Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор
1.1 Митоз 9
1.2 Микротрубочки 13
1.2.1 Структура микротрубочек 13
1.2.2 Динамическая нестабильность 14
1.3 Строение кинетохора 17
1.4 Daml комплекс и ДАМ-кольцо in vitro 23
1.4.1 Структурные данные 23
1.4.2 Динамические характеристики 27
1.5 Модели взаимодействия кинетохора и микротрубочки 32
1.5.1 Механизм диффузии со смещением 32
1.5.2 Механизм силового давления 35
1.5.3 Электростатический механизм 37
1.6 Постановка задачи 39
ГЛАВА 2. Математическая модель микротрубочки и дам-колыда
2.1 Модель микротрубочки 40
2.2 Модель ДАМ-кольца и его взаимодействия с микротрубочкой . 42
2.3 Выбор значений констант модели 45
ГЛАВА 3. Материалы и методы
3.1 Компьютерные алгоритмы 48
3.1.1 Метод Метрополиса Монте-Карло 48
3.1.2 Генератор случайных чисел 49
3.2 Экспериментальные методы и материалы 50
3.2.1 Приготовление тубулина и нуклеирующих центров 50
3.2.2 Проточная камера 51
3.2.3 Подготовка камеры к эксперименту 52
3.2.4 Приготовление микрошариков, покрытых Daml комплексами 54
3.2.5 Коррекция интенсивности флуоресценции при обработке результатов экспериментов 55
3.2.6. Принцип действия лазерной ловушки 55
3.2.7 Инструменты и сбор данных 57
ГЛАВА 4. Результаты
4.1 Увеличение жесткости линкеров кольца ведет к уменьшению силы связывания кольца с микротрубочкой 61
4.2 ДАМ-кольцо имеет устойчивое наклонное положение по отношению к оси микротрубочки 63
4.3 Слабосвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо движется по механизму диффузии со смещением .65
4.4 Сильносвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо двигается по механизму силового шагания 67
4.5 Сильносвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо обладает более лучшими динамическими характеристиками, чем слабосвязывающееся ДАМ-кольцо 69
4.6 На закрепленных к покровному стеклу микротрубочках образуются как нормальные ДАМ-кольца, так и ДАМ-структуры в виде недостроенных ДАМ-колец 73
4.7 Микрошарики, покрытые Daml комплексом, ускоряют разборку микротрубочек и обладают высокой процессивностью движения 76
4.8 Уменьшение плотности покрытия Daml комплексом поверхности шариков ведет к уменьшению их скорости движения за деполиме-ризующимися концами микротрубочек 78
4.9 Подтверждение существования ДАМ-колец между шариками и микротрубочкой в присутствии растворенного Daml в эксперименте с лазерной ловушкой 80
4.10 ДАМ-кольца in vitro двигаются по механизму силового давления 81
4.11 ДАМ-кольца С-мутанта Daml двигаются при разборке микротрубочки с большими, чем в случае нативного Daml, скоростями 85
4.12 ДАМ-кольцо, движущиеся за деполимеризующимся концом микротрубочки, совершает прецессивные колебания 87
ГЛАВА 5. Обсуждение результатов 92
ГЛАВА 6. Выводы 99
Благодарности 100
Список литературы
- Структура микротрубочек
- Модель ДАМ-кольца и его взаимодействия с микротрубочкой
- Приготовление тубулина и нуклеирующих центров
- ДАМ-кольцо имеет устойчивое наклонное положение по отношению к оси микротрубочки
Введение к работе
ВВЕДЕНИЕ Микротрубочки - биополимеры цитоскелета, играющие важную роль в жизни клетки. Они активно участвуют в поддержании формы клетки и транспортной системе. Но самая критически важная функция микротрубочек - распределение точных копий генетического материала по дочерним клеткам во время деления клетки - митоза. Для решения этой задачи природа в течение эволюции создала специальный белковый комплекс, собирающийся на центромерном участке каждой хроматиды, — кинетохор. За него во время митоза могут зацепляться микротрубочки, участвующие в транспорте хромосом. Раньше считалось, что за перемещение хромосом в митозе отвечают моторные белки на кинетохоре, а кинетохорные микротрубочки просто играют роль «рельсов» по которым идут эти белки. Однако недавно показано [Grish-chuk 2006, Huang 2006], что это не совсем верно, так как для транспорта хромосом во время митоза необходимо и достаточно только наличие динамической нестабильности микротрубочек. Явление динамической нестабильности микротрубочек состоит в том, что каждая микротрубочка может находиться в двух состояниях — быстрой разборки или медленного роста [Walker 1988]. Причем переход из одного состояния в другое является случайным процессом у свободных микротрубочек, который называется катастрофой при переходе от роста к разборке или спасением при обратном процессе. С окращающаяся микротрубочка, зацепленная за кинетохор, тянет за собой хромосому, в то время как растущая микротрубочка наоборот толкает хромосому. Поэтому благодаря динамической нестабильности кинетохорных микротрубочек наблюдаются характерные колебания хромосом во время прометафазы и метафазы во время митоза между полюсами веретена деления. То, что микротрубочки действительно могут создавать силы достаточные для движения хромосом во время митоза, было показано экспериментально [Grishchuk 2005]. Более того, именно эта сила, создаваемая разбирающимися кинетохорными микротрубочками, является наиболее важной для сегрегации хромосом [Grishchuk 2006]. Однако до сих пор ни одна из существующих моделей взаимодействия кинетохора и микротрубочки [Hill 1985, Jogle-kar 2002, Molodtsov 2005b, Jian Liu 2006], несмотря на их частичные успехи, не может полностью описать структурные данные и динамические характеристики кинетохорных белковых копмлексов [Miranda 2005, 2007, Westermann 2005, 2006, Wang 2007].
Кроме того ни одна из этих моделей не может объяснить как достигается высокая эффективность движения кинетохора за разбирающимся концом микротрубочки при очень сильном связывании кинетохора с микротрубочкой [Westermann 2005, 2006].
Целью данной работы было создание модели взаимодействия кинетохора и микротрубочки, описывающей все известные на сегодняшний день экспериментальные данные об их структуре и динамическом поведении. С помощью этой модели предсказать, а затем и провести новые эксперименты для выяснения источников разногласий в уже существующих данных. Также выяснить с помощью теории и эксперимента механизм движения кинетохора при деполимеризации кинетохорнои микротрубочки.
Задачи исследования:
1. Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре и кинетики деполимеризации. При этом модель должна включать в себя тепловые флуктуации, которые не были учтены ни в одной предшествующей модели микротрубочки.
2. Создать и объединить с моделью микротрубочки модель кинетохорных белковых комплексов, взаимодействующих с микротрубочкой, основываясь на их структурных и динамических данных.
3. С помощью получившейся математической модели определить, какими свойствами должны обладать кинетохорные белки, взаимодействующие с микротрубочкой, для наиболее эффективного развития тянущей силы деполимери-зующейся кинетохорнои микротрубочкой.
4. Понять, как удается кинетохорным белковым комплексам быть сильно связанными с микротрубочкой и при этом быстро передвигаться.
5. Экспериментально определить по какому из известных теоретических механизмов происходит движение кинетохора во время деления клетки.
Научная новизна:
Была разработана наиболее полная модель кинетохора и его взаимодействия с микротрубочкой, включающая в себя все известные на сегодняшний день структурные и динамические экспериментальные данные. В результате введения дополни тельной гипотезы в модель о существовании подвижных белковых мостиков - линкеров у кинетохора, ответственных за связывание со стенкой микротрубочки, было показано, каким образом удается совместить высокую эффективность движения кинетохора вдоль микротрубочки с сильным связыванием кинетохора и микротрубочки. Этого свойства кинетохора до сих пор не могла объяснить ни одна существующая на сей день математическая модель. Не смотря на такое чисто теоретическое предположение, подобные линкеры были совсем недавно обнаружены на электронных фотографиях [Wang 2007], что свидетельствует в пользу созданной нами модели. Сравнение результатов модели с существующими экспериментальными данными по динамике кинетохорного белкового комплекса, ответственного за зацепление хромосомы к микротрубочкам, показало, что в природе реализуется силовой механизм движения (power stroke mechanism) кинетохора при разборке микротрубочки, а не механизм диффузии со смещением (biased diffusion mechanism). Этот результат также подтверждается проведенными мной экспериментальными исследованиями. Кроме того теоретические расчеты показали, что кинетохор движется наподобие моторных белков — его линкеры перешагивают из одного сайта взаимодействия на микротрубочке в другой, используя вместо энергии АТФ энергию упругих напряжений, запасенную в стенке микротрубочки. Подобный механизм движения до сих пор не был никем описан. Кроме того нами было экспериментально показано существование in vitro никем ранее не описанных структур, образуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках. Эти структуры обладают кинетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов.
Научно-практическое значение:
Исследование механизмов, участвующих в делении клеток, очень важно при изучении развития раковых заболеваний. Знание процессов, протекающих во время митоза и принципов их действия, может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание механизма движения и взаимодействия кинетохора с микротрубочкой, а также выяснение механизма генерации сил, развиваемых кинетохорными микротрубочками во время деления клетки. Положения, выносимые на защиту:
1. Создана оригинальная математическая модель взаимодействия микротрубочки и кинетохора, хорошо согласующаяся со всеми существующими экспериментальными данными.
2. С помощью полученной математической модели определены необходимые свойства кинетохорных белков, связывающихся с микротрубочкой, для обеспечения наиболее эффективного функционирования кинетохора.
3. Показано, каким образом можно совместить в кинетохоре два противоречивых свойства сильное связывание с микротрубочкой и высокую подвижность.
4. Экспериментально определен механизм, по которому происходит движение кинетохора во время деления клетки.
5. Экспериментально показано существование ранее никем не описанных структур, образуемых кинетохорными белковыми комплексами на микротрубочках. Эти структуры обладают кинетическими свойствами, сильно отличающимися от свойств ранее обнаруженных белковых комплексов.
Структура микротрубочек
Главной особенностью микротрубочек является их динамика, которая позволяет клетке легко контролировать транспортные процессы. Так в середине 80-х годов было открыто явление динамической нестабильности микротрубочек [Mitchison 1984]. Было показано, что микротрубочки могут находиться в двух состояниях — медленного роста и быстрой разборки. При этом существуют переходы между этими двумя состояниями - спасение микротрубочки, в результате которого быстро разбирающаяся микротрубочка вновь начинает удлиняться, и катастрофа - во время которой растущая микротрубочка начинает разбираться. Дальнейшие эксперименты по наблюдению динамики микротрубочки в DIC [Walker 1988] показали, что два ее конца ведут себя неодинаково - один более часто претерпевает катастрофы и спасе ния, чем другой. Поэтому этот более динамичный конец был назван плюс концом, а менее динамичный - минус концом. Из экспериментальных данных известно, что микротрубочки растут из полюсов веретена деления во время митоза своим плюс концом, в то время как минус конец все время находится возле полюса [Perez 1999]. Поэтому в дальнейшем мы сконцентрируемся именно на описании динамики плюс конца микротрубочки.
Наличие динамической нестабильности микротрубочки объясняется тем, что димеры тубулина могут находиться в двух совершенно разных по своим структурным свойствам состояниях. А именно - было открыто, что оба мономера тубулина связывают ГТФ [Downing 1998b]. Связанная с а-мономером молекула ГТФ никогда не гидролизуется, поэтому никак не влияет на динамику микротрубочки. Зато /?-мономер наоборот обладает высокой ГТФ-фазной активностью. Оказалось, что ГДФ-/?-ГТФ-а димеры тубулина, или сокращенно ГДФ-тубулин (называется так по состоянию ГДФ молекулы, связанной с /?-мономером) не полимеризует-ся в микротрубочки. В то время как ГТФ-/?-ГТФ-а димеры тубулина, или сокращенно ГТФ-тубулин, активно образует микротрубочки [Carlier 1982]. При этом ГТФ-фазная активность свободного тубулина [Caplow 1990] меньше его же активности в стенке микротрубочки. Ускорение процесса гидролиза внутри стенки микротрубочки объясняется тем, что молекула ГТФ находится на верхнем конце ди мера тубулина, см. рис. ЗЬ. Поэтому на плюс конце микротрубочки ГТФ-сайт /?-мономера экспонирован в раствор и молекула ГТФ стабильна до тех пор, пока к концу не присоединится новый димер тубулина, у которого а-мономер, значительно ускоряет процесс гидролиза молекулы ГТФ бывшего концевого димера тубулина [Nogales 1999]. Таким образом, на плюс конце микротрубочки находится небольшой слой ГТФ-тубулина, в то время как вся остальная стенка микротрубочки состоит из ГДФ-тубулина, что подтверждается экспериментально [Erickson 1992, Caplow 1996]. То, что ГТФ-фазная активность играет главную роль в динамической нестабильности микротрубочек, было показано на GMPCPP-тубулине, где GMPCPP — не гидроли-зуемый аналог ГТФ. Микротрубочки активно полимеризуются из такого тубулина, однако совсем не обладают динамической нестабильностью [Hyman 1992b].
Электронные фотографии концов микротрубочек, приведенных в состояние разборки, показали что протофиламенты на конце микротрубочек имеют изогнутую форму в форме колец, см. рис 4а. В то время как микротрубочки, находящиеся в состоянии роста, имеют прямые или гораздо менее изогнутые протофиламенты на конце, см. рис. 4Ь,с. Как уже упоминалось, практически вся стенка микротрубочки состоит из ГДФ-тубулинов. Поэтому было бы естественно предположить, что при разборке микротрубочки, сильно искривленные протофиламенты объясняются изогнутой равновесной формой ГДФ-тубулинов. Справедливость этого предположения доказывает равенство кривизны разбирающихся протофиламентов и колец, полимери-зованных из ГДФ-тубулина [Mandelkow 1985, 1991, Nicholson 1999]. А практически прямые концы собирающихся микротрубочек объясняются прямой конформацией ГТФ-тубулина, т.к. именно он находится на концах микротрубочек при их полимеризации.
Таким образом, из описанных выше экспериментальных данных складывается следующая картина возникновения динамической нестабильности микротрубочек: во время роста микротрубочки к ней из раствора присоединяются ГТФ-тубулины, имеющие прямую конформацию. Через небольшой промежуток времени под действием верхних димеров тубулина происходит гидролиз молекулы ГТФ, связанной с /?-субъединицей димера тубулина. В результате полученный ГДФ-тубулин будет стремиться принять искривленную форму. Если бы ему ничего не мешало, то он бы выгнулся из стенки микротрубочки наружу, и тогда стали бы образовываться искрив ленные протофиламенты, как на рис. 4а. Однако даже небольшого количества ГТФ-тубулина на конце растущей микротрубочки достаточно, чтобы не дать развиться этому процессу. Было показано, что для поддержания стабильной формы микротрубочек достаточного всего одного слоя из ГТФ-тубулинов на конце микротрубочек [Caplow 1996]. Т.е. слой ГТФ-тубулинов подобно кольцу охватывает микротрубочку и удерживает ее от разборки. Но иногда благодаря флуктуациями при росте микротрубочек целостность такого «кольца» может нарушаться. И тогда уже ничто не препятствует разборке микротрубочки, которая начинает трескаться по отдельным сворачивающимся протофиламентам. Таков предполагаемый механизм возникновения катастрофы микротрубочки. Эта гипотеза получила название «ГТФ-шапочки» [Mit-chison 1984] и она объясняет рост, разборку и возникновение катастроф. Что же касается процесса спасения микротрубочки с восстановлением слоя ГТФ-тубулинов на ее конце — то до сих пор неизвестно, какие в этом участвуют процессы.
Модель ДАМ-кольца и его взаимодействия с микротрубочкой
Из экспериментальных данных известно, что ДАМ-кольцо состоит из 16 субъединиц. Однако не совсем ясна конфигурация подобного взаимодействия кольца из 16 субъединиц с микротрубочкой, состоящей из 13 протофиламентов. Поэтому для упрощения модели мы считали, что кольцо состоит из 13 субъединиц, причем каждая взаимодействует посредством подвижного линкера со своим протофиламен-том. Это не ограничивает общности модели, поскольку образование дополнительных 3 связей стерически не возможно, т.к. соответствующим субъединицам пришлось бы увеличиться в размере в полтора раза, что является физически не возможным для белков, из-за того, что такое большое растяжение привело бы к разрушению третичной структуры белка. Кольцо считалось жестким и нерастяжимым, с внутренним диаметром равным 33 нм, что близко к экспериментально полученным значениям [Westermann 2005, Miranda 2005]. От каждой из 13 субъединиц кольца к микротрубочке идет линкер - С-конец Damlp белка комплекса Daml, который описывался линейным стержнем длиной 4 нм. Каждый линкер может сжиматься в продольном направлении, а также выгибаться из плоскости, при этом в расслабленном состоянии все линкеры лежат в плоскости кольца. Таким образом, в расслабленном состоянии линкеры будут иметь длину (33-25)/2 = 4 нм, где 33 нм — внутренний диаметр ДАМ-кольца, а 25 нм - внешний диаметр микротрубочки. Положение каждого такого стержня-линкера в пространстве задается тремя координатами положения конца, закрепленного за одну из субъединиц ДАМ-кольца, 2 углами, характеризующими направление стержня в пространстве, и его длиной. Из экспериментальных данных [Miranda 2005, Westermann 2006] можно посчитать, что коэффициент диффузии кольца, сидящем на микротрубочке, в 200 раз меньше, чем коэффициент диффузии свободного кольца в растворе. Следовательно, это означает, что на поверхности ди-меров тубулина должны быть специфические центры связывания линкеров ДАМ-кольца. Поэтому, исходя из статьи [Westermann 2005] о том, что в связывании Dam I декамеров с микротрубочкой нужны С-концы а-мономеров тубулина, мы предположили, что есть только один центр связывания - на а-мономере, а на Р-мономере его нет. Правильность этого предположения была подтверждена расчетами по величине среднего угла наклона кольца по отношению к оси микротрубочки (см. стр. 63-64). Положение сайта взаимодействия линкера с а-мономером тубулина показан желтым кружочком на рис. 14. При достаточно сильном взаимодействии с димерами тубулина свободные концы линкеров будут находиться большую часть времени в центрах связывания, т.е. будут лежать на внешней поверхности мономеров в плоскости протофиламента. Поэтому мы считали, не ограничивая общности, что подвижный конец линкера все время движется по внешней поверхности протофиламента. Это налагает условие связи для описания положения каждого из С-концов. Следовательно, каждый С-конец будет описываться пятью степенями свободы вместо шести — тремя координатами конца, закрепленного за субъединицу кольца, длиной и одним углом. В качестве этого угла мы взяли угол а между плоскостью кольца и направлением линкера. Эти углы, так же как и углы наклона мономеров тубулина т ,„ являются независимыми переменными в нашей модели. Кроме того очевидно, что к независимым переменным относятся три координаты положения центра ДАМ-кольца в пространстве Хс, Yc, Zc и три угла Эйлера для кольца в, q , у/, а положения центров субъединиц кольца являются функциями от этих шести независимых переменных. Следовательно, длины линкеров, которые являются функциями координат центров субъединиц кольца, конфигураций протофиламентов (характеризуемых углами тк „) и углов ак не являются независимыми переменными. Углы Хк,п, о-к, 6,ф,ц/и координаты Хс, Yc, 7 составляют весь набор независимых переменных системы, который мы обозначим П. Для удобства на рис. 15 изображены углы Эйлера, применявшиеся в модели. Темно сиреневым диском изображена неподвижная плоскость, расположенная перпендикулярно оси микротрубочки, которая совпадает с направлением оси z, изображенной коричневым цветом и идущей от минус к плюс концу микротрубочки. Темно синяя ось х лежит в плоскости 13 протофиламента. Таким образом, оси x,y,z, изображенные темными цветами образуют неподвижную систему координат. Розовым диском изображена плоскость кольца. Красная ось ъ перпендикулярна плоскости кольца и совпадает с осью кольца. Следовательно, оси x y z образуют подвижную систему координат, связанную с ДАМ-кольцом.
Как упоминалось выше, в модели линкеры представлены в виде линейных гу-ковских подвижных пружинок. Энергию продольной деформации п-го линкера можно записать как: Кроме этих двух энергий, описывающих свойства упругости линкеров в модель была введена энергия взаимодействия подвижного конца линкера с мономерами тубулина. Вне зависимости от того насколько сложно это взаимодействие может быть организовано пространственно, оно сводится к тому, что существует некоторое положение конца п-го линкера относительно к-го мономера тубулина при котором энергетический член, описывающий энергию взаимодействия линкера с а-мономером тубулина имеет минимум. При перемещении ДАМ-кольца энергия возрастет на характерном расстоянии белок-белкового взаимодействия и выходит на насыщение, где энергия взаимодействия равна нулю. При приближении к соответст вующему положению на следующем а-мономере тубулина энергия взаимодействия опять станет отрицательной. Такая картина будет периодична с периодом в один ди-мер тубулина. Для простоты модели мы положили, что центр связывания линкра находится посередине внешней поверхности а-мономера тубулина. Энергия взаимодействия подвижного п-го линкера ДАМ-кольца с центром взаимодействия на поверхности а-мономера может быть аппроксимирована следующей формулой: РІ dn{Pn) = kDAMe гЪш (5) где колм - параметр, описывающий глубину ямы; параметр г DAM — параметр, характеризующий ширину потенциальной ямы, р„ = pn(Q) — расстояние от подвижного конца п-го линкера до центра взаимодействия на ближайшем а-мономере, является функцией независимых переменных. Таким образом, полная функция потенциальной энергии для микротрубочки, взаимодействующей с кольцом, имеет вид: u = STZ км fe, [ч,п))+ vkjH к» {тк,п))) + Чп (Д/„ (Q)) + рн (Рп (Q))+dn (р„ (Q)) и=1 V к=\ )
Большинство параметров модели были выбраны исходя из известных экспериментальных данных. Параметр Хо в формуле (1) был выбран исходя из структурных данных [Muller-Reichert 1998]. В этой статье было показано, что угол между соседними ГДФ-димерами тубулина в протофиламенте в расслабленном состоянии равен 0.4 радиана. Для простоты мы считали, что этот угол есть сумма равных интер-димерного и интрадимерного изгибания между мономерами тубулина, т.е. равновесный угол Хо - 0.2 радиана в обоих случаях. Другой параметр - В в формуле (1) был выбран из соображения, что вся энергия гидролиза ГТФ, связанного с Р-мономером тубулина, - Ен = 7.3 ккал/моль = 12.3 квТ, [Lehninger 1993], запасается в стенке микротрубочки в виде упругих напряжений. Следовательно, В = Еи/Хо 300 квТ/рад2. Такой подход позволяет сделать оценку максимально возможной силы, развиваемой деполимеризующейся микротрубочкой на ДАМ-кольцо.
Приготовление тубулина и нуклеирующих центров
Негидролизуемый аналог ГТФ — GMPCPP был приобретен у Jena Bioscience. За время промывки камеры на плюс концах микротрубочек нарастало несколько слоев GMPCPP-тубулина и микротрубочки становились устойчивыми и не чувствительными к разбавлению концентрации свободно плавающих димеров тубулина. Благодаря этому камеру можно было хорошо отмыть от остатков свободно плавающего в растворе меченого родамином тубулина. Кроме того благодаря наличию крашеного родамином тубулина на GMPCPP кончиках микротрубочек, можно было инициировать деполимеризацию микротрубочек, находящихся в поле зрения микроскопа, уничтожая GMPCPP кончики микротрубочек путем их освещения зеленым светом, на котором поглощает родамин [Grishchuk 2005]. Отмывка камеры производилась все тем же буфером А на скорости 10 мкл/мин в течение 5 минут. Затем камера промывалась буфером Б, за основу которого брался буфер А с добавлением BSA до концентрации 0.5 мг/мл и 1% 2-меркаптоэтанолом. Такие высокие концентрации казеина и BSA брались для того, чтобы препятствовать адсорбированию меченого флуоресцентного тубулина и Daml комплекса (в тех экспериментах, где он использовался) на покровном микроскопном стекле. Меркаптоэтанол необходим был для поддержания рабочего состояния Daml комплекса, находящегося на шариках или в растворе, в течение всего эксперимента. Все описанные в диссертации эксперименты с проточной камерой проводились в буфере Б. Схематическая идея эксперимента изображена на рис. 16.
В некоторых экспериментах в проточную камеру добавлялся раствор буфера Б с Daml комплексом там, где это отдельно оговаривается в тексте. Меченный краской Daml комплекс был любезно предоставлен Вестерманом, университет Беркли, Калифорния. Непосредственно перед введением в проточную камеру Daml разводился в буфере Б до концентраций порядка 3-30 нМ. Этот разброс концентраций объясняется немного различными аффиностями Daml к микротрубочкам в разных выделениях этого комплекса из E.coli. Чтобы этот разброс не сказывался на результатах экспериментов, мы добавляли в раствор Daml комплекс так, чтобы плотность ДАМ-пятен на микротрубочках была приблизительно одна и та же во всех экспериментах.
В эксперименте по связыванию микротрубочек, стабилизированных таксолом, с поверхностным стеклом, проточная камера приготовлялась немного по другому протоколу. Покровное стекло, которое использовалось в проточной камере, инкубировалось 10 минут в буфере А с добавлением BSA и стрептавидина до концентрации 0.5 мг/мл. Соотношение обычного тубулина к биотинилированному тубулину в микротрубочках было 2.5:1. Микротрубочки вмывались в проточную камеру и инкубировались в ней 5 минут. Затем камера промывалась буфером Б, как было описано выше.
Приготовление микрошариков, покрытых Daml комплексами Для этой цели брались стеклянные карбоксилированные шарики (Bangs Laboratories) диаметром 0.52 мкм, на поверхности которых производилась пришивка стрептавидина к карбоксильным группам по протоколу, взятому у Bangs Laboratories. Затем эти шарики инкубировались с биотинилированными антипентагистидиновыми антителами (Qiagen) в течение 1 часа при температуре 4С в насыщающей концентрации, которые прикреплялись к стрептавидину на поверхности шариков. После отмывки шариков на эпендорфной центрифуге и их разбиении в соникирующей ванночке в течение 5-Ю минут, 108 шариков инкубировалось 1-3 часа при 4С с 6-320 нМ 6His-Daml комплексом, помеченным краской алексой 488 (в зависимости от желаемой плотности покрытия шариков комплексом Daml). Потом шарики еще дважды отмывались в BRB-80 с 1 мМ DTT и 100 мкМ BSA при концентрации шариков 0.01% по массе. В дальнейшем шарики хранились на льду в течение 4 дней. Непосредственно перед добавлением в проточную камеру шарики еще дважды отмывались и в конце разводились в буфере Б.
Экспериментальные оценки флуоресценции Daml на поверхности таких шариков показали, что максимальная плотность Daml на поверхности шариков, которую можно достигнуть по этому протоколу, равна 2-4-104 гетеродекамерам на один шарик, т.е. одна молекула Daml на 100 нм2. Эти данные говорят о том, что Daml покрывает шарики одним ровным слоем, с учетом того, что площадь поперечного се-чения Daml комплекса составляет 70 нм . Меньшие плотности Daml на шариках можно получить, инкубируя шарики с меньшими концентрациями Daml комплекса. При этом минимальная плотность Daml, при которой шарики все еще связывались с микротрубочками и двигались за разбирающимся концом при их деполимеризации, была равна 20-40 гетеродекамерам на одном шарике. Коррекция интенсивности флуоресценции при обработке результатов экспериментов
Там где приводятся графики изменения интенсивности флуоресценции ДАМ-пятен с течением времени, применялась следующая процедура коррекции для учета шума, даваемого видеокамерой, и обесцвечивания краски с течением времени. Из интегральной интенсивности флуоресценции ДАМ-пятна на микротрубочке вычитался средний уровень шума, померенный в том же снятом микроскопной видеокамерой кино в области, где отсутствовали какие-либо флуоресцентные пятна. Затем получившаяся разница делилась на нормированную интенсивность контрольной точки. За такую контрольную точку обычно брались ярко флуоресцирующие аксонемы, на которых также налипал меченный краской Daml комплекс, и интенсивность которых также спадала с течением времени по экспоненциальному закону.
Принцип действия лазерной ловушки В данной работе в нескольких экспериментах применялся инструмент под названием лазерная ловушка. Поэтому стоит подробно описать принцип ее действия.
Возможность измерять малые сил, составляющие несколько пиконьютон появилась совсем не давно и связана с появлением лазерных пинцетов "laser tweezers" или оптических ловушек "optical trap". Эта техника основана на использовании сил радиационного давления, связанных с изменением момента световой волны при преломлении на границе с диэлектрическими частицами. Впервые возможность управлять маленькими частицами лазерным лучом была продемонстрирована в работе [Ashkin 1970]. Автор использовал Гауссов лазерный луч мощностью всего в несколько милливатт для того, чтобы показать, что небольшие частицы двигаются в направлении распространения светового луча благодаря давлению, оказываемому на частицы со стороны светового луча. В ходе экспериментов оказалось, что существует еще одна компонента силы, благодаря которой частицы с периферии втягиваются в область наибольшей интенсивности света - в область оси лазерного луча
ДАМ-кольцо имеет устойчивое наклонное положение по отношению к оси микротрубочки
На этом рисунке черным цветом изображена диаграмма распределения для теоретических расчетов в предположении, что на один димер тубулина приходится только один сайт связывания линкера кольца - на а-мономере. Белым цветом изображена диаграмма распределения для экспериментальных данных. Для Рис. 22. Угловая диаграмма предпочтитель ных положений ДАМ-кольца в математиче ской модели. Каждая точка соответствует одному положению кольца. Центр диаграм мы, где sinO = 0 соответствует кольцу, пер пендикулярному оси микротрубочки. По кру гу изображены цифры, обозначающие номера протофиламентов микротрубочки. Оранже вой линией изображено положение шва мик ротрубочки. Из рисунка видна асимметрия предпочтительных положений кольца по от ношению ко шву микротрубочки, вызванная спиральностью микротрубочки. Видно, что ДАМ-кольцо предпочитает наклонное поло жение, когда его ось направлена в сторону 5 го протофиламента микротрубочки. Теоре тический расчет сделан для А „ = 20 квТ/рад и кПАМ = 13 квТ. сравнения была также посчитана серая диаграмма распределения в случае, когда на димер тубулина приходится два сайта связывания линкера кольца - один на а-мономере, другой - на Р-мономере. Из диаграммы видно, что в этом случае углы наклона смещены в сторону более низких значений, что естественно - т.к. сайты связывания расположены на поверхности микротрубочки с вдвое большей плотностью, то кольцу надо меньше наклониться, чтобы его линкеры могли достать до близлежащих сайтов связывания. С достоверностью в 95% эта теоретическая диаграмма отличается от экспериментальной диаграммы. Эти данные хорошо согласуются с экспериментальными наблюдениями [Westermann 2005], которые свидетельствуют о том, что субъединицы ДАМ-кольца связываются только с а-мономерами димеров тубулина. Таким образом, кольцо с параметрами kjiex = 20 квТ/рад и kDAM = 13 квТ, взаимодействующее с а-мономерами димеров тубулина, хорошо описывает имеющиеся экспериментальные данные, полученные при помощи электронного микроскопа.
Более детальное изучение положения кольца в пространстве в математической модели при параметрах, лучше всего соответствующих экспериментальным данным, показало, что у кольца есть несколько выгодных наклонных положений с мало отличающейся полной энергией системы. Лучше всего эти положения можно проиллюстрировать с помощью полярной диаграммы, как это сделано на рис. 22. На диаграмме каждая точка изображает проекцию конца единичного вектора коллине-арного оси кольца на плоскость, перпендикулярную оси микротрубочки, т.е. проще говоря, проекцию конца красного вектора z на фиолетовую плоскость на рис. 15. Радиальные круги на диаграмме, идущие с шагом 0.05, показывают абсолютную величину проекции, равную sin 0, где 9 — угол Эйлера между векторами z и z\ А азимутальные направления, с соответствующими номерами, показывают расположение плоскостей протофиламентов, если смотреть от плюс конца к минус концу микротрубочки. Из диаграммы видно, что точки расположены несимметрично, что объясняется спиральностью микротрубочки. Наиболее часто кольцо образует угол 0.27 ± 0.07 рад по отношению к оси микротрубочки с наклоном в сторону 5 протофиламен-та. Данная конфигурация изображена на рис. 19.
Дальше я решил посмотреть, как сильно влияют параметры kjjex и колм на эффективный коэффициент диффузии кольца, связанного с микротрубочкой. Здесь слово эффективный добавляется для того, чтобы не путать этот коэффициент диффузии кольца вдоль микротрубочки с коэффициентом диффузии свободного кольца в растворе, т.к. первый зависит от силы связывания линкеров с димерами тубулина колм, в то время как второй — величина постоянная. Расчеты показали, что наибольшее влияние на этот параметр оказывает величина колм, в то время как кдех не так сильно меняет эффективный коэффициент диффузии кольца вдоль микротрубочки. Результаты расчетов изображены на рис. 23, на котором показаны зависимости эффективного коэффициента диффузии кольца от глубины ямы колм для различных изгибных жесткостей линкеров kjiex. Из графиков видно, что когда взаимодействие кольца с микротрубочкой очень слабое {колм 2 квТ), кольцо диффундирует очень быстро. При этом эф фективный коэффициент диффузии на этом участке мало зависит от глубины ДАМ-потенциала. При увеличении силы связывания (крлм 2-5 квТ) наблюдается экспоненциальная зависимость — увеличение силы связывания на 1 кцТ приводит к 10 кратному уменьшению эффективного коэффициента диффузии ДАМ-кольца в модели.
Если предположить, что в статье [Westermann 2006] был померян эффективный коэффициента диффузии кольца, а не какой-то другой структуры, вдоль микротрубочки —5-Ю"10 см2/с, то из этого графика можно определить глубину ДАМ-потенциала кольца. При коли 4 квТ расчетный коэффициент диффузии кольца совпадает с экспериментально измеренным.
При такой маленькой силе связывания во время укорочения микротрубочки кольцо двигается по механизму направленной диффузии, см. рис. 24, на котором изображено изменение положения центра кольца и деполимеризующегося конца микротрубочки с течением времени. Из графика видно, что кольцо совершает случайные движения вдоль микротрубочки, однако де-полимеризующийся конец микротрубочки ограничивает движение кольца, не давая ему слететь с микротрубочки. Это происходит благодаря тому, что деполимеризую-щийся конец очень сильно раскрывается, см. рис. 13а, и его диаметр превышает диметр ДАМ-кольца. Поэтому такой конец микротрубочки играет роль энергетического барьера, который кольцо не может преодолеть, т.к. для этого понадобилась бы энергия 100 квТ для распрямления протофиламентов микротрубочки, которую неоткуда взять кольцу. 4.4 Сильносвязывающееся с микротрубочкой ДАМ-кольцо двигается по механизму силового шагания При увеличении глубины ДАМ-поіенциала наблюдаются сильные изменения в динамическом поведении кольца. Так при крлм= 10-15 квТ кольцо имеет очень маленький эффективный коэффициент диффузии ( 10 16 см2/с), т.е. такое кольцо при характерном времени проведения эксперимента порядка часа выглядело бы неподвижным. Но оказывается, что при деполимеризации микротрубочки изгибающиеся 500 1000 время, мс Рис. 25. Зависимость положения центра ДАМ-кольца от времени при деполимеризации микротрубочки для раз ных кшм. Видно, что с увеличение глубины взаимо действия линкеров кольца с микротрубочкой замедля ется движение кольца в результате возникновения все более длинных пауз на графиках. Сами паузы являются результатом стохастического поведения протофиламен тов при разборке микротрубочки и вероятностными переходами кольца между устойчивыми положениями относительно микротрубочки. Расчеты произведены для кда 20 квТ/рад. протофиламенты развивают силу давления на линкеры кольца, достаточную для того, чтобы кольцо начало двигаться со скоростями порядка скорости разборки микротрубочки. При этом такое кольцо начинает перемещаться вдоль оси микротрубочки шагами (см. рис. 25), что разительно отличается от направленной диффузии слабосвязанного с микротрубочкой кольца (см. рис. 24). На рис. 25 разными цветами изображены графики смещения центра кольца вдоль оси микротрубочки в зависимости от времени для разных значений колм-Из графиков на рис. 25 видно, что центр сильно связанного с микротрубочкой кольца всегда движется в направлении деполимеризации микротрубочки и не испытывает случайно диффузии как у слабосвязанного с микротрубочкой кольца. Однако и здесь наблюдается некий элемент случайности - движение кольца часто прерывается более или менее длительными паузами, являющимися результатом стохастического поведения протофиламентов при разборке микротрубочки и вероятностными переходами кольца между устойчивыми положениями относительно микротрубочки. При этом длительность пауз тем больше, чем больше сила связывания линкеров кольца с поверхностью микротрубочки.
