Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1 Деление клетки и движение хромосом 8
1.2 Современные представления о структуре и динамике микротрубочек
1.2.1 Структура микротрубочки 9
1.2.2 Динамика микротрубочки //
1.2.3 Структурная основа динамической нестабильности 13
1.3 Математические модели динамики и механики микротрубочек 14
1.3.1 Кинетические модели 14
1.3.2 Сича, развиваемая микротрубочкой 17
1.3.3 Термодинамические оценки 18
1.3.4 Модели сопряжения микротрубочки с кинетохором 19
1.4 Экспериментальные исследования сил, развиваемых микротрубочками 20
1.5 Измерение малых сил с помощью оптической ловушки 23
1.6 Постановка задачи 25
Глава 2. Математическая модель 26
2.1 Описание модели 26
2.2 Описание потенциалов продольных взаимодействий 28
2.3 Описание латеральных взаимодействий 30
2.4 Полная потенциальная энергия мт 30
2.6 Расчет равновесной силы, развиваемой микротрубочкой 32
2.7 Оценка жесткостей продольных и поперечных связей 33
2.8 Модель, используемая в эксперименте 35
Глава 3. Методы 37
3.1 Численный метод 37
3.2 Линеаризация уравнений основной модели 38
3.2.1 Микротрубочка без спиралъности 38
3.2.2 Переход к другим переменным 38
3.2.3 Модель одного протофиламента 39
3.2.4 Линеаризация уравнений равновесия 39
3.3 Экспериментальные методы и материалы исследования 40
3.3.1 Описание установки 40
3.3.2 Схема эксперимента 45
3.3.3 Приготовление тубулина и нуклиирующих ifeumpoe 45
3.3.4 Проточная камера 46
3.3.5 Подготовка камеры к эксперименту 47
3.3.6 Обработка экспериментальных данных 49
Глава 4. Результаты 50
4.1 Стабильность мт с т-шапкой и без 50
4.2 Баланс изгибающих сил в стенке микротрубочки 51
4.3 Локальность взаимодействий внутри стенки мт 52
4.4 Форма кончика микротрубочки 53
4.5 Характеристика стабильности мт 53
4.6 Параметры, влияющие на стабильность 54
4.7 Разница между плюс и минус концами 56
4.8 Микротрубочка 13 3 немного менее стабильна, чем 13 0 57
4.9 Независимость главных выводов от параметров, описывающих силы 58
4.10 Катастрофа при наличии удерживающего кольца 59
4.11 Развитие силы протофиламентом 60
4.12 Влияние латеральных потенциалов на развитие сил 62
4.13 Оценка максимальной силы, развиваемой микротрубочкой 63
Глава 5. Обсуждение результатов 74
5.1 Обсуждение теоретической части работы 74
5.2 Обсуждение экспериментальной части работы 78
Глава 6. Выводы 80
Список литературы 81
Приложение 88
- Современные представления о структуре и динамике микротрубочек
- Описание потенциалов продольных взаимодействий
- Линеаризация уравнений основной модели
- Баланс изгибающих сил в стенке микротрубочки
Введение к работе
Микротрубочки являются важнейшими компонентами цитоскелета эукариотических клеток. Они участвуют в поддержании клеточной формы, движении, а так же перемещении органелл, включая митотические хромосомы. Микротрубочки не только взаимодействуют с моторными белками, выполняющими работу по перемещению, но и сами способны совершать работу. Хромосомы расходятся по дочерним клеткам во время митоза, взаимодействуя с микротрубочками митотического веретена. Плюс концы микротрубочек связывают кинетохоры - специальные образования на хромосомах, соответствующие центромерному участку. Во время прометафазы хромосомы связанные с микротрубочками перемещаются в сторону к полюсу или прочь, а затем во время метафазы выстраиваются в метафазную пластинку. Сестринские хроматиды расщепляются во время анафазы и хромосомы движутся к полюсам. Во время всех этих перемещений связанные с кинетохорами микротрубочки изменяют свою длину, добавляя или теряя субъединицы на их плюс конце, в месте соединения с кинетохором, в том же самом месте, где кинетохор скользит по поверхности микротрубочки. Хотя в последние годы был сделан существенный прогресс, и многие белки входящие в состав кинетохоров известны, понимание молекулярных основ генерации сил в митозе по-прежнему отсутствует. Каким образом развиваются силы, которые перемещают хромосомы на молекулярном уровне - старейший вопрос исследователей митоза по-прежнему не имеет однозначного ответа. Полимеризующиеся и деполимеризующиеся микротрубочки можно рассматривать как молекулярные машины, которые выполняют работу, толкая или таща за собой объекты, благодаря энергии гидролиза ГТФ выделяемой во время полимеризации. По сравнению с полимеризацией, где теоретические представление весьма хорошо разработаны, механизм, в результате которого развивается тянущая сила при деполимеризации остается по большей части не ясным. Отчасти это связано с принципиальной трудностью представления устройства, которое бы позволило объекту следовать за концом деполимеризующейся микротрубочки, не теряя механического контакта. Существует две принципиальных модели описывающих подобное сочленение, но у обоих отсутствует количественное описание. Что касается величин развиваемых сил, то существующие оценки, основанные на энергии ГТФ гидоролиза или константах скорости полимеризации-деполимеризации тубулина, чрезвьиайпо грубы. Из-за такой неопределенности вклад динамики микротрубочек в движения хромосом до сих пор был не ясен.
Целью данной работы было теоретическое и экспериментальное исследование сил, развиваемых микротрубочкой во время деполимеризации. Мы хотели создать наиболее полную модель, которая бы позволила количественно определять силы, которые микротрубочки могут развивать, основываясь на описаниях потенциалов взаимодействия между молекулами тубулина, а так же рассчитывать уже существующие не количественные модели. Второй целью работы явилось сравнение теории и эксперимента -прямое измерение развиваемой силы.
Цель работы: Разработка модели микротрубочки позволяющей рассчитывать силу, развиваемую в процессе деполимеризации микротрубочки и ее экспериментальная проверка.
Задачи исследования:
1. Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре, кинетики деполимеризации и свойствах составляющих мономеров.
2. С помощью модели определить силу, развиваемую микротрубочкой в процессе деполимеризации
3. Проанализировать свойства сопрягающего устройства, необходимого для наиболее эффективного развития силы
4. Экспериментально измерить силу, и сравнить с теорией
Научная новизна:
Мы разработали молекулярно-механическую математическую модель микротрубочки. Мы показали, что концы микротрубочек слегка изогнуты, не достаточно, чтобы это можно было увидеть при помощи электронной микроскопии, но достаточно для того, чтобы их могли узнавать специализированные белки. Мы показали, что баланс продольных взаимодействий в протофиламентах ответственен за стабильность основной части микротрубочки, а не наличие поперечных связей. Мы проанализировали размер ГТФ шапки и нашли, что двух слоев ГТФ тубулина достаточно, чтобы стабилизировать микротрубочку любой длины в большинстве случаев. Усовершенствованная модель, которая описывает взаимодействие с сопрягающим устройством, позволила рассчитать максимальную силу, которую может развивать микротрубочка. Мы показали, что вся энергия, выделяемая в результате гидролиза молекул ГТФ во время полимеризации, может быть запасена в стенке микротрубочки и использована для генерации сил. Максимальное использование запасенной энергии достигается при развитии силы по механизму удара (power-stroke mechanism). Максимальная сила составляет 75 пН для полной микротрубочки. Эта сила достигается только при полной диссоциации латеральных связей димеров развивающих усилие. Если сопряжение достигается посредством кольца, то в диаметре оно должно быть на 10 им больше внешнего диаметра микротрубочки, для того, чтобы развиваемое усилие было максимально.
Мы разработали и построили оптическую ловушку для того, чтобы непосредственно впервые измерить величину силы развиваемой микротрубочкой во время деполимеризации. Мы получили спектр развиваемых сил, разной величины. Максимальная развиваемая сила оказалась в точности равной рассчитанной теоретически. Механо-химический механизм развития силы оказался уникальным: молекулы тубулина, из которых состоят стенки микротрубочек, при полимеризации присоединяются к растущей трубочке в «выпрямленной» конформации, и в связанном с ГТФ состоянии. После полимеризации происходит расщепление ГТФ и выделившаяся энергия запасается в «напряженном» состоянии тубулина. При этом каждая молекула тубулина стремиться выгнуться наружу из стенки трубочки. Это напряжение, высвобождаясь в процессе деполимеризации микротрубочки, может развивать значительные силы и совершать работу по движению хромосом, если разбирающийся конец микротрубочки соединен с хромосомой соответствующим устройством сопряжения. Измеренная нами сила велика и составляет примерно десять сил, развиваемых единичным моторным белком. Из этого следует, что данный механизм может быть основным в движении хромосом во время митоза. Мы промоделировали эксперимент, модернизировав разработанную нами модель и нашли, что спектр различных амплитуд сил, наблюдаемых в эксперименте соответствует различным сценариям разрушения связей между протофиламентами во время деполимеризации. Трещины между протофиламентами могут распространяться, оставляя 2 или 3 или другое число протофиламентов в отдельной связке, которая развалится позже, определяя амплитуду развиваемой силы. Этот результат означает, что развитие силы на не симметричном устройстве, как это было у нас в эксперименте, может быть случайным образом снижено из-за асинхронности разборки микротрубочки. В некоторых из наших экспериментов в результате наличия натяжения продольные связи в протофиламентах существую дольше, чем обычно при разборке микротрубочек, стабилизируемые натяжением. Это может означать наличие специального механизма, который бы позволял сохранять соединение кинетохора с микротрубочкой в то время, когда сила, приложенная к хромосоме в стороны противоположенного полюса велика.
Научно-практическое значение:
Исследование механизмов деления клеток имеет принципиально важное значение для исследования развития раковых заболеваний. Понимание процессов протекающих во время митоза и их механизмов может помочь в создании анти-раковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание важности и существенности динамики микротрубочек в движение хромосом во время деления.
Положения, выносимые на защиту:
1. Построена оригинальная молекулярно-механическая модель микротрубочки.
2. С помощью модели рассчитана сила, развиваемая микротрубочкой в процессе деполимеризации. Рассмотрены различные механизмы сопряжения с передающим устройством.
3. Сила, развиваемая микротрубочкой, измерена экспериментально. Ее величина составила 60 пН, что находится в прекрасном согласии с теорией.
4. Механизм развития силы уникален и являет собой новый тип биомеханического движителя.
Современные представления о структуре и динамике микротрубочек
Микротрубочки - это полимеры, построенные из молекул тубулина, дим еров состоящих из а и /? мономеров (см. рис. 1А). Полярность тубулина диктует полярность микротрубочки. Более быстро растущий конец микротрубочки, получивший название плюс-конец заканчивается /3 субъединицами, а более медленно растущий минус конец - а субъединицами (Hirose et al., 1995; Mitchison, 1993). Каждый мономер тубулина связывает молекулу ГТФ. Во время полимеризации ГТФ, связанная с /? субъединицей гидролизуется, фосфат уходит, а ГДФ остается связанной с мономером. Таким образом большая часть МТ состоит из так называемого ГДФ-тубулина, или просто Д-тубулина. Во время полимеризации ГТФ тубулин, связанный с а субъединицей не гидролизуется.
Рис. 1. Структура и динамика микротрубочки (из Alberts et al., 2002). А. Димер тубулина - составляющая часть протофиламента в микротрубочке. Красным показаны связанные с тубулином ГТФ. В. Электронные микро фотографии и условные изображения концов растущей и деполимеризующейся микротрубочек.
Внутри полимера димеры организованы в линейные протофиламенты. Несколько протофиламентов юаимодействуя латерально, образуют цилиндрическую стенку микротрубочки диаметра 25 нм. Когда тубулин полимеризуется в микротрубочки in vitro, число протофиламентов может колебаться от 10 до 18-ти (Chretien et al., 1998; Meurer-Grob et al., 2001). In vivo и когда микротрубочки нуклеированы на центросомах или аксонемах число протофиламентов равно 13-ти. Это обеспечивается наличием в этих структурах специальной формы тубулина - у -тубулина, который инициирует нуклеацию образуя кольца, служащие как шаблон для дальнейшего удлинения микротрубочки. Внутри микротрубочки протофиламенты взаимодействуют со сдвигом образуя так называемую В-решетку (Desai and Mitchison, 1997). В этой решетке акр мономеры в протофиламенте взаимодействуют со сдвигом соответственно с а и /? мономерами в соседнем протофиламенте. В противоположенность возможной А-решетке, в которой а мономеры в одном протофиламенте взаимодействуют с /? мономерами в соседнем. Наиболее распространенной in vivo является решетка типа 13_3, что означает наличие 13-ти протофиламентов образующих 3-х заходовую спираль считая по мономерам. Такая микротрубочка неизбежно имеет шов. Это место, в котором В-решетка нарушена, и контакты между 1-ым и 13-ым протофиламентами образованы а-Р связями. Наличие шва было продемонстрировано экспериментально, и возможно ним могут быть ассоциированы специальные функции (Kikkawa et al., 1994).
Тубулин был идентифицирован в конце 1960-х по преобладанию в жгутиках простейших и способности связывать радиоактивный колхицин. После выделения тубулина из мозгов коров в 1972 (Weisenberg, 1972) в биохимии тубулина появилось две модели динамики полимеризации управляемые гидролизом ГТФ. Первый - тредмиллинг, тип динамического поведения при котором количество субъединиц присоединяющихся с одного конца равняется количеству субъединиц отсоединяющихся с другого, не наблюдался экспериментально. Эксперименты по фотообесцвечиванию флуоресцентного тубулина впервые выявили, что в равновесии скорость обновления тубулина в веретенах митотических клеток необъяснимо велика (Salmon et al., 1984). Первый ключ к пониманию того, как клетки реорганизуют микротрубочки веретена, был получен после наблюдения того факта, что во время полимеризации тубулин переходит между фазами медленного роста, и фазами быстрого укорачивания. Это открытие было сделано Митчисоном и Киршнером в 1984 году и соответствующий тип поведения получил название динамической нестабильности (Mitchison and Kirschner, 1984). Переход же между этими состояниями роста и укорачивания осуществляется случайным образом. Переход от фазы роста к фазе быстрого укорачивания получил название катастрофа, а обратный переход - спасение. Эта модель поведения далее была подтверждена наблюдениями в режиме реального времени методами DIC микроскопии и темного поля (Walker et al., 1988; Horio and Hotani, 1986).
Полимеризуется только Т-тубулин, а получающийся в результате деполимеризации Д-тубулин не полимеризуется. ГТФ-азная активность свободного ГТФ-тубулина мала (Caplow and Shanks, 1990). При полимеризации необходимые аминокислоты, находящиеся на а субъединице присоединяющегося димера, подходят к ГТФ сайту /? мономера последнего тубулина в полимере, значительно облегчая гидролиз связанной с ним ГТФ (Nogales et ah, 1999). При этом вновь присоединившаяся к плюс концу молекула имеет р мономер на конце полимера, которому еще не хватает а мономера сверху, чтобы произвести гидролиз. Поэтому верхний тубулин находится в ГТФ-состоянии, в то время как большая часть трубки состоит из ГДФ-тубулина. Структурные данные поддерживают представления согласно которым если скорость гидролиза быстрее скорости роста полимера единственный ГТФ-слой молекул тубулина будет поддерживать полимер в фазе роста. Сродство ГТФ-тубулина к концу полимера велико: полимеризация происходит даже против сжимающих микротрубочку нагрузок (Inoue and Salmon, 1995), а деполимеризуется ГТФ-тубулин очень медленно. Критичным для понимания динамической нестабильности явилось наблюдение состоящее в том, что микротрубочки образованные из не гидролизуемого аналога ГТФ являются стабильными и не демонстрируют динамической нестабильности (Hyman et al., 1992). Проблема нестабильности решается посредством гидролиза ГТФ -большая часть микротрубочки состоит из ГДФ-тубулина и является крайне не стабильной. Небольшой же слой тубулина на самом ее конце еще не успевший гидролизовать молекулы ГТФ является очень стабильным и удерживает весь полимер от разрушения. Потеря так называемой ГТФ-шапки - того самого небольшого слоя Т-тубулина приводит к деполимеризации. Это модель качественно объясняющая динамическую нестабильность получила название «модель ГТФ шапки» (Mitchison and Kirschner, 1984). Теоретически размер шапки может быть как крайне малым - один слой тубулина, так и достаточно большим - сотни слоев. Ряд экспериментов свидетельствует, что скорее верно первое предположение (Caplow and Shanks, 1996).
Описание потенциалов продольных взаимодействий
Продольные связи значительно сильнее поперечных взаимодействий между протофиламентами. Это утверждение основано на известном пути разборки микротрубочки, структурных данных, а так же на сделанных теоретических оценках. Поэтому для описания продольного взаимодействия мы выбрали нерастяжимые и неразрывные связи. Здесь В - параметр характеризующий жесткость продольных связей, которую мы предполагаем одинаковой для Т и Д форм тубулина. Значение равновесного угла х0 может быть оценено из стурктурных данных (Muller Reichert et al., 1998). Для двух молекул ГДФ тубулина угол jfwO.4. Основываясь на данных для ГТФ тубулина этот угол может быть крайне мал (Hyman et al., 1995, Mandelkow et al., 1991). Его верхний предел может быть аппроксимирован исходя из данных для GMPCPP тубулина (не гидролизуемый аналог ГТФ). Таким образом 0 jj 0.2, и кроме случаем отмеченных особо мы полагали zl =0-2. В результате гидролиза ГТФ большая часть конформационных изменений должна происходить в J3 субъединице (Nogales et al., 1999), логично, следовательно, предположить, что для данной пары димеров равновесный угол определяется нижним димером, тем, который взаимодействует чере свой р мономер. Получается, что возможны только два типа продольных взаимодействий: gD(z) и g1(z) в зависимости от того, какой димер находится внизу и вне зависимости от верхнего димера. 2.3 Описание латеральных взаимодействий Для того чтобы описать закручивание протофиламента с последующим разрывом латеральных связей мы взяли для описания латеральных связей потенциал, описывающий типичную форму белок белкового взаимодействия (Jiang et al., 2002). v() = 2exp(-cf/0, ї = г-р О) r0 - параметр характеризующий длину латеральной связи. f характеризует отклонение димера от положения равновесия (подробнее в приложении). А характеризует жесткость латеральной связи. Для небольших положительных энергия латерального взаимодействия возрастает квадратично в то время как для 0 возникает сильная отталкивающая сила. При % = 2г0 потенциал достигает максимума, где г0 выбрано характерным расстоянием белок белкового взаимодействия 1.2 A (Jiang et al., 2002). Для 2г0 потенциал быстро падает. Следует заметить, что для типичного потенциала взаимодействия значение при = 0 как правило меньше нуля. В то время как для полимеризации МТ значение энергии при = 0 вероятно больше нуля (Johnson and Borisy, 1979). Поскольку точно это не известно мы произвели вычисления для разных типов потенциальных ям.
Первая часть уравнения 4b содержит сумму потенциальных энергий продольных взаимодействий между димерами в протофиламенте ; . Вторая часть - это сумма взаимодействий между всеми латеральными контактами /-ого с i+1-ым протофиламентом. Если каждый протофиламент содержит N димеров, то первое слагаемое в 4Ь имеет N членов, в то время как второе слагаемое имеет 2N членов, для всех ПФ кроме 13-ого. Из-за спиральности МТ на конце 13-ого ПФ 3 верхних мономера имеют латеральные связи только с одной стороны. Используя потенциалы (2) и (3) полную потенциальную энергию можно записать в виде: U(l) = B"{\/2-(zk-Zo 2 + о ехр(-гп/г0) + Гаа0 2ехр(-гк2/г0)}, (5).
Равновесное состояние микротрубочки находилось минимизацией полной потенциальной энергии сразу по всем переменным одной из вариаций метода сопряженных градиентов. Параметр В не влияет на устойчивую конформацию, но становится важен для вычисления абсолютных значений энергии.
Отношение А/В характеризует относительную силу латеральных связей. Чтобы упростить его интерпретацию мы нормировали этот параметр на а0, где а0 минимальное значение этого коэффициента при котором трубка состоящая полностью из Д-тубулина еще является устойчивой. При а меньших а0 сил латеральных связей не достаточно чтобы удержать протофиламенты от скручивания и конформации соответствующей выпрямленной трубке не существует. Параметр у был введен для того, чтобы исследовать возможный эффект ослабления связей между /? -мономерами в результате гидролиза ГТФ (Nogales et al., 1999). В модели у = \ означает, что сила связи не меняется, а у \ соответствует ослаблению латеральной /? связи. Для простоты мы полагаем, что сила а-а связи никогда не меняется и равна силе /?-/? для Т-тубулина. На самом деле для расчетов мы использовали две пары взаимодействующих точек вместо одной. Более подробное рассмотрение можно найти в приложении ПЗ.
Помимо спиральной микротрубочки мы так же исследовали модель описывающую микротрубочку типа 13 0, т.е. микротрубочку у которой отсутствует спиральность. В такой МТ все протофиламенты строго симметричны (вк не зависит от /"), и потенциальная энергия зависит только от N переменных. Это значительно упрощает расчеты и позволяет провести некоторые аналитические оценки, т.к. можно рассматривать один единственный протофиламент. Мы пользовались этой моделью для начального анализа, но все выводы были протом проверены на полной модели спиральной микротрубочки.
Изгибающийся протофиламент может совершать механическую работу. Например, микротрубочка может быть обхвачена некоторым кольцом, которое может по ней скользить (Hill, 1982; Koshland et al., 1988). Как было упомянуть в трубке 13_0 все протофиламенты идентичны, и можно расчитать силу, которую может развить единичный протофиламент в точке находящейся на некотором расстоянии w от его поверхности. В этом случае движение протофиламента ограничено: он будет изгибатся до тех пор, пока некоторая точка на его поверхности не коснется кольца, или в нашем плоском случае, не окажется на расстоянии w от его оси .
Линеаризация уравнений основной модели
Рассмотрим микротрубочку, спиралыюсть у которой отсутствует: протофиламенты в такой микротрубочке размещены без сдвига. Это дает полную осевую симметрию и такую микротрубочку намного удобнее рассматривать аналитически. Поскольку все точки латерального взаимодействия между димерами находятся на одном уровне, координату z можно вообще не рассматривать. Благодаря осевой симметрии силы, действующие на один протофламент, будут всегда лежать в плоскости этого протофиламента. Это позволяет рассматривать задачу в которой в 13 раз меньше переменных. При этом численно легко проверить, и это было нами сделано, что качественно все основные результаты одинаковы для моделей микротрубочек со спиралыюстыо и без.
Таким образом, от рассмотрения трубки из тринадцати протофиламентов мы переходим в силу симметрии к рассмотрению всего одного протофиламента. Эти модели трубки без спиральности и одного протофиламента будут совершенно идентичны при согласовании констант потенциала таким образом, чтобы на один протофиламент действовала такая же сила, которая действует на один протофиламент в стенке микротрубочки.
Для однородной трубки все Хо к равны нулю и правая часть обращается в ноль. Отсюда следует, что имеет место полная компенсация моментов выгибающих сил, действующих на димер со стороны соседей в одном протофиламенте. Более того, момент выгибающих сил действующих на димер зависит только от ближайших соседей (включает только члены с номерами к, {к+\) и ( +2)), т.е. взаимодействие является локальным. Для не однородной трубки правая часть может иметь как положительное, так и отрицательное значение.
Из уравнений (13) следуют основные свойства, которыми микротрубочка обладает в нашей модели. Для однородной трубки, в которой правые части равны нулю отличными от нуля будут только решения вблизи свободного конца там. При этом в силу локальности уравнений все qk обратятся практически в ноль уже для к N - 3. Из этого следует независимость формы и свойств конца микротрубочки от ее длины.
Установка для измерения силы развиваемой деполимеризующейся микротрубочкой под названием «лазерный пинцет» основана на флуоресцентном микроскопе ZEISS AxioPlan 2, оборудованного так же для DIC микроскопии, и двух лазерах: собственно ловушки и второй лазер для независимого определения положения шарика в первом луче. Схема всей установки приведена на рис. 7А.
Длины волн лазеров выбраны стандартным образом так, чтобы избежать полос поглощения основных биологических молекул, а так же флуоресцентных красителей. Для создания ловушки мы использовали лазерный луч с длиной волны 1064 нм испускаемый лазером Nd:YV04, (модель BL-106C Spectra Physics). Такой лазер может генерировать излучение мощностью до 5 Вт, и обеспечивать удерживающие силы до 100 пН. Свет от этого лазера проходит через расширитель луча (рис. 7А), аттенюатор и попадает на акусто-оптические дефлекторы (см. ниже). Аттенюатор представляет собой среду, поворачивающую плоскость поляризации, расположенную между двумя поляризационными кубиками. Вращение плоскости поляризации зависит от поданного на нее внешнего напряжения и вся конструкция в целом позволяет получить два ортогонально поляризованных луча на выходе, интенсивности, которых связаны, но регулируются приложенным к аттенюатору напряжением. Один из этих лучей идет через АОД, а другой в обход. Акусто-оптический дефлектор (АОД) представляет собой активную среду, в которой образуется стоячая акустическая волна определенной частоты благодаря поданному на него напряжению. Лазерный луч интерферирует на узлах волны как на дифракционной решетке.
После прохождения через второй, перпендикулярно расположенный АОД мы пользуемся лучом образованным двумя первыми порядками мощность которого достигает 40 - 50-ти процентов входного луча. Частота подаваемого на АОД напряжения контролируется с помощью компьютера в режиме реального времени. Благодаря этому углом, под которым из АОД выходит нужный нам луч, мы можем управлять. В принципе АОД работают очень быстро (время ответа несколько микросекунд), но в нашем случае время зависит от оборудования и программного обеспечения и составляет около 1 мс. Выходная апертура АОД оптически сопряжена с входной апертурой объектива (на Рис. 7А оптически сопряженные точки обозначены звездочками). Благодаря этому свойству луч всегда приходит точно в центр объектива, в то время как угол его падения зависит от угла под которым он выходит из АОД. Это позволяет управлять горизонтальным положением ловушки в плоскости поля зрения. Мощность же ее остается неизменной, т.к. общее количество света, которое попадает в объектив не меняется.
Следующий за АОД поляризационный куб соединяет обратно перпендикулярно поляризованные лучи так, что дальше они везде идут вместе. Сделано это для того, чтобы во-первых была возможность иметь две ловушки, а во-вторых для некоторых экспериментов необходима большая мощность для того, чтобы достать шарик со дна камеры, а затем провести эксперимент в луче уже меньшей мощности, но управляемом АОД. На следующем за этим зеркале луч, образующий ловушку объединяется с лучом лазера служащего для определения положения шарика. Для этого мы использовали гораздо менее мощный лазер с длиной волны 780 нм (Optics for Research, 10 мВт выходная мощность). При помощи дихроического зеркала отражающего длины волн более 700 нм, лазерные лучи совмещаются с оптической осью микроскопа. При этом зеркало в оптической оси микроскопа находится после дихроических кубиков и фильтров так, что введение лазеров не сказывается на использовании эпифлуоресценции.
Держатель предметного стекла был переделан таким образом, чтобы включить пьезоэлектрическую подставку при помощи которой положением столика можно управлять с компьютера с нанометровой точностью в пределах 100x100x20 мкм. Эта подставка находится на другой подставке, положением которой можно управлять более грубо при помощи джойстика. После того, как лазеры проходят через предметное стекло, свет собирается конденсером и другое аналогичное дихроичное зеркало отражает лазерные лучи на квадрантный детектор. Этот детектор устроен таким образом, что позволяет определять положение шарика микронного размера в лазерном луче с нанометровой точностью. Принцип работы детектора состоит в следующем. Детектор поделен на четыре сектора, которые выдают напряжение в зависимости от попадающего на них света независимо друг от друга. Свет лазерного луча служащего для определения положения шарика преломляется на его границе и дает дифракционную картину, которая при помощи дополнительной линзы фокусируется на квадрантном детекторе.
Баланс изгибающих сил в стенке микротрубочки
Сумма моментов изгибающих сил действующих на димер равна нулю, только в случае если все три димера имеют один и тот же тип (13). Если же внутрь стенки Д микротрубочки вставлен Т димер, это приведет к нарушению формы протофиламента, т.к. моменты сил, приложенные к концам димера, будут различны. Анализ сил показывает, что положение данного димера зависит только от ближайших соседей и не сказывается на положениях димерах отстоящих хоть сколько-нибудь далеко. Это приводит к тому, что неровность формы вызванная нарушением типа димера не будет распространяться далеко, а будет локализована в непосредственной его близости. Этот вывод был подтвержден расчетами для МТ, в которой слой Т димеров был вставлен в Д-стенку (рис. ЮС). Это приводит к небольшому искривлению, которое исчезает уже через несколько димеров и не распространяется далеко.
Суммарный изгибающий момент сил, действующих на последний димер всегда значителен, т.к. у него нет верхнего соседа, способного компенсировать момент приложенный со стороны нижнего димера. Это приводит к деформации конца микротрубочки. Его форма определяется величиной Т-шапки и ближайшими 2-Змя Д-слоями, как следует из локального характера взаимодействий, в теле МТ форма конца не зависит от ее общей длины. Когда размер ГТФ шапки относительно велик ( 5-6 слоев), ее центральная часть выпрямлена (рис. 10E,F). Искривление стенки получается только на границе ГТФ-ГДФ слоя и на кончике МТ.
Одним из факторов определяющих вид и величину деформации является равновесный угол xl (а так же Хо»но его значение известно точно, и мы его не варьируем). Когда xl - 0 кончик МТ является прямым, а деформация на стыке с ГДФ слоем больше, из-за большей разницы между равновесными углами Т и Д форм тубулина. Важно подчеркнуть, что как бы ни возрастали отклонения димеров они никогда не превышают характерного размера белок-белковых взаимодействий. Все описанные выше свойства могут быть перенесены на минус конец, т.к. основные характеристики их форм схожи, однако для того же набора параметров устойчивой МТ ее минус конец менее деформирован, чем плюс (см. ниже).
Мы использовали критическое значение параметра а - асг, характеризующее отношение латеральных и продольных взаимодействий, чтобы исследовать свойства стабильности МТ. Хотя отношение этих сил играет второстепенную роль для димеров находящихся в стенке микротрубочки, латеральные связи димеров кончика крайне важны. Нескомпенсированность изгибающих моментов на конце вызывает напряжение латеральных связей, и возникающие при этом силы удерживают МТ от катастрофы. При сильных связях, больших а, МТ устойчива. При меньших а МТ не устойчива. Критическое значение асг есть минимальное значение а, необходимое чтобы удержать МТ данного вида и состава от катастрофы. К примеру, конец МТ, состоящей полностью из ГДФ-тубулина стабилен, если а асг. Для удобства мы в дальнейшем нормируем а„ микротрубочек различного состава на асг полной Д трубки. Т.о. Яо-(Д) = 1. Концы микротрубочек различного состава характеризуются различными асг. Когда асг 1 такая МТ является более устойчивой, чем МТ состоящая полностью из ГДФ тубулина.
Используя описанный подход, мы исследовали стабильность микротрубочек с различными размерами ГТФ шапок и различными значениями набора параметров. Таких как величина равновесного угла xl и параметр ослабления Р -связи у. Таблица 1 содержит критические значения для МТ с различным размером ГТФ шапки. Добавление двух Т слоев к концу трубки значительно стабилизирует ее конец: асг падает в 2.4 раза. Это соответствует максимальной стабилизации и дальнейшее увеличение размеров шапки уже не приводит к увеличению стабильности (Таблица 1). Из двух слоев стабилизирующих плюс конец МТ более важным оказывается второй нижний слой. Для целого ряда параметров можно добиться такой же стабильности, стабилизировав МТ один Т и одним Д слоями (Таблица 1). Если последние слоя имеют смешанный состав, стабильность такой МТ промежуточная и уменьшается с увеличением содержания Д субъединиц. Все приведенные выводы не изменятся для МТ любой длинны, за исключением самых коротких ( 5-6 слоев).
Мы исследовали как уменьшение силы у?-связи повлияет на стабильность МТ различного состава. Десятикратное уменьшение жесткости Д-субъединиц не влияет на стабильность МТ имеющей 2Т шапку. Когда все латеральные связи одинаковы стабильности плюс и минус концов не отличаются (/ = 1). Однако добавление ГТФ шапки имеет различный эффект. Уже одного слоя ГТФ тубулина достаточно чтобы стабилизировать минус конец, в то время как для плюс конца требуется два (Таблица 1). Добавление дополнительных слоев на обоих концах практически не имеет никакого эффекта. Когда оба конца имеют более одного слоя Т тубулина, их стабильность тоже одинакова. В работе (Nogales et al., 1999) была предложена гипотеза согласно которой ГДФ тубулин имеет менее стабильные Р -связи. Ослабление р -связи для ГДФ тубулина дестабилизирует плюс конец, в то время как минус конец оказывается гораздо менее чувствительным к таким изменениям. Если Р -связь ГДФ тубулина ослабить в 10 раз относительные стабильности плюс и минус концов микротрубочки без ГТФ-шапки будут отличаться в 3 раза. Становиться возможной сценарий в котором минус конец не требует ГТФ шапки для его стабилизации, а плюс концу достаточно всего одного слоя ГТФ-тубулина. Это в то же время должно привести к увеличенной скорости деполимеризации плюс конца по сравнению с минус концом. Связано это с тем, что скорость деполимеризации в основном определяется распадом латеральных связей. Из-за асимметрии тубулинового димера можно ожидать, то скорость распада этих связей будет одинаковой для плюс и минус концов если у -1, и будет больше на плюс конце если у 1. Поскольку многочисленные эксперименты показывают, что наоборот минус конец деполимеризуется быстрее (Horio and Hotani, 1986; Walker et al., 1988; Tran et al., 1997b, Gildersleeve et al., 1992), мы заключили, что ослабление р -связь ГДФ тубулина по сравнению с ГТФ маловероятно.
Разницу между плюс и минус концами легко понять, рассмотрев баланс сил действующих на крайний димер. Поскольку дестабилизация, которая происходит из-за стремления димера выгнуться, определяется состоянием /?-мономера тубулина, равновесный угол между крайним и не крайним димерами определяется нижним из них. Т.е. для плюс конца выгибающий момент определяется димером расположенным ниже крайнего, в то время как для минус конца крайний димер сам же и определяет равновесный выгибающий угол.
Асимметрия становится еще более ярко выраженной если рассмотреть изменение сил р -связей ГДФ тубулина (Рис. 11). Для ГДФ трубки р мономер крайнего тубулина на плюс конце отстоит в 3 раза дальше от точки приложения выгибающего момента, которая находится с точке контакта тубулиновых димеров, чем таковой для минус конца. Когда латеральные силы р тубулинов уменьшены, основной вклад в удержание димеров дают связи между а мономерами. С ними имеет место аналогичная асимметрия. Момент удерживающей силы а мономера в 3 раза больше на минус конце. Это и есть теоретически максимальное отличие в стабильности двух концов привносимое ослаблением р связей. При этом р связь между ГДФ димерами должна быть потеряна полностью.
