Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ... ...9
Барназа 9
Начальные сведения 9
Ферментативная активность барназы 11
Структурные исследования барназы 13
Внутримолекулярная подвижность в бариазе. 17
Применение остаточных дипольных констант для анализа структуры и динамики белков 19
Остаточные диполь-диполъные взаимодействия 19
Матрща порядка Саупе 21
Механизмы ориентирования белка. 23
Применение остаточных дипольных констант для уточнения пространственной структуры 27
Распознавание структур и вписывание гомологичных моделей 3)
Определение взаимной ориентации доменов белка при помощи дипольных констант 36
Заключение ., 40
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ... 41
Приготовление образцов и измерение дипольных взаимодействий 4Ї
Структура барназы дикого типа , 49
Программа REDCAP 5J
Расчёт параметров тензора ориентации молекулы и оценка достоверности используемых моделей (7). 53
Алгоритм проведения кластеризации 56
ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ...60
Исследование изменений в структуре барназы вызванных введением мутации Е73А 61
Исследование динамических особенностей барназы при помощи остаточных КДДВ 71
Сравнение динамических доменов, полученных при помощи ЯМР и МД. 76
Анализ соответствия КДДВ 'DNH барназы дикого типа известным кристаллографическим структурам барназы . 78
Доменные движения как возможный источник ферментативной активности барназы. 80
Заключение 83
ВЫВОДЫ 84
ПРИЛОЖЕНИЯ... 86
Импульсные последовательности, используемые для измерения КДДВ 86
Измерение КДДВ 'DNH (jm-HSQC) [79] 86
Модификация jm-HSQC для измерения КДДВ' DNC [80] 87
Эксперимент для одновременного измерения. КДДВ !Dm, 'DNC- и 2D!INC- ((5,J)-ECOSY-HSQC) [81] 88
Измерение КДДВ 'DHOCJ^-I^-HSQC) [83] 89
Значения КДДВ, измеренные для мутанта барназы Е73А 9(1
Значения КДДВ, измеренные для белка барназы дикого типа 91
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ... ,.93
БЛАГОДАРНОСТИ 94
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 95
- Барназа
- Приготовление образцов и измерение дипольных взаимодействий
- Исследование изменений в структуре барназы вызванных введением мутации Е73А
Введение к работе
В настоящее время при изучении структур биологических макромолекул методом ЯМР основным источником структурной информации являются ограничения на попарные расстояния между протонами, получаемые при анализе данных о ядерном эффекте Оверхаузера (ЯЭО) [ 1 ]. Кроме того, используются константы скалярного спин-спинового взаимодействия (КССВ), дающие ограничения па двугранные углы [2], и информация о внугримолекулярных водородных связях, получаемая из экспериментов по обмену протонов NH на дейтерий растворителя или из спии-спиновьгх взаимодействий, передаваемых через водородные связи [3]. Большинство из перечисленных выше ограничений являются локальными по своей физической природе. С их помощью удается с хорошей точностью установить локальную структуру макромолекулы и получить набор пространственных структур, хорошо согласующихся с экспериментальными данными. Тем не менее, часто остаются неопределенности в строении отдельных участков молекулы и/или взаимной ориентации элементов вторичной структуры, обусловленные недостаточным количеством ограничений "дальнего порядка", т.е. ограничений на взаимное положение атомов остатков, находящихся далеко друг от друга в первичной структуре и/или в пространстве. Другим осложнением при данном подходе является проблема отнесения большого количества сигналов в области спектра, соответствующей боковым группам аминокислотных остатков, в случае больших белков. Поэтому при работе с мультидоменными белками описанный метод не столь эффективен.
Дополнительную структурную информацию можно получить из спектров ЯМР высокого разрешения при помощи создания анизотропии ориентации растворённых молекул [4,5]. Целый ряд взаимодействий, проявляющихся в спектрах ЯМР, являются анизотропными и описываются тензорами второго ранга, которые в изотропных условиях вырождаются в скалярные величины. Слабое анизотропное распределение ориентации молекул делает эти взаимодействия настолько значительными, что их можно легко детектировать методом ЯМР при условиях стандартных для изучения биологических макромолекул. Частичной ориентации молекулы можно добиться, используя анизотропию ее магнитной восприимчивости (ориентирование во внешнем магнитном поле [5,6,7]) или наличие у нее электрического дипольного момента (ориентирование во внешнем электрическом поле [ 8 ]). Однако анизотропия магнитной восприимчивости большинства белков мала и не позволяет достигать достаточной для практического применения степени их ориентирования (в магнитных полях современных ЯМР-сиектрометров), а проблемы экспериментального плана затрудняют использование внешнего электрического поля для частичного ориентирования белков. Поэтому обычно белок ориентируют, используя анизотропию его взаимодействия с упорядоченной внешней средой (жидкокристаллической матрицей) [9,10,11].
Таким образом, можно измерить дипольные взаимодействия между ядрами, обладающими магнитным моментом, анизотропию химического сдвига, и квадрупольные взаимодействия. Эффект анизотропного распределения положения молекул удобнее всего описывать при помощи ряда параметров, называющихся тензором ориентации или матрицей порядка Саупе (the Saupe order matrix) [12]. Величина остаточных тензорных взаимодействий является функцией тензора ориентации и направления в пространстве отдельных химических групп по отношению к главным осям тензора, таким образом, неся в себе информацию о структуре молекулы. Одной из таких величин является константа диполь-дипольного взаимодействия (КДДВ).
Преимущество остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия заключается в том, что они позволяют ввести так называемые дальние ограничения, т.е. несут информацию о взаимной ориентации удалённых или слабо взаимодействующих химических групп. Данные, полученные из КДДВ, могут быть использованы для уточнения структуры молекулы, рассчитанной при помощи ЯЭО и констант спии- спинового взаимодействия [ 13,14]. Также можно получить структуру и непосредственно из КДЦВ, т.е. без использования ЯЭО и КССВ [15,16]. Эксперименты по измерению констант дипольного и спин-спинового взаимодействия проводятся гораздо быстрее, чем эксперименты по измерению ЯЭО и могут применяться к большим белкам, следовательно, они являются очень эффективными при определении структуры молекул методом ЯМР. Поэтому, в настоящее время для расчета структур больших мультидоменных белков и для оценки их динамических параметров часто пользуются ЯМ Р-методиками, основанными па измерении КДЦВ [17,18,19].
Однако, по ходу выполнения работы, в имеющихся методиках были выявлены некоторые существенные недостатки, связанные с необходимостью наличия определенных знаний о структуре исследуемой молекулы (в частности о наличии и составе динамических доменов). Для устранения указанных трудностей был предложен и реализован алгоритм независимого выделения в белке динамических доменов и определения параметров их движения друг относительно друга. Разработанный алгоритм подробно описывается в главе "Материалы и методы", а его тестирование - в "Результаты и обсуждения".
В качестве объекта исследования и тестирования предложенных методик нами была выбрана барназа - представитель класса небольших бактериальных рибонуклеаз.
Часто каталитическая активность ферментов регулируется их конформационными изменениями, которые возникают в ответ на взаимодействие с лигандом или ковалентные модификации, например фосфорилирование [20,21]. Обычно эти изменения можно представить как переходы между определенными устойчивыми (энергетически выгодными) состояниями молекулы белка. Благодаря этим переходам осуществляется связывание/высвобождение субстрата или ингибитора, достигается "правильное" расположение каталитических групп, а также аллостерическое регулирование [22,23,24,25,26,27]. Помимо этого, изменения конформации белка могут приводить к изменению электрического поля в активном центре фермента [28,29]. Взаимосвязь между внутренней динамикой белка в микро- и миллисекундиом временном диапазоне и ходом каталитической реакции была показана для циклофилииа А [23] и биназы [25].
Один из наиболее изученных классов ферментов - это рибонуклеазы. Они встречаются в любом живом организме, от прокариот до млекопитающих. Рибонуклеазы в рамках своей функциональной активности - гидролиза молекул РНК - оказываются задействованными в широком спектре метаболических процессов. Изучение взаимосвязи между структурой, внутренней динамикой и функциями этих белков вносит значительный вклад не только в изучение молекулярных основ ферментативного катализа, но, кроме этого, дает возможность приблизиться к пониманию многих процессов клеточного метаболизма на молекулярном уровне.
Один из представителей класса небольших бактериальных рибонуклеаз - барназа -внеклеточный фермент, секретируемый Bacillus amyloliquefaciens. Барназа является хорошо изученным белком, исследованию ее структуры и функций посвящено большое количество работ [30,31,32,33]. К настоящему моменту выполнено много работ по клонированию барназы и ее мутантов, подробно исследованы их каталитические свойства, получено множество данных по термодинамике белка [33,34,35]. Кроме того, при помощи метода молекулярной динамики (МД) показано большое значение доменных движений для энтропийной стабилизации барназы [36]. Выявлено, что в барназе можно выделить два динамических домена, а также получены амплитуды основных коллективных мод, на которые можно разложить внутренние движения белка. Представленная динамическая модель хорошо согласуется с данными, полученными при помощи сайт-специфического мутагенеза [33,34,37,38,39]. Тем не менее, результаты МД исследований требуют независимого экспериментального подтверждения.
Целью данной диссертационной работы является установление динамических характеристик барназы при помощи методик спектроскопии ЯМР, основанных на анализе остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия. Для этого, во-первых, изучаются изменения в структуре белка, вызванные мутацией Е73А, которая препятствует образованию солевого мостика К27-Е73 и, как ожидается, должна приводить к стабилизации открытого состояния фермента [36]. А во-вторых, исследуются динамические характеристики барназы дикого типа.
Работа выполнена в лаборатории структурной биологии Института Биоорганической Химии им М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН и является составной частью проводимых в институте исследований структуры и функции биологических макромолекул.
Барназа
Барназа, внеклеточный фермент, секретируемый Bacillus amyloliquefaciens, штамм Н (IAM1512), является одним из семьи небольших бактериальных рибонуклеаз [40,41]. Известные гомологи, в дополнение к рибонуклеазам из других подвидов Bacillus, включают продукты различных штаммов Streptomyces и группу ферментов из грибов, родственную рибонуклеазе ТІ [42]. Барназа была впервые выделена и очищена как внеклеточная рибонуклеаза из Bacillus suhtilis, штамм Н (IAM1512) [43]. Для рассматриваемого как Bacillus subtilis штамма Н (IAM1512) и нескольких других штаммов Уэлкер и Кэмпбелл показали их генетическое различие [44] и предложили обозначение Bacillus amyloliquefaciens. Активное изучение барназы началось с предположения о том, что она может быть использована в качестве "идеального" объекта для исследования самосборки (фолдинга) белков. Предположение основывалось на небольшом размере барназы (ПО аминокислотных остатков, 12382 Да) и ранних исследованиях, показавших, что в барназе отсутствуют дисульфпдные связи [43] и для ее функционирования не требуется никаких нелептидных адъювантов, таких как, например, дивалентные ионы [45]. Кроме этого, она обратимо денатурирует под влиянием высокой температуры или дестабилизирующих реагентов, таких как мочевина или гидрохлорид гуанидина, демонстрируя при этом высоко кооперативный переход между двумя состояниями [45]. Такое поведение, с равновесием нативного и денатурированного состояний и пренебрежимо малой долей промежуточных состояний, позволяет проводить полный термодинамический анализ самоукладки полипептидной цепи, включая определение свободной энергии Гиббса (AG), разделяющей два конечных состояния. Как можно заметить, небольшой размер и простота барназы также позволяет продвинутся в понимании путей самосборки белковых молекул, промежуточных состояний и функциональных аспектов путем комбинации кинетического анализа и направленного мутагенеза, т.е. белковой инженерии.
Приготовление образцов и измерение дипольных взаимодействий
Приготовление образцов и измерение дипольных взаимодействий. -меченная бариаза и 15]\[-мечеішй мутант Е73А были получены и любезно предоставлены сотрудниками лаборатории инженерии белка института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН (Д.С. Семенченко, Е.Н. Ткач, Л.И. Васильевой и А.А. Шульгой).
Все ЯМР-эксперименты проводились на ЯМР-спектрометре Varian Unity 600 с рабочей частотой на протонах 600 МГц. Остаточные константы диполь-дипольного взаимодействия получали из разности эффективных констант спин-спинового взаимодействия, измеренных в изотропной и анизотропной фазах. В качестве жидкокристаллической фазы использовали билипидные мицеллы ДМФХ/ДГФХ (Avanti lipids) в 10 мМ фосфатном буфере при рН 6.5. Согласно [ 11 ], 5-15% раствор в воде этих липидов при молярных соотношениях ДМФХ:ДГФХ в диапазоне 2:1 -М:1 и температуре 25-35 С образует взвесь дискоидных мицелл (бицелл) диаметром - 1000 А. Диаметр бицелл и расстояние между ними можно варьировать в некотором диапозоне, изменяя соотношение ДМФХ/ДГФХ (предположительно, в бицеллах молекулы ДМФХ образуют бислой, а молекулы ДГФХ - "ребро" диска) и общую концентрацию липидов. Такие бицеллы выстраиваются поверхностью диска параллельно магнитному полю из-за сильной собственной анизотропии магнитной восприимчивости и жидкокристаллических свойств системы, что контролируется методами Н- и 31Р- ЯМР - спектроскопии.
Исследование изменений в структуре барназы вызванных введением мутации Е73А
Часто каталитическая активность ферментов регулируется их конформационными изменениями, которые возникают в ответ на взаимодействие с лигандом или ковалеытпые модификации, например фосфорилирование [20,21]. Обычно эти изменения можно представить как переходы между определенными устойчивыми (энергетически выгодными) состояниями молекулы белка. При помощи метода молекулярной динамики (МД) было показано, что в барназе (представитель класса небольших бактериальных рибонуклеаз) можно выделить два динамических домена, а также получены амплитуды основных коллективных мод, на которые можно разложить внутренние движения белка [36]. Анализ МД траекторий показал, что в "закрытой" форме барназы присутствует солевой мостик между остатками Lys27 и Glu73, а в "открытой" его нет. Представленная динамическая модель хорошо согласуется с данными, полученными при помощи сайт-специфического мутагенеза [33,34,37,38,39]. Тем не менее, результаты МД исследований требуют независимого экспериментального подтверждения.
Целью данной диссертационной работы является установление динамических характеристик барназы при помощи методик спектроскопии ЯМР, основанных на анализе остаточных констант диполь-диполыюго взаимодействия. Для этого, во-первых, изучаются изменения в структуре белка, вызванные мутацией Е73А, которая препятствует образованию солевого мостика К.27-Е73 и, как ожидается, должна приводить к стабилизации открытого состояния фермента [36]. А во-вторых, исследуются динамические характеристики барназы дикого типа.
Для действительно независимого подтверждения результатов МД нами разработан алгоритм выделения в белке динамических доменов и определения параметров их движения друг относительно друга, исходя только из измеренных остаточных констант диполь-дипольного взаимодействия.
Похожие диссертации на Использование остаточных диполь-дипольных взаимодействий для изучения структуры и динамики белков
