Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Методы молекулярной динамики при исследовании биообъектов ... 7
Физические основы метода молекулярной динамики 7
Температура и термостаты 11
Столкновительный термостат 13
Термостат Берендсена 13
Термостат Нозе-Гувера 14
Ланжевеновская динамика 15
Длина траектории и эргодичность 15
Численное интегрирование. Метод Верле 16
Обработка результатов. Статистики 17
Сравнительный анализ результатов 18
Использование данных квантово-химических расчётов 19
Приближения при решении волнового уравнения 19
Расчётные методы квантовой химии 21
Поиск стационарных точек поверхности потенциальной энергии 27
Глава 2. Отработка методов молекулярной динамики для исследования биологических объектов 32
Сравнительное изучение термостатов 32
Изучение влияния гидрофобности среды на динамику пептидов 35
Протокол молекулярной динамики 38
Двумерные сечения Пуанкаре 41
Дисперсионный анализ двумерных сечений Пуанкаре 44
Трёхмерные сечения Пуанкаре. Эффективный объём 46
Автокорреляционные функции 53
Изучение эффектов, связанных с образованием водородных связей 56
Ряд модифицированных тирозинов 57
Динамическое поведение олигопептидов. Ноотропный агент СЕМАКС 59
Заключение 61
Глава 3. Отработка методов управляемой молекулярной динамики 63
Функционирование ретиналь-содержащих белков: родопсина и бактериородопсина 63
Особенности функционирования бактериородопсина 64
Изомеризация ретиналя внутри зрительного родопсина 67
Определение барьеров внутреннего вращения 69
Определение параметров МД протокола для основного и возбуждённого состояния ретиналя методами квантовой химии 73
Нахожения параметров силового поля 73
Параметры силового поля для ретиналя в So состоянии 77
Параметры силового для ретиналя в возбуждённом состоянии 81
Динамика ретиналя в невозбуждённом состоянии 85
Динамика ретиналя в возбуждённом состоянии 87
Применение метода управляемой молекулярной динамики к изучению ионных каналов 90
Расчёт проводимости ионного канала 90
Заключение 94
Глава 4. Получение структуры канала глицинового рецептора в закрытом и открытом состояниях. Изучение миграции ионов методами управляемой молекулярной динамики 97
Функционирование глициновых рецепторов 97
Расположение глицинергических тормозных нейронов, волокон, содержащих глицин и глициновых рецепторов 99
Предсинаптические глицинергические окончания 101
Биосинтез и расщепление глицина 102
Механизм запасания и выброса глицина из предсинаптических терминалей 103
Определение параметров силового поля для систем с гидратированными ионами 106
Моделирование структуры канала глицинового рецептора 110
Закрытый канал 110
Открытый канал 124
Исследование миграции ионов сквозь канал рецептора в открытом состоянии 125
Динамика прохождения различных ионов 125
Исследование влияния диэлектрической проницаемости среды 127
Влияние парциальных зарядов на динамику гидратированных ионов.. 128
Сравнительное изучение ионной миграции при действии различных сил 129
Влияние изменения радиуса канала 130
Заключение 132
Выводы 133
Литература 135
- Использование данных квантово-химических расчётов
- Изучение влияния гидрофобности среды на динамику пептидов
- Определение параметров МД протокола для основного и возбуждённого состояния ретиналя методами квантовой химии
- Расположение глицинергических тормозных нейронов, волокон, содержащих глицин и глициновых рецепторов
Введение к работе
В последние годы при решении фундаментальных и прикладных задач молекулярной биоинженерии и биофизики активно используются методы молекулярного моделирования и молекулярного дизайна. При этом внимание уделяется всё более сложным и большим молекулярным системам, таким как белки-ферменты, мембранные белки, биомембраны и ионные каналы и др. Совершенно очевидно, что применение методов обычной равновесной молекулярной динамики к столь большим объектам встречает определенные затруднения, связанные с невозможностью за сколь либо реальное время изучить все возможные конформационные изменения в системе и получить таким образом статистически корректные результаты. Поэтому возрастает важность методов неравновесной молекулярной динамики, или управляемой молекулярной динамики (SMD), суть которых заключается в следующем. Над системой проводится серия численных экспериментов, в которых создаются специальные неравновесные условия (состояния) и изучается релаксация этих состояний. Рассматриваются серии релаксационных процессов с характерными временами до 10 не. В результате становится возможным определение кинетических и релаксационных параметров системы, которые несут информацию о функциональном акте и связанных с ним конформационных перестройках. Это направление является перспективным, в частности, для исследования связи структуры и функционирования крупных молекулярных объектов таких, как мембранные белки, ионные каналы и др. Что весьма актуально с биологической точки зрения, т.к. ионные каналы играют ключевую роль в поддержании гомеостаза, передаче сигнала в возбудимых клетках, создания и поддержания мембранного потенциала в прокариотических и эу-кариотических клетках. Механизм их функционирования, в части ионной проводимости, во многом определяется строением мембранной части рецепторов. Эти же методы могут быть применены также и к другим сложным случаям. Следует отметить, что, несмотря на полезность метода управляемой молекулярной динамики, он существенно менее развит по сравнению с методом равновесной молекулярной динамики. Поэтому актуальным также является и развитие основ этого метода в применении к различным классам объектов, и установление качественных протоколов моделирования.
Использование данных квантово-химических расчётов
Решения уравнения Шрёдингера позволяют найти выражение для волновой функции, то есть определить вид волновой функции относительно всех координат и энергии частицы. Если в системе всего лишь две частицы, для неё можно получить точное решение. Во всех других случаях используются различные приближения. Их можно разделить на две группы. Приближения первой группы упрощают выражение для гамильтониана (оператора энергии), они используются во многих методах. Второй тип приближений касается методов вычисления интегралов, он может отличаться для разных методов (Стромберг, Семченко, 1999). Среди приближений первой группы наиболее часто используют следующие: Пренебрежение неэлектростатическими взаимодействиями Гамильтониан системы представляется в виде сумы трёх операторов: оператора кинетической энергии и электростатического взаимодействия всех электронов и ядер; оператора взаимодействия системы с внешним электромагнитным полем; оператора неэлектростатических взаимодействий между частицами, возникающих из-за наличия спина. Последние два оператора не учитываются почти во всех квантово-химических методах. Приближение Борна-Оппенгеймера и адиабатическое приближение Гамильтониан системы сильно усложнён из-за присутствия в нём членов, отвечающих за кинетическую энергию ядер (Минкин и др., 1997). Масса ядра значительно больше массы электрона. Соответственно скорость движения ядер много меньше скорости движения электронов. Электроны быстро движутся в электростатическом поле, образуемом ядрами. Это позволяет пред ставить волновую функцию в виде произведения электронной и ядерной функций (34). При этом энергия системы представляется в виде суммы электронной энергии, вычисленной при фиксированной конфигурации ядер, и колебательно-вращательной энергии ядер. В отличие от приближения Борна-Оппенгеймера, адиабатическое приближение учитывает также так называемое вибронное взаимодействие ядер и электронов.
Для случая устойчивых многоатомных молекул критерий использования адиабатического приближения (35) где v - наибольшая из частот малых колебаний ядер вблизи точки равновесия, if„, Еэт - энергии двух соседних электронных состояний. Критерий (35) обычно выполняется для многих молекул, поэтому результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными. Одноэлектронное приближение Хартри-Фока (модель независимых электронов) Взаимодействие каждого электрона в системе с остальными заменяется взаимодействием электрона с усреднённым полем, создаваемым ядром и всеми остальными электронами. При этом движения электронов разделяются. Для каждого из них можно ввести волновую приближённую одноэлек-тронную функцию. Вариационный метод Согласно теореме о собственном значении (Минкин и др., 1997), если самое низкое собственное значение гамильтониана системы равно Ei, а точная волновая функция этого состояния - щ , то для любой нормированной функции у/справедливо соотношение (36). Состояние с минимальной энергией называется основным, а все остальные состояния с большей энергией - возбуждёнными. Пробная функция, которая даёт минимальное значение энергии, будет лучшей оценкой основного состояния. Вид пробной функции задаётся, при этом необходимо учитывать существенность различных вкладов.
Теория возмущений Суть метода состоит в том, чтобы найти волновую функцию и энергетические уравнения системы с гамильтонианом Н, зная решения для более простой системы с гамильтонианом Н(0). При этом явным образом записывается изменение решений уравнения Шрёдингера при малом изменении гамильтониана (Ландау, Лифшиц, 1963). Если известны точные решения уравнения (37), то требуется найти приближённые решения уравнения (38). Все расчётные методы основаны на приближённом решении уравнения Шрёдингера. При этом должны учитываться два требования: достаточное соответствие результатов расчёта результатам эксперимента; разумные затраты времени при выполнении их на современных ЭВМ. Для приближённого представления вида волновой функции для основного состояния системы электронов в молекуле существует два метода: 1) метод валентных связей (ВС). В этом методе предполагают, что при образовании молекулы из атомов, последние сохраняют свою электронную конфигурацию. Связывание атомов происходит за счёт спаривания спинов электронов, относящихся к разным атомам. Химическая "производная" этого метода - теория резонанса - раньше широко применялась. Согласно ей, молекула тем более устойчива, чем больше резонансных структур (Пиментел, Спратли, 1973); 2) метод молекулярных орбиталей (МО). В этом методе принимается, что электрон внутри молекулы находится на молекулярных орбиталях. То есть молекула рассматривается с той же точки зрения, что и атом. Оба эти метода по-разному подходят к построению исходной волновой функции, однако в высших приближениях дают практически одинаковые результаты. Метод молекулярных орбиталей лучше реализуется на ЭВМ. Поэтому почти во всех методах современной квантовой химии используется приближение молекулярных орбиталей в форме схемы представления молекулярных орбиталей (МО) в виде линейной комбинации атомных орбиталей (ЛКАО МО) Хартри-Фока-Рутаана. Расчёт МО представляет собой в этом случае просто поиск комбинаций атомных орбиталей, соответствующих симметрии молекулы и минимальному (отрицательному) значению электронной энергии. В зависимости от сложности поставленной задачи, расчётную модель усовершенствуют или же упрощают. В уравнения для гамильтониана(39) молекулы с N ядрами и п электронами входят члены: кинетической энергии ядер, кинетической энергии электронов, электростатического отталкивания ядер, потенциальной энергии притяжения электронов к ядрам, межэлектронного отталкивания.
Изучение влияния гидрофобности среды на динамику пептидов
Функциональная активность и формирование пространственной структуры природных полипептидов тесно связаны с особенностями их динамического поведения (Шайтан и др., 2003; Egorova и др., 2004а; Терёшкина, Шайтан, 2005; Терёшкина и др., 2005; Щука, Терёшкина, 2006; Orshanskiy и др., 2006). В настоящее время не вполне ясным остается вопрос, какие и в какой мере индивидуальные свойства природных аминокислотных остатков важны для формирования уникальных белковых структур. Насколько критичной для формирования белковой структуры может оказаться замена природных аминокислотных остатков на их аналоги, гомологи или изомеры. Этот фундаментальный с точки зрения биофизики вопрос может иметь и практические приложения при создании принципиально новых биологически активных структур (Глик, Пастернак, 2002).
Для понимания возможных особенностей этих структур важно, в принципе, знать конформационные и динамические свойства элементарных звеньев -аминокислотных остатков и их модификаций, в частности, и в условиях отсутствия возмущающего влияния соседей. В этом отношении удобны монопептиды, состоящие из аминокислотного остатка, связанного с N-конца с ацетилом, а С-конца с метиламином (Egorova и др., 2004а). Относительно небольшое число атомов позволяет достаточно подробно изучить различные варианты динамического поведения системы за счёт вариации внешних параметров. Такие структуры могут быть изучены методами молекулярной динамики весьма подробно как изолированно, так и в присутствии растворителя. Известно, что гидрофобность среды важна для формирования пространственной структуры полипептида и информация о влиянии среды на динамические конформации аминокислотных остатков не возмущенных присутствием соседей также может оказаться полезной.
Обычно, для характеристики конформационных возможностей аминокислотных остатков пользуются картами Рамачандрана или картами потенциальной энергии (Якубке, Ешкайт, 1985; Овчинников, 1987; Финкелыптейн, Птицын, 2002).
В этом случае, необходимо фиксировать остальные двугранные углы. Другой недостаток такого подхода состоит в исключении вклада энтропийного фактора в стабилизацию конформации. В работе используется подход к определению вероятностей заселения конформации, основанный на информации, получаемой из длинных и статистически достоверных траекторий молекулярной динамики. При этом определяются вероятности заселения конформации в пространстве двух и трех угловых переменных. По всем остальным переменным проводится усреднение. Этот подход позволяет провести подробное и сравнительное изучение конформационой динамики монопептидов и ряда их аналогов в средах с различной гидрофобностью. При этом важно отметить, что при изучении распределений пептидов по конформационным состояниям важно избегать МД протоколов, приводящих к нарушению принципа равнораспределения энергии по степеням свободы (Шайтан и др., 1997а; Шайтан и др., 1997b; Golo, Shaitan, 2001; Голо, Шайтан, 2002; Golo и др., 2004).
Проводились МД расчёты двадцати природных аминокислотных остатков и пяти форм модифицированного тирозина с различными положениями гидро-ксильных групп. Все аминокислотные остатки во избежание концевых эффектов были связаны с N-метиламином с С-конца и с ацетилом с N-конца (Рис. 6). Модификация боковых радикалов тирозина приведена в Таблица 1. В остатках TY2 и TY3 гидроксильная группа перемещалась из пара-положения в орто- (TY2) или мета-положение (TY3). В остаток TYO добавлена дополнительная гидроксильная группа, из остатка TYS удалена метиленовая группа, цепь В остатке TYC боковой радикал увеличен на одну СН2-группу.
Использовался стандартный метод молекулярной динамики со следующими параметрами протокола: Потенциальное поле AMBER-99. Длина траектории 20 не, температура термостата 2000 К Термостаты: Берендсена и столкновительный.
Постоянная времени изменения скорости в термостате Берендсена т = 0,5 пс. Диэлектрическая проницаемость среды є = 1.
Радиус обрезания для электростатических взаимодействий Rei = 20 А для расчётов в столкновительной среде, Rei = 10,5 А для расчётов в растворителях. Радиус обрезания для взаимодействий Ван-дер-Ваальса Rvdw = 16 А для расчётов в столкновительной среде, Rvdw = 8,4 А для расчётов в растворителях. Масса виртуальных частиц т=18аем, частота столкновений виртуальных частиц с атомами v=55 пс" для расчётов в столкновительной среде, т=0,01 аем и v=150 пс"1 для расчётов в растворителях.
Для численного интегрирования использовался алгоритм Верле. Начальные скорости атомов определялись с помощью генератора случайных чисел по распределению Максвелла. Шаг интегрирования 1 фс. Шаг записи в траекторный файл 0,1 пс.
Изучались модели молекул в полноатомном приближении. Параметры стандартного потенциального поля AMBER-99 для модифицированных форм тирозина были дополнены экспериментальными данными (Сталл и др., 1971; Дашевский, 1974), а также результатами квантово-химических расчётов с помощью программного комплекса GAMESS (Schmidt и др., 1993; Granovs-ky, 2006). Использовался ограниченный метод Хартри-Фока со стандартным базисным набором 6-31ГФ (2d,p). Эффективные заряды на атомах находились методом Малликена (Левцова, Терёшкина, 2006). Были проведены три группы исследований. Изучалось поведение аминокислотных остатков в водном окружении, в столкновительной среде, имитирующей водную фазу (Shaitan и др., 2000), а также в растворе метилового спирта. Расчёты в окружении воды и метанола проводились в ящике с периодическими граничными условиями размером 20x20x20 А . Была использована модель воды ТГРЗР (Weiner и др., 1986)с параметрами, соответствующими параметрам силового поля AMBER. Во избежание возникновения аттракторных динамических режимов при изучении динамики растворов наряду с термостатом Берендсена (Голо, Шайтан, 2002) также использовался столкновительный термостат (Шайтан и др., 1997а; Шайтан и др., 1997b). Плотность воды была взята р (Н20) « 0.99-103 кг/м3. Плотность метанола - р (СН3ОН) = 0.7928-103 кг/м3 (Кикоин, 1976). Для ускорения процедуры сканирования конфигурационного пространства использовалась температура 2000К.
Определение параметров МД протокола для основного и возбуждённого состояния ретиналя методами квантовой химии
Одной из основных проблем был выбор метода исследования. Наиболее точные результаты, исходя из литературных данных, дают методы Хартри-Фока (ХФ) с разложением молекулярных орбиталей по базису не ниже 6-31 ГФ, метод конфигурационного взаимодействия (KB) и метод теории возмущений. Метод конфигурационного взаимодействия требует больших затрат машинного времени и компьютерных мощностей, поэтому вместо него использовался метод KB с экстраполяцией на полный набор конфигураций. Была использована также теория возмущений Мёллера-Плессе второго и четвёртого порядков - МГІ2 и МГЦ (теория возмущений Рэлея-Шрёдингера на базе неограниченного метода Хартри-Фока).
Метод Хартри-Фока заведомо не может давать точных значений барьеров вращения по двойным связям. Это происходит из-за квазивырождения НВМО-ВЗМО. В таких случаях разумнее применять метод обобщённых валентных схем (ОВС), многоконфигурационный метод самосогласованного поля.
Были проведены исследования этилена (табл. 2,3,4) и бутадиена (рис. 3,4,5; табл. 5) в основном и возбуждённых состояниях (Egorova и др., 2003). В таблица 6 приведены результаты расчётов барьера вращения в основном состоянии этилена методами Хартри-Фока (ХФ), теории возмущений Мёллера-Плессе второго и четвёртого порядков (МГЬ, МЩ), обобщённых валентных схем (ОВС) и конфигурационного взаимодействия (KB). В методах ХФ, МП и ОВС использовался базис 6-31 ГФ. Конфигурационное взаимодействие считалось в форме КВ2 с экстраполяцией на полный набор конфигураций, орбитали атомов углерода раскладывались по базису 6-31 ГФ, водорода - ОСТ-3 ГФ. Расчетов барьера вращения в возбуждённых состояниях этилена (таблица 7) были проведены методами Хартри-Фока (ХФ) и конфигурационного взаимодействия (KB). В методе ХФ использовался базис 6-31 ГФ. Конфигурационное взаимодействие считалось в форме КВ2 с экстраполяцией на полный набор конфигураций, орбитали атомов углерода раскладывались по базису 6-31 ГФ, водорода - ОСТ-3 ГФ. S - синглетное состояние, Т - триплетное, нижний индекс указывает на номер соответствующего состояния.
Исходя из данных по этилену и бутадиену, значение барьеров вращения вокруг двойных связей наиболее хорошо описываются методом ОВС. Метод KB даёт завышенные значения, ХФ наоборот заниженные. Для одинарной связи лучшим оказывается метод ХФ, тогда как в методе KB барьер оказывается даже отрицательным. Расстояние между основным и возбуждёнными уровнями (нижним синглетным и триплетным) адекватно описывается методами и ХФ, и КВ. Качественное распределение уровней потенциальной энергии бутадиена (рис. 11, 12) подтверждает, что в сопряжённых полиенах два низших синглетных возбуждённых уровня лежат рядом. Барьеры вращения вокруг двойной связи пропадают в Si, S2 и Ті состояниях, вокруг одинарной связи в этих состояниях барьеры напротив появляются. Исходя из того, что ретиналь - полиеновая цепь с чередующимися двойными связями, и необходимо описать вращения как вокруг одинарных, так и вокруг двойных связей, расчёты ретиналя проводились методом Хартри-Фока. Учитывалось, что вокруг двойных связей значения могут быть заниженными. Однако, так как барьеры, тем не менее, высоки, такая погрешность не может сильно повлиять на результаты, полученные методом молекулярной динамики с учётом этих значений.
При выборе базиса расчёта были использованы литературные данные (Степанов, Пупышев, 1991; Минкин и др., 1997). Базис ОСТ-3 ГФ оказывается недостаточным при расчёте энергии системы, отклонения в длинах связей составляет около 0,03А, углов - 4. Использование поляризационных функций значительно усложняет расчёт из-за значительного увеличения базисных функций. Расчёты ретиналя затрудняются тем, что он относится к точечной группе симметрии Сі, то есть необходимо рассчитывать все интегралы. Поэтому оптимальным является использование базиса 6-31 ГФ.
Расположение глицинергических тормозных нейронов, волокон, содержащих глицин и глициновых рецепторов
В спинном мозге и стволе головного мозга глицинэргические синапсы играют важную роль в регуляции двигательных функций. Тормозные интернейроны также играют важную роль в регуляции работы спинальных рефлексов. Глицин и глициновые рецепторы расположены не только в спинном мозге и стволе головного мозга. Они также распределены по различным отделам ЦНС. В кохлеарных ядрах, комплексе верхней оливы, медиальных ядрах трапециевидного тела коре мозжечка, глубоких ядрах мозжечка и area postrema у взрослых крыс, мышей, кошек и морских свинок тела клеток и волокна проявляют иммунологичекую реакцию на глицин (нейроны с ИР на глицин). У взрослых кошек нейроны с ИР на глицин описаны также в подъязычная гип-покампальная формация, сенсорных тригеминальных ядрах, ретикулярных ядрах моста и продолговатого мозга и сетевидном образовании (ретикулярной формации) ствола мозга. Последние исследования на крысах свидетельствуют о том, что нейроны с ИР на глицин также находятся в верхних отделах ствола мозга и в переднем мозге. В таламусе тела клеток с ИР на глицин в основном локализованы в субфорникальном органе и латеральном ганглии поводка, в то время как волокна с ИР на глицин находятся в ядрах таламуса. Экспрессия глициновых рецепторов у молодых и взрослых крыс изучалась с помощью метода in situ гибридизации со специфическими олигонуклеотида-ми из субъединиц глицинового рецептора. Отличающиеся по структуре а и 0-субъединицы расположены областях мозга неодинаково расположены в мозге взрослых и молодых крыс. Однако не всегда наблюдается частичное перекрывание в экспрессии этих субъединиц. Некоторые клетки экспрессируют только Р-субъединицы. Только присутствие транскриптов а-субъединиц может служить доказательством присутствия функциональных глициновых рецепторов, так как только на этих субъединицах имеется сайт связывания ли-ганда. У взрослых крыс информационная РНК а-субъединиц глициновых рецепторов была обнаружена в обонятельной луковице, коре мозжечка, гиппо-кампе, таламусе, гипоталамусе, ядрах коленца, среднем мозге (в колликулах и центральном сером веществе), в мозжечке (в гранулярных клетках) в глубоких ядрах мозжечка, в ядрах ствола мозга и нейронах спинного мозга. Не смотря на то, что исследования морфологии показывают большую распространённость глицинергического ингибирования, чем считалось ранее, присутствие волокон с ИР на глицин и транскриптов а-субъединиц глицинового рецептора не всегда отражает присутствие функциональных тормозных синапсов. До настоящего времени передача тормозного сигнала посредством глицинергических синапсов была обнаружена в спинном мозге млекопитающих, клетках Гольджи в мозжечке и в клетках ретинальных ганглиев. Было показано также, что функциональные глицинергические синапсы расположены и в других областях мозга там, где выявлены глициновые волокна или транскрипты мРНК субъединиц глицинового рецептора. Существование функциональных глициновых рецепторов в нейронах, не содержащих глицинергические синапсы не кажется очевидным. Однако к таким нейронам относятся, например, гранулярные клетки в мозжечке, дофаминергических нейронах компактной части ювенильного незрелого чёрного вещества и развивающихся кортикальных нейронах. Функция таких, не входящих в синапс, глицинергических рецепторов остаётся неизвестной. Однако их можно активировать с помощью ненейронного выброса таурина (агониста глицина). Достигнуть активации таких рецепторов легче всего на стадии развития ЦНС, как показали исследования на коре головного мозга.
В предсинаптических окончаниях тормозных синапсов глициновых рецепторов или рецепторов ГАМК (тип 2) находится много мелких везикул 10-20 нм в диаметре эллипсоидной формы. Ширина синаптической щели составляет 10-20 нм против 30-40 нм у возбуждающих синапсов или синапсов первого типа. Пре- и постсинаптические уплотнения ингибиторных синапсов обычно симметричны, в то время как в возбуждающих синапсах они асимметричны. Предсинаптические окончания глицинергических синапсов, в отличие от рецепторов ГАМК, никогда не оканчиваются на дендритных отростках, их си-наптическая щель плоская. Концевые бутоны предсинаптической терминали глицинового рецептора содержат 8-20 предсинаптических плотных выступов, расположенных рядами, образующими треугольную сеть. Предсинаптические плотные выступы относятся к части предсинаптической сети. Предполагается, что они обеспечивают процесс перехода пузырьков к предсинаптической мембране. Предсинаптические сети, таким образом, могут служить отражением активных зон, тем более что в глицинергических синапсах мало сайтов выброса медиатора (1-5). Число пресинаптических сетей может зависеть как от синаптического сайта, так и от типа клетки. Например, в концевых бутонах предсинаптической терминали маутнеровских нейронов золотой рыбки синаптическая сеть только одна, в то время как в синапсах, связанных с дендритами, в той же самой клетке сетей больше. Исходя из исследований маутнеровской золотой рыбки, предполагают, что каждая активная зона может выбрасывать только одну везикулу за раз.
