цитоплазме клетки и увеличенное ядро. Вышеописанные изменения в нейронах сопровождаются деструкцией цитоархитектоники височной коры, что выражается в стирании границ между клеточными слоями и появлением клеточных пустот (Рис.14, 15, 16).
Клеточная терапия и перспективы ее применения при болезни Альцгеймера
Для анализа иммуногистохимической окраски использовали конфокальный инвертированный микроскоп (DMI 6000 CS, Leika). При микроскопическом исследовании была отчётливо видна изумрудная флуоресценция в области выстилки желудочков головного мозга (Рис.26 и 27). При большом увеличении, отдельные HNA-позитивные клетки были видны в парен мозга около выстилки боковых желудочков (Рис.28), где отчётливо видны окрашенные флуорофором ядра [Самохин и др., 2013; Панченко и др., 2013].
Полученные результаты свидетельствуют о способности чММСК преодолевать гематоэнцефалический барьер у ОБЭ мышей и попадать в паренхиму мозга. Эти данные нашли подтверждение и в другой экспериментальной серии с внутривенной трансплантацией GFP положительных мышиных ММСК ОБЭ животным. Через 3 дня после введения в хвостовую вену эти клетки были обнаружены в паренхиме мозга ОБЭ мышей (Рис.29). Доказательством, что зеленая флуоресценция на срезах мозга соответствует клеточным структурам, служит наличие ядер, окрашенных в синий цвет красителем Хекста (Рис.29Б) Рис.26. Срез мозга ложнооперированной мыши. При иммуногистохимической исследовании с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена HNA видно отчётливое изумрудное свечение в стенках 3-го желудочка. Масштаб 200 мкм.
Микрофотографии паренхимы мозга ОБЭ мышей с в/в трансплантацией ММСК. Определяются клетки, иммуннопозитивные к HNA (стрелки). Иммуногистохимическое окрашивание с применением первичных антител на человеческий ядерный антиген (HNA) и вторичных антител, конъюгированных с флуорохромом (Alexa-488 [зелёная флуоресценция]). Масштаб - 38 мкм. Конфокальная микроскопия. Рис.29. Микрофотографии срезов височной коры ОБЭ мышей через три дня после системной трансплантации GFP (зеленая флуоресценция) положительных ММСК мышей. Ядерный хроматин окрашен в синий цвет красителем Хёкста. Масштаб: А - 550 мкм; Б - 70 мкм; С -12 мкм. Конфокальная микроскопия.
Небольшая часть введенных чММСК под влиянием клеточного окружения дифференцируется в астроцити.
Следующей задачей, которая стояла перед нами, было определить дифференцируются ли ММСК человека, проникшие в мозг реципиента, в нейроны и/или астроциты. При двойной иммуногистохимической окраске срезов мозга ОБЭ мышей с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена (зеленая окраска) и первичных антител против NSE (Нейрон специфичная энолаза) (красная флуоресценция), не было обнаружено коллокализации окрасок, что свидетельствует о том, что введённые чММСК не способны дифференцироваться в нейроны (Рис.30).
При двойной иммуногистохимической окраске с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена (зеленая окраска) и первичных антител против GFAP (маркер астроцитов)(красная окраска), было установлено, что лишь небольшая часть введенных чММСК под влиянием клеточного окружения дифференцируется в астроциты, поскольку наблюдали отдельные случаи коллокализации окраски или изменение ее цвета в одной и той же клетке (Рис.31 и 32) [Самохин и др., 2013; Панченко и др., 2013]. Рис.30. Введенные системно чММСК не дифференцируются в нейроны в мозге ОБЭ мышей. Отсутствие коллокализации иммунопозитивности к нейрон-специфической энолазе NSE (красное окрашивание) и белку человеческого ядра HNA (зеленое окрашивание) в неокортексе ОБЭ мышей. Масштаб 30 мкм. Конфокальная микроскопия.
Коллокализация иммунопозитивности к HNA и GFAP в астроцитах (красная окраска) на срезах мозга ОБЭ мышей с системной трансплантацией ММСК. Двойная иммуногистохимическая окраска с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена и первичных антител против GFAP. Масштаб: 34 мкм. Конфокальная микроскопия.
Эксперименты с применением системной и внутримозговой трансплантации ММСК человека показали ее эффективность для предотвращения потери памяти у ОБЭ мышей и сдерживания ухудшения морфологического состояния нейронов коры и гиппокампа - структур, ответственных за процессы обучения и памяти. Хотя внутримозговая трансплантация чММСК оказалась более действенной и эффект от ее применения наблюдался уже через месяц после этой манипуляции, но для практического использования, безусловно, более предпочтительным является внутривенное системное введение. Рис.32. Коллокализация иммунопозитивности к HNA и GFAP в астроцитах (красная окраска) Примеры астроцита, ядро которого содержат белок человека (зелёная окраска) на срезах мозга ОБЭ мышей с системной трансплантацией чММСК. Двойная иммуногистохимическая окраска с использованием первичных антител против человеческого ядерного антигена и первичных антител против GFAP. Конфокальная микроскопия.
Дальнейшие исследования судьбы системно введенных чММСК показали, что они способны преодолевать гематоэнцефалический барьер, в основном локализуясь в стенках боковых желудочков мозга и в меньшей степени в мозговой паренхиме. Интересно отметить, что проникшие в мозг клетки могли дифференцироваться только в астроциты, но не в нейроны. Мы не исследовали возможность дифференцировки этих клеток в не нейрональные клетки, например, в фибробласты, которые, вряд ли могли участвовать в торможении нейродегенеративного процесса в мозге ОБЭ мышей. Учитывая немногочисленность проникших в мозг чММСК, трудно предположить, что именно эти клетки непосредственно были ответственны за улучшение памяти у ОБЭ мышей. Один из возможных механизмов, ответственный за улучшение памяти у ОБЭ мышей с трансплантированными чММСК, мог быть связан со стимуляцией собственного эндогенного нейрогенеза в мозге ОБЭ животных. Для проверки этого предположения была проанализирована плотность нейронов в гиппокампе ОБЭ мышей с в/в введением чММСК.
У бульбэктомироеанных мышей с введёнными чММСК наблюдается повышенная плотность нейронов по сравнению с контрольными БЭ животными.
При сравнении значений плотности (n/мм2) нейронов в зоне гиппокампа СА-1 было выявлено её повышение у БЭ мышей с системным введением чММСК по сравнению с плотностью нейронов у БЭ мышей с введением физиологического раствора, которая однако была ниже чем у ЛО мышей (Рис.33)[Самохин и др., 2013; Панченко и др., 2013].
