Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Особенности развития патологического процесса у новорожденных, перенесших гипоксию 14
1.2. Особенности развития оксидативного стресса у новорожденных 16
1.3. Общая морфология, строение и функции эритроцита 19
1.4. Особенности молекулярной структуры мембраны эритроцита 20
1.4.1. Цитоскелет эритроцита 22
1.4.2. Липидный состав мембраны эритроцита 25
1.4.3. Проницаемость эритроцитов для молекул 28
1.5. Влияние активных форм кислорода на эритроциты в условиях развития гипоксии 31
1.6. Физико-химические и антиоксидантные свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 32
1.7. Окислительная модификация белков плазмы 36
1.8. Антибиотикотерапия в период новорожденности 39
1.9. Токсическое повреждение печени четыреххлористым углеродом как модель активации свободнорадикальных реакций 41
ГЛАВА 2. Объект и методы исследования 45
2.1. Объекты исследования 45
2.2. Получение суспензий эритроцитов 46
2.3. Физико-химические свойства модификаторов карбонильной природы 47
2.3.1. Физико-химические свойства ацетона 47
2.3.2. Физико-химические свойства формалина 48
2.3.3. Физико-химические свойства глутарового диальдегида 49
2.4. Структура и фармакологическая характеристика исследуемых антибиотиков 49
2.4.1. Фортум 50
2.4.2. Амикацин 51
2.4.3. Ципрофлоксацин 53
2.4.4. Ванкомицин 55
2.5. Автоматический метод регистрации осмотических и кислотных эритрограмм 58
2.6. Метод определения уровня окислительной модификации белков плазмы крови 59
2.7. Спектрофотометрический метод определения активности глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов 61
2.8. Подсчет количества эритроцитов крови 62
2.9. Моделирование интоксикации крыс четыреххлористым углеродом 62
2.10. Статистическая обработка экспериментальных данных 62
ГЛАВА 3. Осмотическая резистентность эритроцитов крови новорожденных в динамике постги-поксических осложнений 64
ГЛАВА 4. Интенсивность развития оксидативного стресса у новорожденных, перенесших гипоксию 82
ГЛАВА 5. Кислотная резистентность эритроцитов крови новорожденных, перенесших гипоксию 98
ГЛАВА 6. Активность глюкозо-6-фосфатдегидроге-назы эритроцитов новорожденных, перенесших гипоксию 114
ГЛАВА 7. Структурные свойства эритроцитов, модифицированных соединениями карбонильной природы 126
7.1 Структурные свойства эритроцитов, модифицированных глутаровым диальдегидом
7.1.1. Осмотическая резистентность эритроцитов в присутствии глутарового диальдегида 126
7.1.2. Кислотная резистентность эритроцитов в присутствии глутарового диальдегида 128
7.2. Структурные свойства эритроцитов, модифицированных формальдегидом 142
7.2.1. Осмотическая резистентность эритроцитов в присутствии формальдегида 142
7.2.2. Кислотная резистентность эритроцитов в присутствии формальдегида 143
7.3. Структурные свойства эритроцитов, модифицированных ацетоном 145
7.3.1. Осмотическая резистентность эритроцитов в присутствии ацетона 145
7.3.2. Кислотная резистентность эритроцитов в присутствии ацетона 146
ГЛАВА 8. Сравнительная оценка структурных свойств эритроцитов и активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в динамике развития токсического поражения печени крыс 152
8.1. Осмотическая резистентность эритроцитов в динамике развития токсического повреждения печени 152
8.2. Кислотная резистентность эритроцитов в динамике развития токсического повреждения печени 155
8.3. Активность глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов в динамике развития токсического повреждения печени 158
ГЛАВА 9. Структурные свойства эритроцитов, модифицированных антибиотиками различных классов 161
9.1. Структурные свойства эритроцитов, модифицированных фортумом 161
9.1.1. Осмотическая резистентность эритроцитов, модифицированных фортумом
9.1.2. Кислотная резистентность эритроцитов, модифицированных фортумом 164
9.1.3. Осмотическая резистентность эритроцитов, выделенных из крови, предварительно инкубированной с фортумом 166
9.1.4. Кислотная резистентность эритроцитов, выделенных из крови, предварительно инкубированной с фортумом 167
9.2. Структурные свойства эритроцитов, модифицированных амикацином 169
9.2.1. Осмотическая резистентность эритроцитов, модифицированных амикацином 169
9.2.1. Кислотная резистентность эритроцитов, модифицированных амикацином 174
9.2.3. Осмотическая резистентность эритроцитов, выделенных из крови, предварительно инкубированной с амикацином 174
9.2.4. Кислотная резистентность эритроцитов, выделенных из крови, предварительно инкубированной с амикацином 175
9.3. Структурные свойства эритроцитов, модифицированных ванкомицином 176
9.3.1. Осмотическая резистентность эритроцитов, модифицированных ванкомицином 176
9.3.2. Кислотная резистентность эритроцитов, модифицированных ванкомицином 179
9.3.3. Осмотическая резистентность эритроцитов, выделенных из крови, предварительно инкубированной с ванкомицином 179
9.3.4. Кислотная резистентность эритроцитов, выделенных из крови, предварительно инкубированной с ванкомицином 181
9.4. Структурные свойства эритроцитов, модифицированных ципрофлоксацином 182
9.4.1. Осмотическая резистентность эритроцитов, модифицированных ципрофлоксацином 182
9.4.2. Кислотная резистентность эритроцитов, модифицированных ципрофлоксацином 182
9.4.3. Осмотическая резистентность эритроцитов, выделенных из крови, предварительно инкубированной с ципрофлоксацином 184
9.4.4. Кислотная резистентность эритроцитов, выделенных из крови, предварительно инкубированной с ципрофлоксацином 185
Заключение 187
Выводы 192
Литература 194
- Общая морфология, строение и функции эритроцита
- Физико-химические свойства модификаторов карбонильной природы
- Метод определения уровня окислительной модификации белков плазмы крови
- Осмотическая резистентность эритроцитов в присутствии глутарового диальдегида
Введение к работе
Актуальность работы. Ежегодно в мире умирает более 5 млн новорожденных. В России причиной 40% летальных исходов является внутрима-точная гипоксия и асфиксия в родах [104]. Гипоксическое поражение плода и новорожденного создаёт предпосылки для высокой заболеваемости и инва-лидизации детей раннего возраста [105,106].
С целью снижения частоты и тяжести осложнений, вызванных гипоксией в неонатальный период, актуальной является разработка и внедрение в клиническую практику методов ранней адекватной оценки тяжести состояния ребенка. Наибольший интерес при этом представляет изучение последствий окислительных процессов, активирующихся при гипоксии [51, 148] и вызывающих нарушение молекулярной организации биомембран. Структурные перестройки последних являются эффективным механизмом как стрессовой, так и строго специфической регуляции самых разнообразных процессов в норме и при патогенезе различной этиологии [109].
Мембрана эритроцита - наиболее удачная биологическая модель для изучения динамики нарушений, протекающих в организме при развитии патологии. Эритроциты участвуют в приспособлении организма человека и животных к условиям внешней среды. Они не только транспортируют кислород, необходимый для протекания окислительно-восстановительных реакций в клетках и тканях, но и обеспечивают целенаправленный отклик организма на действие внешних и внутренних факторов. Кроме того, метаболические процессы, протекающие в эритроцитах при стрессе и клинической патологии, являются интегральным отражением реакции клеток на уровне всего организма [130, 134].
С целью изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования повреждений клеточных мембран в условиях развития оксидатив-ного стресса, нами были исследованы структурные свойства эритроцитов, активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в динамике заболеваний ново рожденных при различной интенсивности реакций свободнорадикального окисления, вызванных гипоксией. На модельной системе проведена серия опытов по определению вклада различных химических агентов (карбонильных продуктов пероксидного окисления липидов, некоторых антибактериальных препаратов) в процесс модификации мембранных структур при патологии.
Научная новизна. Проведен сравнительный анализ изменения структурных свойств эритроцитов, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и уровня оксидативного стресса у новорожденных в динамике постгипоксиче-ских осложнений. Впервые выявлено наличие скрытых структурных повреждений в эритроцитах при гипоксии. Установлено, что глубина формирования дефектных областей в мембране определяется интенсивностью развития реакций свободнорадикального окисления. Показана химическая модификация белковых компонентов эритроцита и плазмы крови у новорожденных в динамике критического состояния. Впервые установлено, что основной вклад в нарушение композитной организации белково-липидного каркаса мембраны при оксидативном стрессе вносят не карбонильные продукты пероксидного окисления липидов (кетоны, альдегиды), а активные формы кислорода. Установлено, что метаболиты карбонильной природы химически модифицируют белковые структуры: описаны реакции возможных типов комплексирования между ними. Установлено, что антибиотики различных классов (амикацин, фортум, ципрофлоксацин, ванкомицин) проявляют высокое сродство к мембранам низкостойкой субпопуляции эритроцитов и структурным белкам.
Практическая значимость. Полученные данные позволяют расширить и углубить фундаментальные представления о механизме повреждения мембран соматических клеток организма при оксидативном стрессе. Исследование начальных этапов развития патологии на клеточном уровне дает возможность в дальнейшем осуществить раннюю диагностику заболевания, а также купировать его на первых этапах развития. Это позволит снизить риск инвалидизации и смертности, в частности, новорожденных детей и повысить качество и эффективность интенсивной терапии. Определение мембрано-тропности антибиотиков, активно применяемых при лечении инфекционной патологии у новорожденных, позволит изучить механизмы влияния данных препаратов на соматические клетки организма. Это даст возможность разработать более эффективную схему лечения пациентов с минимальным риском побочных эффектов от приема антибиотиков. Материалы работы используются при проведении практикумов, выполнении курсовых и дипломных работ студентами Воронежского государственного университета.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение молекулярных механизмов структурных свойств эритроцитов крови новорожденных, перенесших гипоксию.
Для реализации данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Выявить взаимосвязь между структурными свойствами эритроцитов и активностью их антиоксидантной защиты при различной интенсивности развития оксидативного стресса у новорожденных в динамике постгипокси-ческих осложнений.
2. Провести сравнительный анализ между изменениями структурных свойств эритроцитов при различных условиях функционирования их антиоксидантной системы, уровнем оксидативного стресса и клинико-лабораторными показателями крови, а также тяжестью патологии новорожденных в динамике критического состояния.
3. Оценить вклад карбонильных продуктов пероксидного окисления липидов и активных форм кислорода в изменение структурных свойств эритроцитов в условиях интенсификации реакций свободнорадикального окисления в организме.
4. Изучить влияние препаратов антибактериальной терапии новорожденных на структурно-функциональные свойства эритроцитарных мембран.
5. Разработать схему молекулярных механизмов изменения структурных свойств эритроцитов в условиях развития оксидативного стресса.
Апробация работы. Основные результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, представлены на III Конгрессе педиатров-нефрологов России (Санкт-Петербург, 2003); III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2003); II Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2005» (Москва, 2005); 5-ом Мировом конгрессе по заботе при критических состояниях в педиатрии (5h World Congress on Pediatric Critical Care, Geneva, 2007); ежегодной Научной сессии преподавателей и сотрудников Воронежского государственного университета (Воронеж, 2004, 2005).
Публикации. Основные результаты диссертационной работы изложены в 7 публикациях - в 3 статьях и 4 тезисах.
На защиту выносятся следующие положения
1. При оксидативном стрессе, вызванном гипоксией у новорожденных, происходит формирование скрытых структурных повреждений в мембранах эритроцитарных клеток.
2. На модельной системе «эритроцит-модификатор» установлено, что метаболиты карбонильной природы, образующиеся в результате перок-сидного окисления липидов, не играют определяющей роли в формировании структурных повреждений эритроцитов новорожденных в динамике постги-поксических осложнений: основной вклад в образование дефектов мембраны при оксидативном стрессе вносят активные формы кислорода.
3. В динамике постгипоксических осложнений у новорожденных выявлено, что количество эритроцитов, имеющих структурные повреждения, и их глубина определяются интенсивностью и продолжительностью развития оксидативного стресса в организме, а также активностью антиоксидантнои системы.
4. Антибиотики (амикацин, фортум, ципрофлоксацин, ванкомицин) проявляют различный по выраженности и пролонгированности гемолитический эффект и вступают в реакции химического взаимодействия с белками мембраны эритроцита.
5. Предложена схема событий, отражающих возможные механизмы изменения структурных свойств эритроцитов при развитии оксидативного стресса у новорожденных в условиях гипоксии.
Структура и объем работы. Диссертация представлена на 250 страницах текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и обсуждения полученных результатов (9 глав), заключения, выводов, списка литературы и приложения. Иллюстративный материал включает 45 рисунков и 2 таблиц. В приложении содержатся 17 рисунков и 6 таблиц.
Общая морфология, строение и функции эритроцита
Эритроцит - специализированная клетка периферической крови, обеспечивающая доставку кислорода от легочных альвеол ко всем клеткам тела и углекислоты от клеток к легким. Это обеспечивает содержащийся в эритроците гемоглобин (до 640 млн. молекул в каждой клетке), карбоангидроза, 2,3-дифосфоглицерат (2,3-ДФГ), а также АТР и ADP [91].
Количество эритроцитов составляет 4,5-6,5-10 /л у мужчин и 3,9-5,6-Ю12/ л крови у женщин. Продолжительность жизни эритроцитов ров няется 120 ± 10 суткам. Основную массу крови человека (66%) составляют эритроциты двояковогнутой формы - дискоциты, 18,5% приходится на сто-матоциты (куполообразные клетки), 5,7% - на эхиноциты (шиловидные), 4,2%о - на сфероциты (шаровидные) и некоторые другие. При заболеваниях могут появляться аномальные формы эритроцитов [16,150].
Дискоцит имеет средний диаметр 7,5 мкм (в плазме крови - 8,4 мкм), площадь поверхности -163 мкм и средний объем - 86,1 мкм . 75% эритроцитов являются нормоцитами (диаметр от 7,0 до 8,0 мкм), 15,5% - микроцитами (диаметр от 5,7 до 7,0 мкм), 16,5% - макроцитами (диаметр от 8,0 до 9,15 мкм [16, 157]. Форма двояковогнутого диска обеспечивает высокое отношение площади его поверхности к объему и способствует максимально быстрому газообмену [147, 156]. При старении эритроцитов уменьшается их объем, площадь поверхности, увеличивается внутриклеточная вязкость и плотность, что снижает их деформируемость [227].
Зрелый эритроцит не содержит ядра и органелл. В норме в крови циркулируют от 2 до 10% ретикулоцитов - безъядерные клетки, образующиеся на последнем этапе созревания эритроцитов. Они содержат митохондрии, рибосомы, эндоплазматическии ретикулум (ЭПР); созревают в кровотоке за 24-30 ч [16].
Мембрана эритроцита представляет собой композитную структуру, основой которой является липидный бислой, пронизываемый интегральными белками, связанными с белковой сетью цитоскелета, локализованного на цито-плазматической поверхности липидного бислоя. Мембрана осуществляет координацию работы клетки в зависимости от физических и химических сигналов, поступающих к ней в организме [219] и позволяет эритроциту транспортировать кислород с минимальным расходом энергии [68]. Показано наличие в эритроцитах газовых полостей, имеющих общебиологическое значение [123].
Наружный слой мембраны эритроцитов образован гликопротеидами и содержит разветвленные комплексы олигосахаридов (рис. 1), представляющие собой антигенные детерминанты группы крови; участки, связывающие патогенные вирусы; рецепторные участки для связывания конканавалина А и лектинов [152].
Групповые антигены эритроцитов выполняю! и различные биологические функции: рецепторную (для хемокинов, экзогенных лигандов, паразитов, микробов), транспортную (аквапорины, транспортеры глюкозы, нуклео-зидов, мочевины и др.), структурную, регуляторную {адгезивные молекулы, ферменты), активации комплемента (CD35,CD55,CD59 и др.) [10]. ] - липидный бислой; 2 - интегральные белки; 3 - микрофиламенты; 4 -микротрубочки; 5 - элементы спектриновой сети; 6 - коммутационные белки; 7 - гликопротеиды экстраклеточного матрикса; 8 - зоны аннулярного липида.
Гликопрогеиды обусловливают определенный заряд мембраны [152]. На поверхности эритроцитарной клетки имеются центры специфического связывания биологически активных веществ, таких как инсулин, ацетилхо лин, Р-адренергические агенты, простагландины [70]. Эритроцитарная мембрана не содержит опиатных рецепторов [100].
Эритроциты отличаются высоким содержанием белка (отношение ли-пид/белок (по массе сухого вещества) составляет 0,75) [44]. На долю углеводов может приходиться около 10% массы мембран, при этом они всегда входят в состав гликолипидов или гликопротеинов [152].
В эритроцитах человека обнаружено более 100 различных белковых структур, обладающих ферментативной активностью [34]. На внешней стороне мембраны эритроцитов располагаются ферменты: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (Г-З-ФД) и ацетилхолинэстераза, активность которых зависит от структурного состояния мембраны [117]. В эритроцитах выявлено наличие различных протеинкиназ [181, 188, 232, 203, 233], четырех изофер-ментов гуанилаткиназы, лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и цитохромы в5.[18].
Г-З-ФД, транскетолаза, изоцитратдегидрогеназа и сукцинатдегидроге-наза связаны с интегральным белком полосы 3, который модулирует активность комплекса ферментов гликолиза на внутренней поверхности мембраны [80]. Липидный матрикс и белковая сеть цитоскелета определяют упругость мембран эритроцитов при их деформациях [132].
Физико-химические свойства модификаторов карбонильной природы
В современной литературе основной вклад в нарушение структурной организации клеточных мембран отводят промежуточным и конечным продуктам ПОЛ [133, 155]. Для исследования возможного вклада карбонильных продуктов ПОЛ в модификацию структурных компонентов клеточных мембран на модельной системе «эритроцит - модификатор» нами было проведено изучение влияния гомологов продуктов ПОЛ - ацетона, формальдегида, глутарового ди-альдегида на осмотическую и кислотную резистентность эритроцитов крови человека.
Исследуемые соединения в работе применяли в широком диапазоне концентраций, величины которых на порядок были выше или ниже их физиологического содержания в организме.
Ацетон - летучая бесцветная жидкость со своеобразным запахом: он имеет tnjl=(-94,6) С и tKHn=56,l С; молекулярную массу - 58,08 Da (рис. 5). Смешивается с водой и органическими растворителями, например, эфиром, метанолом, этанолом, сложными эфирами [140].
Ацетон обладает всеми химическими свойствами, характерными для алифатических кетонов. Только сильные окислители, такие как щелочной рас твор КМп04 и хромовая кислота, окисляют ацетон до уксусной и муравьиной кислот и далее - до СОг и воды [70].
Ацетон при вдыхании накапливается в организме. Так как он выводится из организма медленно, возможны хронические отравления. Предельно допустимая концентрация ацетона - 200 мг/м3 [131]. Ацетон образуется в организме при оксидативном стрессе в качестве одного из продуктов ПОЛ.
Формалин (формоль), водный раствор формальдегида (40-50%), содержащий около 1% метанола (ингибитор полимеризации формальдегида). Формалин - бесцветная жидкость с характерным острым запахом. рН 2,8-4,0, р=1,1109-1,0764 кг/м3 (при 18 С). Формалин- источник формальдегида (рис. 6), который имеет молекулярную массу 30,3 Da [140].
Формалин токсичен, вызывает дегенеративные процессы в паренхиматозных органах, сильно действует на нервную систему. В организме превращается в метанол и муравьиную кислоту. В то же время считается, что формальдегид быстро окисляется в организме до СОг (на 70-80%) [41].
Глутаровый диальдегид (ГДА) является бифункциональным поперечно-сшивающим агентом (рис. 7). Коммерческие водные растворы ГДА (2%) при рН 3 содержат глутаровый альдегид, полуацеталь и полимеры ГДА [140]. Последний - бесцветная жидкость с характерным острым запахом, хорошо растворим в воде и спирте, молекулярная масса - 100 Da; имеет 1пл=14 С, 1кип=188 С (с последующем разложением), р=0,72 г/см3 [69].
В связи с тем, что инфекционная патология является ведущей причиной заболеваемости и смертности новорожденных в России и во всем мире, и антибиотики являются одними из наиболее назначаемых медикаментов больным детям, необходимым представляется изучение влияния антимикробных препаратов на соматические клетки организма с целью снижения частоты и тяжести вызываемых ими побочных эффектов [55].
В нашей работе проведено исследование структурной организации клеточных мембран и ее компонентов в присутствии таких антимикробных препаратов как фортум, амикацин, ципрофлоксацин и ванкомицин. Выбор данных антибиотиков обусловлен их активным использованием в педиатрической практике для лечения инфекционных заболеваний у новорожденных детей. В связи с этим возникла необходимость более детальной оценки потенциальной токсичности данных антибиотиков в отношении эукариотических клеток орга низма.
Метод определения уровня окислительной модификации белков плазмы крови
Принцип метода заключается в фотометрической регистрации процесса гемолиза эритроцитов. Кинетические кривые (эритрограммы) являются графическим отражением последовательного вступления клеток различной степени стойкости в стадию гемолиза [35]. Установка для регистрации эритрограмм включает следующие блоки: 1. Оптический (фотоэлектроколориметр ФЭК-56М со встроенным дифференциальным усилителем или КФК-2МП); 2. Регистрирующий (двухкоординатный регистратор ЛКД4-003 и цифровой вольтметр типа В7-20); 3. Термостатирующий (ультратермостат UTU-6).
Гемолиз эритроцитов проводят в термостатируемых кюветах с наружными размерами 20 х 40 х 10 мм и рабочим объёмом 5 мл. Измерение величин свето-пропускания осуществляют при длине волны А,=490 нм, т.к. в этой области спектра коэффициент молярной экстинкции водных растворов НЬ02 минимален [114]. При проведении гемолиза эритроцитов в одной кювете установка регистрирует интегральную кривую, форма которой отражает суммарное изменение величины светорассеяния (т, %) в исследуемом растворе во времени. Метод регистрации кинетических кривых позволяет оценивать структурное состояние эритроцитов по следующим параметрам: t лат - время латентного периода гемолиза (с, мин.); Ктах - константа максимальной скорости гемолиза; 0Сф- относительное количество сфероцитов (%); G - относительное количество гемолизированных клеток (%). С целью выявления скрытых структурных превращений в эритроцитах изучали кинетику гипоосмотического гемолиза при 0,55% концентрации NaCl, что соответствует точке критической резистентности для клеток контроля.
Кинетику кислотного гемолиза эритроцитов, позволяющую оценить величину гидрофобного барьера проницаемости белковых компонентов мембраны, регистрировали после добавления в рабочую кювету с 5 мл суспензии эритроцитов 100 мкл кислоты (0,1н НС1) (рис. 12).
Для исследования интенсивности свободнорадикальных процессов в плазме крови новорожденных оценивали спонтанную окислительную модификацию белков по методу Reznick A.Z. et al. [236] с некоторыми нашими изменениями. Метод основан на взаимодействии окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) с образованием 2,4-динитрофенилгидразонов.
Для регистрации спонтанной окислительной модификации белков 200 мкл плазмы инкубировали при 37 С в течение 15 мин. В пробы прибавляли 800 мкл 10 мМ 2,4-ДНФГ в 2 М НС1 и инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 1 часа, последовательно перемешивая реагенты каждые 15 мин. Затем в пробы добавляли по 2 мл холодной 20% ТХУ для осаждения белка и помещали на холод на 15 минут. После этого пробы центрифугировали 15 минут при 3000 об/мин для формирования белкового осадка. Супернатант удаляли. Осадок белка дополнительно промывали 4 мл 10% ТХУ и центрифугировали
Для экстракции липидов и удаления 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных белков, осадки механически разрушали, промывали 3 раза 4 мл смеси этанол: этилацетат (1:1). Полученный осадок высушивали для удаления растворителей и затем растворяли в 8 М мочевине. Мочевину приливали к осадку в объеме 4,0 мл. Для лучшего растворения пробы инкубировали на водяной бане при 37 С с постоянным перемешиванием. Нерастворившиеся остатки веществ удаляли дополнительным центрифугированием.
Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрировали на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 370 нм. Содержание карбонильных групп (нМоль) рассчитывали с использованием коэффициента молярной экстинкции \ - 22,000 см 1-М"1. Поскольку 10-15%) белка теряется на всех этапах промывания, для определения фактического уровня карбонильных групп найденные значения пересчитывали в нМоль/мг белка. Содержание последнего определяли Биуретовым методом [131]. Концентрацию его определяли калибровочным методом с использованием лиофилизированного бычьего сывороточного альбумина, растворенного в 8 М мочевине. Степень окислительной модификации белков выражали в единицах оптической плотности, отнесенных на 1 г белка или 1 мл плазмы.
Осмотическая резистентность эритроцитов в присутствии глутарового диальдегида
Таким образом, результаты проведенных нами исследований осмотической резистентности эритроцитов новорожденных, перенесших гипоксию, позволили установить не только повышение числа гемолизированных эритроцитов относительно контроля (что согласуется с литературными данными [9, 130, 209]), но и наличие скрытых нарушений структурных компонентов мембраны, которые формируются на ранних этапах повреждения клетки и являются первичным признаком дисбаланса в системе СРО-АОЗ. Это обусловливает необходимость внедрения в клиническую практику методов, позволяющих выявлять скрытые изменения биомолекул в условиях развития ОС для прогнозирования и своевременной оценки исхода патологии.
У новорожденных II группы, напротив, в динамике постгипоксических осложнений установлено повышение гипоосмотической резистентности различных по стойкости субпопуляций эритроцитов; уменьшается число низко- и среднестойких клеток, имеющих скрытые структурные повреждения, на 12% и 10% соответственно (рис. 13, 14). Наряду с этим понижается начальная скорость распада эритроцитов в 0,55% растворе NaCl, свидетельствующая об уменьшении количества эритроцитов низкостойкой субпопуляции. На это указывает снижение в 1,5 раза значения Ктах гипоосмотического гемолиза эритроцитов в динамике патологии новорожденных II группы (табл. 2). Аутогемоли-тическая стойкость эритроцитов при этом также повышается на 6% (рис. 15).
Полученные данные свидетельствуют о сокращении числа эритроцитов, имеющих повреждения структурных биомолекул, в крови новорожденных II группы в динамике интенсивной терапии. Это может являться следствием компенсаторного эритропоэза вследствие гипоксии, при котором в кровяное русло выбрасываются молодые, более высокостойкие клетки, а старые разрушаются [5]. Кроме того, возможна химическая модификация компонентов эритроци-тарной мембраны продуктами ПОЛ, в частности, МДА, выступающем в роли бифункционального сшивающего реагента для белков [50]. Образующиеся при этом сшивки белковых молекул могут вызывать повышение осмотической резистентности эритроцитов. Данный эффект описан нами в главе 7.
Сравнительный анализ осмотической резистентности эритроцитов и клинико-лабораторных показателей крови новорожденных в динамике патологии не выявил наличия выраженной зависимости между числом эритроцитов, имеющих скрытые повреждения, и содержанием определенных типов иммунных клеток в крови детей (как и в I группе больных). Так, значения G и Gmax понижались одновременно с уменьшением или увеличением числа лейкоцитов и лимфоцитов крови в динамике патологии (табл. 3, 4 «Приложения»). Количество моноцитов при этом незначительно увеличивалось и лишь у пациента Фрол.2 уменьшалось. Однако между изменением содержания гемоглобина, числом эритроцитов крови и величинами G и Gmax установлена отчетливая в-заимосвязь.
Сравнительный анализ заболеваний пациентов I и II групп показал, что существенных различий в этиологии и патогенезе патологий новорожденных данных групп нет. Возможно, направление реакции эритрона в ответ на развитие гипоксии зависит от тяжести патологии, длительности развития (острая, хроническая), а также определяется индивидуальными компенсаторными возможностями организма ребенка, в частности АО статусом.
III группу составили новорожденные с различной направленностью изменения осмотической резистентности низкостойких эритроцитов по сравнению со средне- и высокостойкими в динамике патологии. Так, у больных регистрировали снижение с 15 до 8% числа эритроцитов низкостойкой субпопуляции, имеющих скрытые структурные повреждения (рис. 13). Параллельно с этим уменьшается скорость гипоосмотического гемолиза эритроцитов, а, следовательно, и снижается степень структурной однородности вследствие сокращения числа низкостойких клеток в крови детей. На это указывает уменьшение значений величин Ктах в 2,5 раза в динамике постгипоксических осложнений (табл. 2).
При изучении гипоосмотической резистентности средне- и более высокостойких эритроцитов в динамике патологического процесса новорожденных было показано, что данные клетки, напротив, характеризуются понижением осмотической стойкости: значение величины Gmax увеличивается в среднем на 15% (рис. 14). Изменений аутогемолитической резистентности эритроцитов не зарегистрировано (рис. 15). Следовательно, в эритроцитах крови новорожденных III группы формируются менее глубокие изменения структурных компонентов мембраны по сравнению с таковыми пациентов первых двух групп. Это можно объяснить более высокими регуляторными возможностями организма, которые позволяют блокировать на различных стадиях неконтролируемое развитие патологии, а, значит, определять интенсивность повреждения эритроци-тарных мембран при гипоксии.
Сравнительный анализ гипоосмотического гемолиза эритроцитов по основным параметрам и клинико-лабораторных показателей крови новорожденных позволил установить взаимосвязь между изменением значений G и Gmax, а также уровнем гемоглобина, содержанием эритроцитов и иммунных клеток в крови детей в динамике их пребывания в ОРИТ. Так, параллельно с повышением гипоосмотической резистентности эритроцитов уменьшается содержание моноцитов, уровень гемоглобина и количество эритроцитов в крови пациентов (табл. 5, 6 «Приложения»). Возможно, сокращение числа гемолизированных в гипотонической среде низкостойких клеток, а также отсутствие изменения аутогемолитической стойкости эритроцитов может быть обусловлено их внутри-сосудистым гемолизом. Снижение гипоосмотической резистентности эритроцитов более высокостойкой субпопуляции в динамике патологии (повышение значений величин Gmax) регистрировали на фоне увеличения числа лейкоцитов и лимфоцитов крови, указывающих на развитие воспалительного процесса в организме новорожденных.
