Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Реологические свойства крови II
I. I. Основные физико-химические характеристики плазмы и крови 12
I.2.Вязкость крови 14
I.3.Деформация эритроцитов 18
I.4.Агрегация эритроцитов 22
1.5.Суспензионная стабильность крови 26
1.6.Влияние температуры на реологические свойства крови 28
1.7.Влияние криопротекторов и низких температур на показатели реологических свойств крови 31
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава П. Материалы и методы 39
2.1. Материалы исследования 39
2.2.Методы исследования реологических свойств крови 40
Глава Ш. Экспериментальное изучение влияния водных растворов полиэтилен оксидов молекулярной массы 400-6000 на динамическую вязкость плазмы и консервированной донорской крови 46
3.1 .Вязкость 20%-шх растворов ПЭ0, их влияние на вязкость плазмы консервированной донорской крови 46
3.2.Влияние разведения консервированной донорской крови нативной плазмой на вязкость и минимальное напряжение сдвига 54
3.3.Влияние разведения консервированной донорской крови растворами ПЭО на ее вязкость и
минимальное напряжение сдвига 57
3.4.Влияние полиэтиленоксидов на скорость оседания эритроцитов 81
3.5.Влияние полиэтиленоксидов на агрегационную
способность эритроцитов 84
Глава ІУ. Влияние внутривенных введении растворов полиэтиленоксидов на реологическией свойства крови и ее течение в микроциркуляторном русле 90
4.1. Влияние парентерального введения 20%-ных растворов ПЭО-400 и ПЭО-1500 на реологические характеристики крови 90
4.2.Влияние внутривенного введения 20%-ных растворов ПЭО-400 и ПЭО-1500 в дозе 0,6 г/кг
на течение крови в микроциркуляторной системе 94
Глава 7. Влияние криопротекторов и низкотемпературного воздействия на динамическую вязкость эритроцитной взвеси , 102
5.1.Влияние криопротекторов ПЭО-1500 на вязкость эритроцитной взвеси 102
5.2.Влияние низкотемпературного консервирования на вязкость эритроцитной взвеси 105
Обсуждение результатов экспериментов ИЗ
Выводы , 121
Список использованной литературы 123
- Основные физико-химические характеристики плазмы и крови
- Материалы исследования
- .Вязкость 20%-шх растворов ПЭ0, их влияние на вязкость плазмы консервированной донорской крови
- Влияние парентерального введения 20%-ных растворов ПЭО-400 и ПЭО-1500 на реологические характеристики крови
Введение к работе
Актуальность проблемы. Созданные высокоэффективные методы низкотемпературного консервирования (криоконсервирования) клеток и некоторых тканей, обеспечивающие их долгосрочное хранение в жизнеспособном состоянии,относятся к основным научно-практическим достижениям современной криобиологии. Для дальнейшего совершенствования методов и вскрытия механизмов криоповреждений и криозащиты необходимо углубленное изучение и оценка степени морфологической и функциональной сохранности живых структур на этапах криоконсервирования. В настоящее время такая информация мо -жет быть получена в итоге исследования и сопоставления комплекса показателей. Набор тестов в каждом конкретном случае определяет-, ся уровнем знаний о жизнедеятельности изучаемого объекта в раз -личных условиях ; он постоянно обновляется и пополняется более информативными.
Как известно, к числу наиболее исследованных объектов криоконсервирования относятся клетки крови, в первую очередь, эритроциты. На эритроцитах изучались и продолжают изучаться структурные и метаболические изменения, развивающиеся при замораживании, разработаны и совершенствуются методы их низкотемпературной консервации и применения их в клинической трансфузиологии. На эритро -цитах человека можно проследить как расширялся круг исследований, выполняемых для описания состояния клеток, подвергающихся соче -тайному воздействию криопротекторов и низких температур, отогре-
5 ву и последующей дополнительной обработке в связи с необходи -мостью удаления криопротектора в случае использования вещества,, проникающего в клетки. Конечным этапом этих исследовании явля -ется установление показаний к переливаниям размороженных клеток. Заметим здесь,кстати, что в случае применения криозащитных ве -ществ экзоцеллюлярного' механизма действия подлежат учету, в до -полнении к выше перечисленным, эффекты, связанные с их присутствием и внутривенным введением в составе клеточной взвеси.
В этом плане заслуживает внимания исследование критериев, характеризующих реологические свойства крови, их изменения в процессе хранения, в частности, влияния на них криопротекторов и возможною действия размороженных гемопрепаратов на кровоток, особенно в зоне микроциркуляторного русла.
Выяснение этих вопросов дополнит представление о сохранности традиционного объекта изучения в криобиологии - эритроцитов человека и их терапевтической эффективности. Следует подчеркнуть, что эти стороны комплексной проблемы не нашли должного освещения в литературе, а имеющиеся единичные сообщения посвящены геморео-логии консервированной крови, хранившейся при положительной температуре /3/ и замороженной под защитой глицерина. Влияние же экзоцеллюлярных криопротекторов вообще не исследовалось, В то время.как поиск эффективных криопротекторов для клеток крови и костного мозга, не требующих удаления из клеточной взвеси, не прекращается. Получил признание криопротектор для клеток костного мозга полиэтиленоксид молекулярной массы 400, допускается его внутривенное введение в составе размороженной клеточной взвеси /17/. Наряду с криопротекторным показано его осмодиуретическое и гипотензивное действие /57, 16, 7/. Установлена криопротекторная активность полиэтиленоксида молекулярной массы 1500 /67,77,12,
ЬО/. Заметим, что полиэтиленоксид /ПЭО/ является полимером, на котором были изучены основные закономерности эффекта Томса -уменьшения сопротивления в трубах при турбулентном течении жидкости. На примере ПЭО было показано, что молекулярная масса полимера является определяющим фактором этого эффекта /58/. Снижение гидродинамического сопротивления сосудов отмечено при добавлении в кровоток высокомолекулярных ПЭО /22, 23, 19/.
Таким образом, исследование действия криопротекторов на показатели текучести крови должны быть включены в комплекс показателей, характеризующих фармакодинамику криоконсервированных гемо-препаратов. Особое значение эти сведения приобретают при использовании в качестве криопротекторов полимерных соединений, вводимых в кровоток.
Цель и задачи исследования .Целью данной работы, явилось изучение влияния криопротекторов, замораживания эритроцитов на комплекс показателей, характеризующих текучесть эритроцитной взвеси, крови Ъъ \їііл.о ,а также на кроЕоток в микроциркуляторном русле.
Для достижения намеченной дели были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние полиэтиленоксида /ПЭО/ в диапазоне молекулярных масс 400-6000 на динамическую вязкость плазмы и консервированной донорской крови.
Определить влияние ПЭО на комплекс показателей, характеризующих реологические свойства крови: динамическую вязкость при разных напряжениях сдвига, значения минимального напряжения сдвига, показатель агрегации эритроцитов, суспензионную стабильность, С0Э, фильтруемость крови.
Оценить роль низкотемпературного консервирования эритроцитов^ использованием эндо- /глицерин/ и экзоцеллюлярных /ПЭО/ криопротекторов в изменении вязкости клеточной взвеси.
4. Исследовать влияние ПЭ0-400 и Ш0-±500 на кровоток в. микроциркуля торном русле.
Материал и методы исследования. Материалом исследования .Lsu witzo служила 1-2-х дневная донорская кровь, заготовленная на консерванте ЦШИШ-'г, полиэтиленоксид молекулярной массы 400-6000, глицерин. Исследования In- лґі-гга проводили на кроликах породы шиншилла и белых крысах самцах линии Вистар. динамическую вязкость исследуемых систем определяли на модифицированном нами капиллярно-рамочном вискозиметре типа Соя-бем 1960, авторское свидетельство Ш 667665 с приоритетом от 20. 0і. ±978 г. Текучесть крови оценивали по величине минимального напря-жашш сдвжа //, необходимого да начала течения. Расчеты шши-мального напряжения сдвига проводили по формуле, предложенной CciUo/v /1959/. Показатель степени агрегации форменных элементов крови /ДА/ и ее суспензионную стабильность определяли по методу, предложенному ^ік-Ьєм^оаі. /іу62/. Скорость оседания эритроцитов /С0Э/ определяли по Ианченкову. Показатель гематокрита -путем центрифугирования капилляра с испытуемой кровью со скоростью 3000 об/мин.в течение 30 минут. Фильтруемость крови определяли по времени ее фильтрации через бумажный фильтр /фильтрак, 388, ГДР/ на установке, предложенной Русяевым /1979/. В качестве параметра фпльтруемости использовали предложенный /197Э/ показатель 1/2 ВФ:КВ, где КБ - время фильтрации взвешивающей среды, ВФ - время фильтрации клеточной взвеси. Микроцирку-ляторное русло on, i//V изучали путем биомикроскопии сосудов брыжейки белых крыс на специально оборудованном микроскопе МТ-2 с теле- и фоторегистрацией при увеличении окуляра xlO и ооьективов*3,5; *8; *20. Статистическая обработка полученных дан- ных проводилась по методу Стьюдента - Фишера. Принятый уровень достоверности составляет 0,УЬ. Обсчет результатов производили на
ЭВМ CM-I.
Научная новизна и практическая ценность. Впервые исследовано влияние криопротекторов экзо- и эндоцеллюлярного действия на динамическую вязкость эритроцитной взвеси. Установлено, что полиэтил еноксиды, обладающие криозащитным действием, могут улучшать показатели текучести крови. Гишвискозный эффект полимера зависит от молекулярной массы и концентрации в крови. Впервые показано, что олигомеры ряда ПЭО в концентрации до 10 % препятствуют образованию клеточных агрегатов, и таким ооразом, способствуют сохранению суспензионной стабильности крови. Впервые установлено, что низкотемпературное консервирование эритроцитов повышает вязкость клеточной взвеси, что служит основанием для предположения о снижении эластичности эритроцитов, причем этот эффект отмечается как при использовании эндо - / глицерин /, так и экзоцеллюлярньк /ПЭО/ криопротекторов. Экспериментально доказано, что разведение консервированной крови размороженной взвесью эритроцитов без предварительного удаления крио протектора / ПЭО / - в " модели трансфузии" - не вызывает повышения вязкости системы. Положительное влияние парстворов полиэтиленоксида на кровоток впервые подтвержено в опытах иъ- i//V<9 при биомикроскопии микроциркуляторного русла.
В результате выполненных исследований сформулированы следующие положения, выносимые на защиту:
I. Эффект действия олигомеров ряда ПЭО, являющихся активными крио протекторами, на реологические свойства крови зависит от молекулярной массы полимера и его концентрации в крови. — 9 -
Низкотемпературное консервирование с использованием эндо-и экзоцеллюлярных криопротекторов увеличивает вязкость клеточной взвеси.
Внутривенное введение допустимой дозы ПЭО-400 и ПЭО-1500 усиливает кровоток в микроциркуля торном русле.
Апробация работы. Основные материалы по теме диссертации доложены и обсуждены: на конференциях молодых ученых Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР Дарьков- ±978, ±981, г .г./, на Всесоюзном семинаре 'Ъиомеханика-аО" /Москва-±980/ и "Биомеханика-83" /Ленинград-1983 г./, на заседаниях Харьковского областного общества фармакологов и токсикологов / Харьков, ±98±, г. г. /, на заседании Харьковского областного общества гематологов и трансфузиологов Дарьков -±981, 1983 г. г./, на ІУ Украинском сьезде фармакологов / їернополь- 1981г./, на I Всесоюзном съезде биофизиков /Москва -1982 г./.
Публикации и другие формы внедрения. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ. Имеется авторское свидетель- ство Is 667В65 на изобретение "Устройство для определения реологических свойств биологических жидкостей". Получены 2 удостоверения на рационализаторские предложения.
Объем и структура работы. Выполненное исследование является частью плановой научной работы Института проблем криобиологии и криомедицины АН УССР по теме: " Исследование взаимосвязи между химической структурой, биологическим и криозащитным действием соединений гомологических рядов оксиэтилированных полио-лов и их производных с целью разработки подходов к направленному синтезу криопротекюров" / номер государственной регистрации 79015700, шифр темы 2.23.2.6 / и теме "ОМСК-УН " Разработка
10 криоконсерванта для эритроцитов на основе отечественного пре-парата полиэтиленоксида - ПЭО-1500, выполнявшейся по распоряжению Президиума АН УССР № 179 от 2.02.79.
Диссертация изложена на русском языке, на 145 страницах машинописи и состоит из введения, пяти глав, в которых представлены обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные исследования, обсуудение результатов исследования, выводов, указателя использованной литературы, включающего 101 работу отечественных и 106 иностранных авторов. Работа иллюстрирована II таблицами и 31 рисунком.,
Полученные результаты. Впервые обнаружена способность олигомеров ряда ПЭО увеличивать текучесть крови.
Установлено, что гиповискозный эффект действия ПЭО при его внутривенном введении в допустимой дозе проявляется в течение трех часов наблюдения.
Методом биомикроскопии подтверждено положительное влияние растворов ПЭО-400 и ПЭО-1500 на текучесть крови.
Впервые показано однонаправленное действие криопротекторов, относящихся к различным классам химических соединений, на увеличение вязкости клеточной взвеси.
Практические предложения. Обоснована целесообразность исследования комплекса показателей реологических свойств крови при оценке эффективности методов криоконсервирования гемопре-паратов и выяснении их возможного влияния на организм реципиента. Показано благопр -иятное действие внутривенного введения олигомеров ПЭО в дозах 0,6 г/кг (концентрации) на кровоток в микроциркуляторном русле.
Основные физико-химические характеристики плазмы и крови
Крови, плазме, как всем жидкостям, присущи такие физико -химические характеристики как вязкость, удельный вес, плотность, и др. Кровь - многокомпонентная система, представляющая суспензию форменных элементов, взвешенных в плазме, которая в живом организме пребывает в состоянии движения с различной скоростью.
Средняя величина относительной вязкости крови равна 4,5- о о 0,05, ее удельный вес 1,05-1,06 г/см , плотность 1,075 г/см . Вязкость плазмы равна 1,72 - 0,02, ее плотность 1,040 г/мл, вяз- кость сыворотки - 1,6 - 0,01 /87,27,28/. Различия между удельным весом крови и воды незначительны, но реологические свойства этих жидкостей весьма отличаются /89/. Подобное различие, как уже отмечалось, объясняется присутствием форменных элементов крови, их количеством, а также белков плазмы, структурные особенности которых оказывают непосредственное влияние на текучесть крови /60,73,88/. Вязкость плазмы зависит, главным образом, от ее белкового состава /87,68,72,122/19б/Так было установлено, что добавление в плазму липидов выше физиологического уровня сопровождается увеличением ее вязкости, удаление их приводит к нормализации показателей /166/. Молекулярная масса белков плазмы ; является важным фактором, определяющим ее вязкость. Так, несмот-, ря на относительно высокую концентрацию в плазме альбумина, молекулярная масса которого меньше молекулярной массы фибриногена и глобулинов, действие его на ее вязкость оказывается значительно меньшим по сравнению с высокомолекулярными белками, концентрация которых в плазме на несколько порядков меньше /44/. Белки плазмы придают ей свойства, характерные для неньютоновских жидкостей, однако, зависимость вязкости от скорости сдвига у плазмы выражена значительно слабее, чем у крови /14,118,141/. Более того, переменный характер течения плазмы не всеми признается, поэтому не утверждая, , но и не отрицая его полностью, принято считать, что по своим свойствам она близка ньютоновским жидкостям. В плазме имеются белки, молекулярная масса которых достигает ве-личин 10 u - 10 . Существует предположение о возможной их функции в регуляции гемодинамики /22/. В специально проведенных экспериментах было показано, что плазма человеческой крови проявляет сильновыраженный эффект Томса - в турбулентном режиме ее течения гидравлическое сопротивление потоку в прямой трубке .резко убывает, тогда как при ламинарном течении изменений сопротивления не наблюдается. Полученные результаты подтверждают высказанное авторами предположение о том, что среди биополимеров,содер- . жащихся в плазме тлеется фракция,способная снижать турбулентное сопротивление потока /21/.
Материалы исследования
Материалом исследования служили водные растворы ПЭО молекулярной массы 400, 1500, 2000, 3000, 4000, 6000, І-2-х дневная консервированная донорская кровь, заготовленная на консерванте ЦОЛИПК-7 , плазма крови, суспензии эритроцитов с различными соотношением (по объему) эритроцитной массы и жидкой части. При выборе концентрации криопротекторов в испытуемой среде руководствовались требованиями методических рекомендаций /51/ и данными токеико-морфологического изучения препаратов /67/.
Использовали образцы ПЭО, полученные в лаборатории криопротекторов ИПК и К АН УССР, а также на заводе "Оргсинтез" (Казань).
Растворы ПЭО готовились на изотоническом растворе хлорида натрия, с последующим доведением рН среды, трис -НС6- буфером до 7,2-7,4. Эти условия необходимо соблюдать для предупреждения осаждения белков плазмы крови в присутствии ПЭО in vltta /97/. В опытах in \/ii/o объектом исследования служили кролики породы шиншилла обоего пола, возраста 9-12 месяцев, весом 2500-3500 г. и белые крысы самцы линии "Вистар" весом 200-250 г. Приготовленные растворы, по общепринятой методике, вводились в краевую вену уха кролей и в бедренную вену крысам.
В "модели трансфузии" определялись показатели динамической вязкости при заданных напряжениях сдвига в суспензии, представляющей смесь донорской крови и размороженной эритроцитной взвеси в соотношении 10:1, что может служить аналогом переливания 500 мл. эритроцитной взвеси взрослому со средним объемом циркулирующей крови, равным 5000 мл /67/. 2.2 Методы исследования реологических свойств крови.
Текучесть крови оценивали по комплексу показателей: динамической вязкости, показателя агрегации эритроцитов, их фильтруемое ти через бумажный фильтр, С0Э, гематокрита.
Вязкость 20%-шх растворов ПЭ0, их влияние на вязкость плазмы консервированной донорской крови
Результаты определения зависимости вязкости 20 -ных раст 47 воров ПЭО-400, ПЭО-6000 от напряжения сдвига приведены в таблице I, где отмечена прямая зависимость между молекулярной массой полимера и вязкостью раствора. С увеличением молекулярной массы полимера в растворе их вязкость возрастает и не зависит от прилагаемого напряжения сдвига, т.е. вязкость растворов является величиной постоянной и характеризует их как ньютоновские жидкости. Это дает основание полагать, что молекулярное взаимодействие в исследуемых 20%-ных растворах ПЭО-400, ПЭО-6000 подвергается полному разрушению с момента возникновения течения, что свидетельствует о слабом межмолекулярном взаимодействии в растворе. Структура потока мгновенно приобретает равновесное состояние , поэтому дальнейшее увеличение прилагаемого напряжения сдвига не оказывает влияния на показатели вязкости раствора. С увеличе -ниєм скорости течения раствора легко изменяется пространственное расположение молекул полимера в слоях движущегося потока. Движение раствора приводит к быстрому переходу макромолекул в новое расположение, более приемлемое для данной скорости его течения, что способствует наименьшему взаимодействию параллельно движущихся слоев в растворе. По мере увеличения молекулярной массы полимера возрастают силы взаимодействия параллельно движущихся слоев жидкости, что проявляется в повышении вязкости раствора.
Влияние конечной концентрации полимера в плазме на ее вязкость представляет практический и теоретический интерес, так как дает возможность оценить и проанализировать взаимодействия белков плазмы с молекулами полимера и их влияние на характер ее течения. Для исследования этого процесса использовали разведения плазмы 20%-ными растворами ПЭО-400,ПЭО-6000 в соотношении . 10:1 и 4:1, что соответствует конечной концентрации полимера
Влияние парентерального введения 20%-ных растворов ПЭО-400 и ПЭО-1500 на реологические характеристики крови
20%-яие растворы ПЭО-400 и ПЭО-1500 вводили внутривенно в краевую вену ушка кролика в дозе 0,6 г/кг; показатели, характеризующие текучесть крови, определяли в пробах, взятых из сосуда второго ушка животного до введения испытуемых сред и через 5, 30, 60, 90, 120, 180 минут после инфузии. Животные во время опыта оставались спокойными, в их поведении особых изменений не отмечалось.
Как показано на рис. 18, внутривенное введение ПЭО-400 вызы -вает достоверное снижение вязкости крови в течение 2-х часов наблюдения при напряжении сдвига 1,69 дин/см2, причем максимальное снижение ее вязкости отмечено сразу после внутривенного введения раствора. К третьему часу наблюдения вязкость крови возвращается к исходному значению. Подобное изменение вязкости крови отмечено при напряжении сдвига, равном 2,54 дин/cwr. С увеличением прилагаемого напряжения сдвига 3,39-5,09 дин/cwr отмечено снижение вязкости крови в течение первых 30 минут, которое сохраняется на протяжении времени наблюдения. При более высоких напряжениях сдвига 6,79-8,49 дин/см2 снижение вязкости крови отмечено в первые минуты с момента введения полимера, через 30 минут исследуемый показатель возвращается к исходному значению.
Увеличение молекулярной массы полимера (ПЭО-1500) оказывает подобное влияние на изменение вязкости крови.
Влияние внутривенного введения 20 -ного раствора ПЭО-1500 в дозе 0,6 г/кг на динамическую вязкость крови.
Как видно из рис. 19, при напряжении сдвига 1,69 дин/смг вяз -кость крови снижается сразу после парентерального введения полимера по сравнению с исходным значением. Через 30 минут вязкость крови незначительно возрастает, однако остается достоверно ниже исходного значения и сохраняется на данном уровне в течение 2-х часов, к третьему часу вязкость крови возвращается к исходному ее значению. При напряжениях сдвига 2,54-5,09 дин-см2 отмечено достоверное снижение вязкости крови в течение 3-х часов. С увеличением напряжения сдвига до 6,79 дин/саг достовер 93 ное уменьшение вязкости крови отмечено только на 5-й минуте. Параллельно было отмечено изменение гематокритного показателя. Как показано на рис. 20, внутривенное введение 20 -ного раствора ПЭО-400 (кривая I) сопровождается достоверным снижением гематокритного показателя на пятой минуте определения. К тридцатой минуте отмечено некоторое его увеличение, однако, не достоверное по сравнению с исходным. К шестидесятой минуте отмечен второй пик падения гематокритного показателя, и к третьему часу наблгодения отмечено некоторое его увеличение, при этом его значение оказывается достоверно ниже исходного
Аналогичная закономерность отмечена при внутривенном введении тех же дозы ПЭО-1500, однако, при этом отмечено более вы 94 раженное снижение гематокритного показателя через 30 минут после введения. В течение трех часов картина изменения гематокритного показателя совпадает с таковой при введении ПЭО-400,. однако значение его отличается достоверным уменьшением, начиная с 30-й минуты определения.
Таким образом, продолжительное снижение вязкости крови при внутривенном введении растворов ПЭО связано с уменьшением . значения гематокритного показателя, причем его колебания совпадают с колебаниями значения вязкости во времени. Отмеченная гемодиллкг :ция в первые минуты наблюдения вызвана,по-видимому, непосредственным введением раствора, ее достоверное снижение на низком уровне связано, скорее всего, с гидратационными свойствами молекул полимера, которые могут обусловить отток жидкости из внесосудистого пространства и удерживание его в сосудистом русле.
