Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы
1. Структурная организация мембран эритроцитов 9
2. Холодовой шок эритроцитов 22
Результаты собственных исследований и их обсуждение
3. Материалы и методы исследования 35
4. Изменение объема и формы эритроцитов в гипертонических средах как начальный этап модификации барьерных свойств мембраны 43
5. Влияние температуры на поведение эритроцитов при изменении осмотических условий среды 84
6. Влияние состава и рН среды на чувствительность к охлаждению клеток,подвергнутых инкубации при +37 и 0С 123
7. Влияние температуры инкубации (0 и +37С) на устойчивость эритроцитов к замораживанию в присутствии не проникающего крио-протектора (ПЭО-1500) 142
Заключение 165
Выводы 171
Список литературы 173
- Структурная организация мембран эритроцитов
- Изменение объема и формы эритроцитов в гипертонических средах как начальный этап модификации барьерных свойств мембраны
- Влияние температуры на поведение эритроцитов при изменении осмотических условий среды
- Влияние температуры инкубации (0 и +37С) на устойчивость эритроцитов к замораживанию в присутствии не проникающего крио-протектора (ПЭО-1500)
Введение к работе
Замораживание и последующий отогрев биологических объектов вызывают повреждения как на тканевом и органном, так и на клеточном уровнях организации [2,15,18,23,25]. В настоящее время в криобиологических исследованиях значительное внимание уделяется изучению механизмов холодового повреждения мембранных структур клетки [2,109,162]. Важной особенностью механизма повреждения мембран при охлаждении является развитие процессов, модифицирующих их структуру, уже при положительных температурах [2,4І. Указанные процессы включают конформационные изменения мембранных белков [3] и фазовые переходы липидов [236]. Подобные изменения не являются безразличными для сохранения жизнеспособности клеток: нарушение структуры и проницаемости мембраны под их влиянием при быстром охлаждении от +37 до 0С вызывают лизис некоторых клеток [23,215], в том числе эритроцитов [162,250]. Разнообразие физико-химических факторов, потенцирующих повреждение эритроцитов при охлаждении в области положительных температур (высокие концентрации непроникающих солей и неэлектролитов [250] , бактериальные токсины [2І5І, лизофосфатиды [240І и другие [І43І) не позволяет в настоящее время предложить единый механизм, объясняющий поведение клеток в указанных условиях. Однако, то, что холодовое повреждение эритроцитов усиливается в гиперосмотических условиях, делает необходимым анализ поведения клеток в растворах непроникающих через мембрану криопротекторов (полиэтиленоксиды,гидрокси -этилкрахмал,поливинилпирролидон [19]). Можно предположить, что трудности их применения в криобиологической практике обусловлены развитием температурозависимых изменений, аналогичных процессам, наблюдаемым при охлаждении в гипертонических солевых средах при положительных температурах [109]. Поэтому, выявление основных закономерностей нарушения структуры и функции клеток при положи-
- 4 тельных температурах позволит разработать наиболее оптимальные условия обработки клеток криопротекторами и обосновать принципы направленного контроля процессов,модифицирующих состояние клет -ки при ее охлаждении из области физиологических температур.
Другой важной проблемой является выявление процессов, модифицирующих структуру мембраны при помещении клетки в гипертони -ческие среды. Б этих условиях реакция клетки может быть весьма сложной и проявляться как в изменениях ее макроскопических параметров (формы и объема), так и в изменениях молекулярной структуры мембраны.
Изменения объема и формы клетки вызывают модификацию структуры мембраны уже в начальной фазе гипертонической обработки,поэтому изменения, вызванные охлаждением,будут "накладываться" на уже модифицированную структуру, а результирующий процесс будет зависеть от исходного состояния клетки. В этой связи следует отметить, что начальная реакция клетки на изменение осмотических условий среды проявляется в изменении ее формы, т.е.в развитии локальных деформаций мембраны. Последнее способно привести к локальным изменениям структуры мембраны [І6І, что делает необходимой постановку вопроса о том, как проявляют себя начальные нарушения структуры, и какова их роль в повреждении клетки при последующем охлаждении.
Решение этого вопроса сопряжено с рядом трудностей.Во-первых, традиционные подходы к анализу механизмов холодового пов -реждения клетки в большинстве своем не учитывают важной особенности организации структуры мембраны - продольной и поперечной асимметрии в распределении ее компонентов [87І. Зто означает, что "дифференциальная" холодовая чувствительность различных участков мембраны заложена в ее исходной структуре.
Во-вторых, большинство клеток имеет сложно организованный
_ 5 -белковый цитоскелет, стабилизирующий структуру мембраны и контролирующий динамическое поведение ее компонентов [1153. В целом, повреждение структуры мембраны может проявляться как нарушение ее барьерных свойств, что способно привести к коллоидно-осмоти -ческому набуханию и лизису клеток [2431.
Начальная реакция эритроцитов на изменение осмотических условий среды, связанная с изменением объема и формы, включает изменения белкового цитоскелета, что отразится как на структурной устойчивости мембраны, так и на состоянии участков прикрепления к ней цитоскелета. Эти изменения могут привести к формированию дефектов структуры и нарушению барьерных свойств мембраны. Последующее охлаждение может вызвать углубление уже существующих нарушений структуры и лизис клеток.
Таким образом, выявление температурозависимых изменений структуры мембраны в гиперосмотических условиях предполагает анализ изменений макроскопических параметров клетки (формы и объе -ма) и изменений молекулярной структуры и проницаемости мембраны.
Исходя из этого, целью данной работы явилось исследование изменений формы, объема, структуры и проницаемости эритроцитов, вызванных действием повышенной тоничности среды при +37 и 0С, а также после охлаждения от +37 до 0С и замораживания до -196С в присутствии 15#-ного ПЭО-1500.
Для достижения указанной цели требовалось решение следую -щих задач:
исследовать направленность и характер изменений объема, и формы эритроцитов при 0 и +37С в зависимости от тоничности среды;
на основе анализа изменения пассивной проницаемости мембраны для ионов К* изучить устойчивость барьерных свойств мембраны при изменении тоничности и температуры среды;
- б
с помощью флуоресцентных зондов (пирен,АНС,ДСП-12 и ОСП--14) изучить направленность и характер изменений структурного состояния липидов и белков мембраны эритроцитов при 0 и +37С в средах различной тоничности, а также обратимость указанных изменений ;
исследовать структурную устойчивость эритроцитов к циклическому сдвигу температуры 0—-+37—*0С в зависимости от тонич -ности, состава и рН среды и направленности сдвига осмотических условий;
исследовать влияние температуры, при которой производится обработка эритроцитов криопротектором ПЭО-1500,на их устойчивость к замораживанию до -19бС и последующему отогреву.
В работе установлєно,что температура,при которой эритроциты помещаются в гипертонические условия,оказывает существенное влияние на макроскопические параметры эритроцитов (объем и форму). Впервые показано,что при 0С изменения формы эритроцитов,вызванные повышением тоничности среды,носят качественно иной характер, чем при +37С. При низкой температуре не формируются некоторые переходные формы клеток (кренированный диск) и болшая часть клеток не выходит из фазы кренирования. Получены данные о том, что постгипертонический лизис эритроцитов,наблюдаемый при возврате клеток из гипертонических условий в среды с физиологической то -ничностью,а также лизис клеток при охлаждении от +37 до 0С в присутствии 0,6-1,2 ШНоіІ коррелируют с начальным уровнем дефектности структуры,оцениваемой по освобождению ионов К4".
Новым является установление факта о взаимосвязи между количеством появляющихся на этапе инкубации в гипертонических условиях чувствительных к охлаждению эритроцитов в форме гладкого плоского диска, и величиной гемолиза при последующем охлаждении. Получены данные об устойчивости макроскопических параметров
- 7 эритроцитов, проницаемости и структуры мембраны при циклическом сдвиге температуры в присутствии гипертонических концентраций соли.С помощью флуоресцентных зондов установлено, что основная роль в эффектах, развивающихся в условиях гипертонии, принадле -жит пространственной реорганизации белковых компонентов мембраны.
В работе получены новые данные о влиянии температуры на поведение эритроцитов в средах с высокой тоничностью (от 1,8 до 3,0 М f/act ). Показана важная роль в этих процессах рН и температуры среды. Впервые показана эффективность дозированного введения в среду криопротектора при низких температурах как факто -ра,резко повышающего устойчивость эритроцитов к замораживанию и изменению осмотических условий среды.
Теоретическая и практическая значимость работы заключается в том, что на основе анализа результатов работы высказано предположение о едином механизме, лежащем в основе повреждения кле -ток при холодовом шоке и постгипертоническом лизисе, связанном с начальным формированием дефектов структуры мембраны. Развиты представления о роли изменений структуры белкового скелета клеток, сопровождающих изменение объема и формы клеток в качестве фактора, модифицирующего их устойчивость к изменению температуры. Указано на значение медленнообратимых изменений белков эритроцитов в процессах, вовлеченных в изменение холодовой чувствитель -ности клеток при гипертонической инкубации и охлаждении.
Анализ поведения эритроцитов в средах, содержащих непроникающий криопротектор (ПЭО-1500), позволил предложить эффективный метод предобработки клеток перед криоконсервацией.
Разработанный на основании результатов исследований метод холодовой предобработки эритроцитов перед криоконсервацией успешно применяется на Харьковской областной станции переливания крови. Принципы разработанного метода внедрены и используются для
- 8 предобработки других клеток во ВНИИ разведения и генетики сельскохозяйственных животных (г.Пушкин). На защиту выносятся положения:
Устойчивость эритроцитов человека, к охлаждению в интервале температур +37 - 0С в гипертонических условиях «реды зависит от объема и формы клеток, а также от исходного уровня дефектности структуры мембраны, оцениваемого по освобождению ионов К*.
Сохранность эритроцитов при замораживании до -І9бС в присутствии непроникающего кри о протектора. П30-Ї5ОО существенно повышаются при снижении температуры, при которой клетки обрабатываются кри о протектором до 0 -г +4С, когда резко ограничивается роль факторов, влияющих на форму клеток и барьерные свойства мембраны.
Материалы диссертации доложены и обсуждены на IX и XI конференциях молодых ученых Института проблем криобиологии и криомеди-цины АН УССР (Харьков,1982,1984); 1У-ом Украинском биохимическом съезде (Днепропетровск,1982); 1У-ом Всесоюзном симпозиуме по биохимии липидов (Киев,1983); П-ой Всесоюзной конференции по теоретическим и прикладным вопросам криобиологии (Харьков,1984); П-ой Всесоюзной конференции по анабиозу (РигаД984).
По результатам исследований опубликовано 9 научных работ.
Структурная организация мембран эритроцитов
Биологическим мембранам принадлежит основная роль в регуляции структуры и функции клеток. Основным структурным элементом эритроцитов млекопитающих является плазматическая мембрана,отделяющая цитоплазму от внешней среды, поэтому мембранные препараты, полученные из этих клеток, являются однородными и не загрязнены другими мембранами. В то же время структура эритроцитарной мембраны отражает общие принципы организации биологических мембран.
Основными компонентами мембран эритроцитов, как и других биологических мембран,являются белки,липиды и углеводы.Углеводы химически связаны либо с белками,либо с липидами и образуют соответственно гликопротеины и гликолипиды [7,241.
В состав мембраны эритроцитов входит около 20 белков и гли-копротеинов.а также различные типы липидов и гликолипидов [1701, Ц95І. Большинство белков и гликопротеинов являются интегральными и солюбилизируются в присутствии детергентов.органических растворителей и при изменении рН [65,125,2301. Эти белки погружены в бислой и стабилизируются в нем гидрофобными взаимодействиями [2251 Степень погружения белков в гидрофобное ядро мембраны может быть различной в зависимости от их амфифильных свойств.Интегральные белки пронизывают мембрану,причем гидрофильные сегменты белков экспонируются в водную фазу, а сами белки довольно прочно связаны с липидами .Вязкость липидного матрикса весьма слабо ограничивает диффузию интегральных белков в плоскости мембраны.
Периферические мембранные компоненты (примерно 25$ всех мембранных белков) расположены на поверхности мембраны и связаны с ней слабыми не ковал ентными взаимодействиями. Эти белки могут быть легко элиминированы из мембраны буфером с низкой ионной -силой [21,95,182].
С помощью диск-электрофореза в системе додецилсульфат натрия - полиакриламидный гель из мембран эритроцитов выделено два интегральных гликопротеина.Один из них с молекулярной массой 90-100 КД (компонент 3) [218] .второй - си ал о гли ко протеин с молеку -лярной массой.30 -50 КД - гликофорин [226] .Гидрофильные участки компонента 3 и гликофорина локализованы на наружной поверхности мембраны [188,219,2261 и являются специфическими рецепторами для различных вирусов.лектинов и антител.Гликофорин состоит из одной полипептидной цепи,содержащей около 60$ углеводов,в основном в форме олигосахаридов [156,226] и представляет собой тримодальную молекулу с гидрофильно-гидрофобно-гидрофильной структурой.Полипептидная цепь гликофорина пронизывает липидный бислой мембраны таким образом,что Л/-концевой гликопептидный участок расположен снаружи клетки,а С-концевой гидрофобный участок - в гидрофобной липидной зоне мембраны на ее внутренней поверхности [138,170].
Другие гликопротеины - белки полосы 3 содержат около 5-8$ углеводов,в основном маннозу.галактозу и tf -ацетилглюкозамин.Показано, что белок полосы 3 выполняет такие функции,как транспорт анионов [71,194].транспорт воды [2173, обладая при этом холин -эстеразной и АТ-азной активностью [2191.Очищенный основной белок полосы 3 состоит из одной полипептидной цепи и пронизывает липидный бислой мембраны,причем его /\/-концевой участок находится на внутренней стороне мембраны.В составе мембраны белок полосы 3 формирует димеры,и,возможно - тетрамеры [185]. На внутреннем домене белка полосы 3 расположен участок связывания глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы (полоса б),и сам белок образует проч -ные связи с мембраной в присутствии молекул АТФ [185].Ферментный белок,связанный с мембраной электростатическими связями,является тетрамером с молекулярной массой 150 КД и участвует в цикле гликолиза эритроцитов. Белок полосы 3 и гликофорин формируют мембрано-интеркалированные частицы,хорошо видимые при криоскалывании [239] и их количество в эритроцитарной мембране (5 10 ) соответствует числу молекул этих интегральных белков [2191.
Цитоплазматическая (внутренняя) поверхность мембран эритроцитов покрыта филаментным ретикулумом из белков,поддерживающим целостность мембраны по механизму нековалентной стабилизации.Субмембранный ретикулум довольно устойчив и при солюбилизации бел -ков тритоном Х-ЮО сохраняет свои свойства [70,119,1461. В его состав,прежде всего, входит водорастворимый белок с высоким молекулярным весом - спектрин, который при гель-электрофорезе формирует две дискретные полосы [581. Другим компонентом,входящим в субмембранный ретикулум,является белок полосы 4.1,а также эритро-цитарная форма активна, (полоса 5) [34,1051.
Молекула спектрина представляет собой димер из двух неидентичных субъединиц,обозначаемых «с (250 КД) и j$ (225 КД). Обе субъединицы представляют собой удлиненные палочковидные структуры, каждая приблизительно 1000 А в длину [176].Последние эксперименты свидетельствуют,что данные структуры образуют множественные нековалентные ассоциации между соседними сегментами,что обеспечивает их контакт друг с другом [169].Высокоочищенные молекулы спектрина способны формировать крупные макромолекулярные агрегаты без участия других посредников [169,1841.При этом димеры спектрина превращаются в тетрамерные формы [І34І с определенной ориентировкой головы и хвоста [212].образуя,таким образом,тетрамерные единицы удвоенной длины.Установлено,что индивидуальные спек-триновые димеры организуются в тетрамерные формы с помощью нековал ентных взаимодействий между сегментом домена с молекулярной массой 80 КД сС субъединицы и доменом 28 КД k -субъединицы [1841.
В настоящее время существует две гипотезы о структурно-функциональной организации субъединиц спектрина в мембране.Первая предполагает,что функционально активной в мембране является тетрамерная форма спектрина [2331 , со гласно второй - олигомерная [ 169]. Поскольку спектрин ассоциирован с внутренней поверхностью мембраны,его локальная концентрация,достигающая ЮМ, достаточна для образования олигомеров. Образование олигомеров спектрина доказано в экспериментах in &1уи [184] .
Вторым функционально значимым белком субмембранного ретику-лума эритроцитов является актин (полоса 5), который представляет собой компактные глобулы с молекулярной массой 43 КД ((3"-актин) [ 34]. Актин способен связывать нуклеотиды,преимущественно АД и содержит элементы,индуцирующие полимеризацию (У -актина.При обра,-зовании филаментных комплексов актина могут полимеризоваться 12-18 молекул, называемых протофиламентами (б -актин) [107]. Пос -кольку тетрамеры спектрина бивалентны в местах связывания актина,они могут перекрестно сшивать филаменты актина в растворе.Полагают, что короткие филаменты актина перекрестно сшитые спектрином,являются важным структурным элементом цитоскелета [92].
Добавление в реагирующую смесь белка 4.1 увеличивает взаимодействие между спектрином и актином в растворе [63].Белок полосы 4.1 может также модулировать спектрин-зависимое прикрепление актина к мембране и формировать белковый комплекс,связанный с мембраной через спектрин [63].
Изменение объема и формы эритроцитов в гипертонических средах как начальный этап модификации барьерных свойств мембраны
Субмембранный ретикулум способен ограничивать латеральную подвижность трансмембранных белков [104] .поскольку белки,входя -щие в его состав,образуют под мембраной сеть,регулирующую движение интегральных белков [205] Для некоторых белков спектрин и другие белки субмембранного ретикулума являются "якорями".удерживающими их в определенных локусах мембраны и контролирующими их топологическую организацию.
При удалении спектрина и актина из мембран эритроцитов,последняя разрушается и трансформируется в сферические везикулы [ 115],т.е.субмембранный ретикулум играет существенную роль в сохранении формы и размера эритроцитов.Стабилизирующий эффект субмембранного ретикулума способствует тому.что при деформации клетки она может восстанавливать форму мембраны после снятия стресса.Увеличение степени взаимодействия интегральных белков со спектрином ограничивает изменение формы клетки [205].
Таким образом,периферическая белковая сеть формирует устойчивую и элластичную основу,регулирующую деформации мембраны, и оказывает стабилизирующее действие на динамичный липидный бислой.
По данным [234] липиды в мембранах эритроцитов составляют 40$ ее сухого веса.По молекулярному соотношению примерно половина фракции липидов состоит из неэтерифицированного холестерина (40$),а другая половина из фосфолипидов (50$) и гликолипидов (10$) [234]. Основными фосфолипидами мембран эритроцитов являются сфингомиелин (СМ),фосфатидилхолин ( Ж),фосфатидилэтаноламин (ФЭА) И фосфатидилсерии (С),которые составляют примерно 95$ от общего содержания фосфолипидов [234].Последние три (Х,$ЗА и С) являются диацилглицерофосфолипидами [І95І. Сфингомислин принадлежит к классу сфинголипидов и включает углеводородную цепь,содержащую двойную углеродную связь,две ОН-группы и А/Нр-группу,этери-фицированную длинноцешчечной жирной кислотой по амидной связи, т.е.формируется церамид [1951.Гликолипиды,подобно ефингомиелину, включают церамидную единицу,хотя их полярная группировка состоит из различных комплексных полисахаридов,которые могут включать более 20 остатков Сахаров [1951.
Липиды эритроцитов различаются не только по наличию сфинго-зинового или глицеринового скелета,но и по полярным группировкам [ 195].Каждый индивидуальный класс фосфолипидов представляет собой группу соединений,имеющих одинаковую полярную группу,но различные жирные кислоты,отличающиеся по длине цепи и числу двойных связей [69І.Так,фосфатидилхолин мембран эритроцитов состоит более чем из 20 молекулярных видов,типичный представитель которых формирует молекулу с насыщенной жирной кислотой во втором положении глицеринового скелета.
По данным, полученным при анализе распределения химических меток,фосфолипазного гидролиза и с помощью липид-обменивающих белков, у станов л єно [197,235],что фосфолипиды в мембране эритроцитов распределены асимметрично по обе стороны мембраны.Холин - содержащие фосфолипиды (сфингомиелин и фосфатидилхолин) распределены преимущественно на наружной поверхности мембраны,а фосфатидилэта-ноламин и фосфатидилсерии на внутренней.В мембране эритроцитов человека 16% Ш и 82$ СМ находятся в наружном монослое,в то время как 80$ ФЭА и весь С локализованы во внутреннем монослое. Все гликолипиды находятся во внешнем монослое [252]. До сих пор, однакове выяснен характер распределения холестерина по обе стороны мембраны.Большинство данных свидетельствует о его преимущественной локализации в наружном монослое мембраны [89].
Липидный би слой эритроцитов проявляет высокую степень ста-бильности.Исследования с помощью - Р-ЯМР показали, что даже после обработки мембран фосфолипазами,оставшиеся липиды находятся в бислойной конфигурации [2351. До сих пор неясно,связана ли подобная стабильность с присутствием некоторых белков,или с относи -тельно высокой концентрацией холестерина в мембране, или с тем и другим вместе.Подобная стабильность играет важную роль в обеспечении физиологических свойств эритроцитов в кровяном русле и сохранении их способности к деформационным нагрузкам при прохождении через узкие капилляры [І95І.
Предполагают [І72І, что асимметричное расположение фосфоли-пидов в мембране эритроцитов связано со способностью ЭА и С взаимодействовать с частью молекул спектрина,расположенного на внутренней поверхности мембраны. Нарушение структурной организации спектрина может привести к уменьшению прочности взаимодействия между фосфолипидами и спектрином,что, в свою очередь,увеличивает скорость трансмембранных перестроек липидов типа "флип-флоп" и изменяет характер асимметрии в распределении различных фосфоли-пидов в мембране [118]. Однако.физиологическое значение липидной асимметрии до сих пор окончательно не выяснено.Установлено, в частности, что липосомы, приготовленные из фосфолипидной смеси, состав которой сходен с составом внутреннего монослоя мембраны, резко снижают время свертывания плазмы [195] -что наблюдается в присутствии незамкнутых эритроцитарных теней или вывернутых вези кул .Это может означать, что липиды цитоплазматической поверх -ности мембраны, и в первую очередь фосфатидилсерии,обладают про-коагулянтной активностью.
Фосфолипиды принимают участие в регуляции функционирования ион-транспортирующих систем мембран.Активность таких катион-транспортирующих АТФ-аз эритроцитов человека, как М -К -АТФ аза и Ca. + J p+-AT a3а,полностью зависят от глицерофосфолипидов внутреннего монослоя [196] .Активностьл/л-+-К+-АТ-азы специфично обеспечивается фосфатидилсерином,а Сдг -Ма -АТ-&зы смесью фос-фолипидов внутреннего монослоя.В соответствии с их функцией оба фермента являются трансмембранными (или интегральными) и, следовательно, находятся в тесном контакте с обеими половинами бислоя. Тот факт, что только фосфолипиды внутренней поверхности поддерживают активность этих ферментов, свидетельствует, что их активные центры локализованы на внутренней стороне мембраны.
Влияние температуры на поведение эритроцитов при изменении осмотических условий среды
Мембранные структуры,нормальная функция которых связана, с экзоцитозом,эндоцитозом и слиянием,характеризуются чрезвычайно высокой чувствительностью к охлаждению в интервале температур +37 0С.Такая чувствительность также связана с относительно не -высоким содержанием холестерина в мембранах.При исследовании зи-могенных гранул околоушной железы крыс было показано [213J ,что охлаждение гранул от +37 до 0С приводит к быстрому освобождению амилазы.Быстрое охлаждение синаптосом,содержащих в основном,насыщенные жирные кислоты,также приводит к увеличению пассивной проницаемости мембраны для аминокислот [1531.Так,в исследованиях [І26І была обнаружена прогрессивная утечка вазопрессина,АТ и белков при охлаждении от +37 до 0С в препаратах нейрогипофиза быка.Согласно данным [351.охлаждение до 0С секретосом,изолированных из нейрогипофиза,сопровождается освобождением вазопрессина, лактатдегидрогеназы и окситоцина.Одним из этапов процесса экзо-цитоза является экзотермическое фазовое разделение липидов,развивающееся .возможно,при участии ионов Са"" [1311.Можно предположить, что структурная готовность секретирующих мембран к фазовому разделению является причиной их высокой чувствительности к охлаждению,и тонкая сбалансированность регуляторних механизмов при физиологических температурах,по-видимому нарушается при охлаждении, что приводит к низкотемпературной неспецифической утечке цито -плазматического материала.Эритроциты могут подвергаться лизису при охлаждении в изотонических условиях в случае, если структура их мембрана изменяется под влиянием неспецифических модификаторов структуры,например,короткоцепочечных фосфолипидов [143,223,224], лизофосфатидов [163,240,241] или под влиянием других факторов [175,2151.
Холодовой шок эритроцитов (так называемый "криогемолиз") описан многими исследователями [85,110,162,221].Так,в работах Лавлока [І63І было показано,что эритроциты восприимчивы к термальному шоку,а возникающие при этом повреждения вызваны понижением температуры и экспозицией эритроцитов в гипертонических растворах [162]Дальнейшие исследования [181] показали,что гипертонические растворы сахарозы,также как и соли вызывают холодовой шок эритроцитов.Лавлок [І63І объяснял гемолиз при термальном шоке механическими нарушениями клеточной мембраны,ведущими к потере фосфолипидов и холестерина.Однако,в последующих работах [180] была обнаружена только корреляция между потерей мембранных липи-дов в гипертонической среде и развитием небольшого гемолиза перед охлаждением.Наиболее вероятно,что фоефолипиды и холестерин выделяются в гипертонические растворы из теней эритроцитов и фрагментов мембран,образовавшихся при гемолизе,а не из интактных клеток. В то же время,корреляции между потерей липидов и лизисом клеток при последующем охлаждении обнаружено не было [І80І.
Состояние нестабильности мембран при охлаждении,по-видимому, в значительной степени является следствием фазовых переходов липидов, глубина развития которых зависит от содержания холестерина в мембранах [78].Холестерин влияет на проницаемость липидного би-слоя мембран лишь при определенном соотношении холестерин/полярные липиды [80І. В нативной эритроцитарной мембране мольное соотношение холестерина и фосфолипидов равно приблизительно 0,8. С помощью метода КР-спектроскопии в области температур +І7 20С в эритроцитарной мембране обнаруживается фазовый переход,который сопровождается модификацией мембранных белков [236,237]. Зто свидетельствует о том,что в мембранах эритроцитов определенная часть липидов не ассоциирована с холестерином и фазовые переходы охватывают не всю мембрану,а развиваются в микроскопических доменах .В исследованиях [236,237] показано,что в интервале температур +30 -30С основные фазовые изменения липидов мембран эритроцитов происходят в довольно широком интервале температур, от +10 до -20С,с максимумом при температуре -8С.Таким образом,наг-личие фазовых переходов в липидной фазе эритроцитов при той или иной температуре объясняется существованием истощенных по холестерину участков мембраны,примыкающих к мембранным белкам.Зто означает,что различия в характере фазовых изменений эритроцит арных мембран с высоким содержанием холестерина и мембран с низким содержанием холестерина (микроорганизмы,сперматозоиды,синаптосомы и др.) заключаются в том,что фазовые переходы при снижении температуры в первом типе мембран происходят только в микродоменах, окружающих белки. Поэтому нестабильность мембран эритроцитов в интервале температур +37 -20С является следствием изменения структуры этих микродоменов.В то же время фазовые переходы в мембранах с низким содержанием холестерина носят выраженный кооперативный характер и охватывают всю мембрану.В этом случае при ох -лаждении,в результате изменения состояния основной массы липидов, нестабильность становится фактором,присущим всей мембране.Более значительная площадь нестабильных участков в мембранных структурах с низким содержанием холестерина обусловливает способность клеток подвергаться термальному шоку в изоосмотических условиях. Для мембран с высоким содержанием холестерина требуется дополнительное воздействие для проявления эффектов охлаждения на уровне мембранных белков и их микроокружения,т. е.в данных условиях температурные эффекты проявляются,в первую очередь,через нестабильные участки мембраны,которые будут модифицироваться при одновременном воздействии двух факторов - низкой температуры и гипер-осмолярности среды [21.
Показано [Пб],что термальный шок более выражен в мембранных системах с низким содержанием ненасыщенных и высоким содержанием насыщенных жирных кислот .Если мембрана включает высокую пропор -цию насыщенных жирных кислот,фазовые переходы происходят при температурах выше 0С [148].В мембранах с высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот фазовые переходы развиваются при более низких температурах [106Д73].Высокая чувствительность к холоду мембранных структур с высоким содержанием насыщенных жирных кислот [1161,вероятно,обусловлена более сильным сжатием монослоев, состоящих из липидов с выпрямленными жирнокислотными цепями, так как изогнутая конфигурация ненасыщенных жирных кислот препятствует появлению значительных флуктуации плотности в плоскости мембраны и позволяет сохранить относительно высокую стабильность мембраны даже при охлаждении [158].
Влияние температуры инкубации (0 и +37С) на устойчивость эритроцитов к замораживанию в присутствии не проникающего крио-протектора (ПЭО-1500)
В отличие от других типов клеток (например,микроорганизмов) холодовой шок эритроцитов развивается в гипертонических условиях (0,8-1,2 М rfaCL) [250].На повышение тоничности среды,эритроцит реагирует как трехмерная система.изменяя свой объем и форму [ 1711, причем температура может регулировать эти процессы,влияя на структуру мембраны [99]. В отличие от молекулярных изменений двумерного липидного матрикса,влияющих преимущественно на состояние интегральных белков,изменение объема и формы клетки связано, прежде всего, с модификацией периферического белкового цитоскеле-та,формирующего непрерывную сеть на цитоплазматической стороне мембраны [99,171]. Это означает,что холодовой шок эритроцитов ассоциирован с изменениями структуры цитоскелета,развивающимися на начальных этапах гипертонической инкубации.В условиях гипер -тонии изменение структуры цитоскелета проявится в определенной направленности трансформации клеточной формы.
С помощью фазово-контрастной микроскопии мы проанализировали изменения формы эритроцитов.вызванные 10-минутной инкубацией при +37С в растворах //аСЬ различной концентрации (0,I5-I%0 М). В этих условиях повышение концентрации электролита приводит к изменению формы эритроцита от дискоцита к эхиноциту (по классифи -кации Бессиса) [40].Однако,указанный переход наблюдался только в интервале концентраций /Vatb 0,3-0,6 М.При более высокой концентрации формировались сильно деформированные клетки,классификация которых по Бессису затруднена.Поэтому мы оценивали изменения формы клеток на основе анализа структуры их поверхиости,выделяя три группы: 1-клетки с гладкой поверхностью; 2-клетки со спикула-ми (эхиноциты); 3-деформированные клетки со складчатой .Данные, полученные на основе подобной оценки,представлены на рис Л.
При повышении концентрации соли параллельно с уменьшением количества клеток с гладкой поверхностью (дискоциты),наблюдаемым в интервале концентраций 0,15-0,6 М //"act- происходит увеличение количества эхиноцитов.В области концентраций 0,5-0,8 М ffatb наблюдается появление значительного числа эхиноцитов с максимумом при концентрации Matt,.равной 0,6 М.При повышении концентрации /]futV ,выше 0,6 М наблюдается появление деформированных клеток со складчатой поверхностью,а также округлых уплощенных клеток с гладкой поверхиостью.При дальнейшем увеличении тоничности наблюдается только рост числа клеток последнего типа.Таким образом,из представленных данных следует,что направленность изменений формы клеток в условиях гипертонической инкубации при +37С охватывает переход дискоцит- эхиноцит - кренированный диск—»уплощенные клетки с гладкой поверхностью .Для данных условий не совсем ясны причины появления кренированных дисков .Важное значение для ана -лиза изменений формы в гипертонических условиях должно быть отведено сопоставлению конкретных этапов трансформации клетки с изменениями ее обьема.Поэтому,в тех же условиях мы произвели ана -лиз изменений клеточного объема (оценку которого производили по гематокриту) (рис.2).
Проведенные эксперименты показали,что в исследуемом интервале концентраций электролита изменения объема совпадают с изменением числа клеток с гладкой поверхностью (рисЛа).Это особен -но характерно для интервала концентраций 0 15-0,6 М rtatb . Выше этой концентрации наблюдается некоторое увеличение гематокрита, однако,не ясно,как этот процесс связан с появлением плоских гладких клеток.
Появление различных клеточных форм,включая переходные,может играть существенную роль в механизме гипертонической сенсибилизации клеток к холодовому шоку.Соотношение клеток с той или иной формой и соответственно с различным уровнем модификации цитоске-лета может оказать влияние на холодовую чувствительность популяции при данной тоничности среды.В связи с этим существенный ин -терес представляет выявление как наиболее чувствительной,так и устойчивой к охлаждению фракции клеток. При анализе изменений морфологии клеток мы обнаружили три области концентраций ЛгаС-,для которых характерен переход от одной клеточной формы к другой: І) в интервале концентраций 0,2--0,5 UtfoCl практически завершается переход дискоцитов в другие формы; 2) в области -0,,3-0,7 М /VaCt наблюдается образование и дальнейшая трансформация эхиноцитов,причем,в интервале концентраций 0-,5-0-,8 М rfatt формируются кренированные диски; 3) при более высоких концентрациях (0,6-1 0 М tfa&L ) наблюдается образование плоских гладких и складчатых форм.
Для того,чтобы выявить взаимосвязь между характером реорганизации формы эритроцитов и их чувствительностью к холодовому шоку мы определяли величину гемолиза после охлаждения клеток от +37 до 0С в присутствии различных концентраций t/att (в интервале 0,15-1 0 М). Как видно из данных, пред ставленных на рис.3,клетки начинают гемолизировать при повышении концентрации Matt выше 0:,б М.При сопоставлении данных, пред став ленных на рис Л и рис.3 видно,что уровень холодового гемолиза коррелирует с количеством плоских гладких клеток,формирующихся на этапе гипертонической инкубации .
В зависимости от тоничности среды,ее состава и температуры реакция клеток на уменьшение объема в условиях гипертонии будет различной,что проявится в изменении характера и направленности трансформации клеточной формы.
