Содержание к диссертации
Введение
1. Агрегация эритроцитов 12
1.1. Основные понятия 12
1.2. Механизмы агрегации эритроцитов 12
1.3. Физические и биологические параметры влияющие на агрегацию 14
1.3.1 Внутренние факторы крови 14
1.3.2 Внешние факторы действующие на кровь 16
1.4. Механизмы агглютинации эритроцитов 17
1.4.1 Силы взаимодействия между реагентами иммунологических реакций 18
1.5. Экспериментальные методы 20
1.5.1 Микроскопические методы 22
1.5.2 Седиментационные методы 22
1.5.3 Центрифугационные методы 23
1.5.4 Вискозиметрические методы 23
1.5.5 Оптические и ультразвуковые методы 24
1.6 Основные результаты и выводы 24
2. Изучения агрегации эритроцитов in vitro методом упругого светорассеяния 26
2.1. Оптические свойства крови 26
2.2. Классификация методов аппроксимирующих упругое рассеяние света форменными элементами крови 31
2.3. Нефелометрические измерения 39
2.3.1. Нефелометрические измерения суспензий латекса 40
2.3.2. Нефелометрические измерения суспензий эритроцитов человека in vitro 43
2.3.3. Нефелометрические измерения процесса агрегации эритроцитов человека in vitro 47
2.4. Выводы 56
3. Усиление агрегации эритроцитов in vitro с помощью ультразвука 59
3.1. Оптимизация условий регистрации и пробоподготовки экспериментов по регистрации агрегации эритроцитов человека in vitro 60
3.1.1. Выбор источника и приемника излучения 61
3.1.2. Выбор реакционного сосуда 63
3.1.3. Анализ возможных оптических схем 65
3.2 Подбор оптимальных параметров пробоподготовки экспериментов по регистрации агрегации эритроцитов человека in vitro 72
3.2.1 Регистрация процессов агглютинации эритроцитов фотометрическим способом без усиления внешними сдвиговыми силами 72
3.2.2 Выбор внешней сдвиговой силы для усиления агглютинационных процессов 75
3.2.3 Оптимизация пробоподготовки и методики проведения регистрации агглютинационных процессов усиленных УЗ с помощью фотометрического метода 79
3.3 Основные результаты и выводы 90
Глава 4. Интерпретация экспериментальных данных 94
4.1 Построение теоретической модели 94
4.1.1. Движение клеток крови в поле стоячей УЗ волны 94
4.1.2. Кинетика комплексообразования в процессе агрегации и агглютинации эритроцитов челоека in vitro 102
4.1.3. Оценка седиментационых процессов за время инкубации реакционной среды после окончания воздействия на нее ультразвука.. 110
4.1.4. Оценка величины отклика фотоприемника при фотометрическом методе наблюдения за агглютинационными процессами 114
4.2. Сопоставление теоретических и экспериментальных результатов 115
4.3. Основные результаты и выводы 120
Заключение 121
Литература 126
- Физические и биологические параметры влияющие на агрегацию
- Классификация методов аппроксимирующих упругое рассеяние света форменными элементами крови
- Подбор оптимальных параметров пробоподготовки экспериментов по регистрации агрегации эритроцитов человека in vitro
- Оценка величины отклика фотоприемника при фотометрическом методе наблюдения за агглютинационными процессами
Введение к работе
Актуальность темы
Одной из важных медицинских проблем является повышение надежности диагностических методов, основанных на явлении специфического взаимодействия антигенов и антител. Как известно, широкое распространение в практической иммунологии получили методы, основанные на контакте препаратов антител и антигенов, и наблюдение тем или иным способом образовавшихся комплексов антиген-антитело. Однако традиционные методы обнаружения иммунологических реакций зачастую требуют значительного времени, большого расхода исходных компонентов или требуют сложной методики пробоподготовки [1].
Агглютинация (склеивание) клеток in vitro (в пробирке), как результат иммунного процесса по принципу "антиген-антитело", лежит в основе многих медицинских диагностических методик и биологических исследовательских тестов. Среди методов регистрации процесса агглютинации наиболее информативными и часто используемыми на практике являются оптические. Такие как, например, фотометрический [2-4], нефелометрический [5-7] и флуоресцентный [8-9] методы. По сравнению с другими классическими методами регистрации процессов агглютинации клеток (например: центрифу-гационные, седиментационные и вискозиметрические методы), оптические методы обладают рядом преимуществ:
высокая абсолютная чувствительность [10];
при измерении не требуется сложная методика пробоподготовки;
позволяет получать информацию без воздействия, приводящего к изменению образца;
оптическая аппаратура малоинерционна и удобна для непрерывной регистрации как in vivo (в организме), так и in vitro, что позволяет следить за изменением состояния биологических суспензий, происходящим за короткие промежутки времени.
Иногда, в патологических случаях, наблюдаемое специфическое взаимодействие антигенов и антител может идти со слабой агглютинационной способностью реагентов. В этом случае уровень разрешающей способности большинства методов может оказаться недостаточным для уверенной регистрации агглютинационного процесса.
Поэтому повышение чувствительности методов анализа иммунного процесса, сокращение времени проведения диагностического теста являются актуальными задачами, как с биомедицинской точки зрения, так и аппаратурной.
Настоящая диссертационная работа посвящена повышению чувствительности, разрешающей способности (отношение величины отклика фотоприемника при специфической реакции агглютинации к величине отклика при спонтанной реакции агглютинации) фотометрического метода регистрации процесса агглютинации клеток, усиленного с помощью ультразвукового излучения.
В качестве экспериментального материала выбраны нормальные эритроциты человека и изогемоагглютинирующая сыворотка крови человека (агглютинины системы АВО групповой принадлежности крови), так как доступность этих материалов делают их удобным объектом для изучения.
Целью настоящей диссертационной работы является: увеличение разрешающей способности оптических методов регистрации процессов агглютинации эритроцитов человека с агглютининами системы АВО групповой принадлежности крови in vitro усиленных в поле стоячей ультразвуковой волны.
Задачи решаемые в работе:
Экспериментальный анализ возможности увеличения разрешающей способности фотометрического и нефелометрического метода регистрации процессов агглютинации эритроцитов человека in vitro с помощью стоячей ультразвуковой волны;
Оптимизация параметров выбранной оптической схемы, методики пробо-подготовки и методики проведения реакции агглютинации эритроцитов in vitro с целью увеличения разрешающей способности метода;
Построение, для интерпретации полученных экспериментальных данных, теоретической модели, которая позволяет моделировать экспериментально регистрируемые величины отклика фотоприемника в зависимости от:
скорости расслоения суспензии клеток в поле стоячей УЗ волны (в зависимости от начального количества эритроцитов в единице объема и вязкости клеточной суспензии);
кинетики образования как спонтанных, так и вынужденных эритроцитар-ных комплексов (в зависимости от начальных концентраций реагентов, вязкости среды);
седиментационных процессов за время инкубации (после окончания УЗ воздействия).
Научные результаты и положения выносимые на защиту:
При воздействии на реакционную смесь поля стоячей ультразвуковой волны создаются условия значительно ускоряющие агглютинационые процессы в суспензии форменных элементов крови. Это приводит к увеличению разрешающей способности фотометрического и нефелометриче-ского методов регистрации реакции агглютинации эритроцитов на несколько порядков.
Расчет кинетики спонтанного и индуцированного комплексообразования в ходе реакции агглютинации эритроцитов in vitro, учитывающий влияние на динамику распределения эритроцитарных комплексов поля стоячей ультразвуковой волны, поливалентности реагентов и их агглютинацион-ной способности.
Комплекс алгоритмов и программ, позволяющий моделировать экспериментально регистрируемые величины отклика фотоприемника, при регистрации процессов агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическими
7 и нефелометрическими методами, с учетом времени ультразвукового воздействия, процессов седиментации, глубины процесса комплексообразо-вания.
Научная новизна и практическая значимость работы:
экспериментально показано, что, в случае слабовыраженной агглютина-ционной способности крови, такие стандартные методы регистрации реакции агглютинации эритроцитов человека in vitro как фотометричесские и нефелометрические дают уровень разрешающей способности недостаточный для уверенной регистрации этого процесса;
впервые применен на практике и теоретически описан механизм усиления процессов агглютинации эритроцитов человека in vitro в поле стоячей ультразвуковой волны с последующей их регистрацией фотометрическим методом;
экспериментально подобраны оптимальные параметры оптических схем регистрации, методики пробоподготовки и методики проведения теста по наблюдению за процессом агглютинации эритроцитов человека in vitro, усиленного с помощью ультразвукового воздействия, с целью получения максимальной разрешающей способности; экспериментально показано, что полученного выигрыша в разрешающей способности метода вполне достаточно для уверенной регистрации слабо выраженной реакции агглютинации (на примере специфического взаимодействия эритроцитов человека и агглютининов системы АВО групповой принадлежности крови in vitro), где чувствительности большинства стандартных методов явно не хватает;
адаптирован алгоритм кинетики консекутивно - конкурентных реакций к расчету динамики комплексообразования в ходе агтлютинационных процессов эритроцитов человека in vitro с учетом воздействия на реакционную смесь поля стоячей ультразвуковой волны; это позволяет вычислять динамику распределения по размерам эритроцитарных комплексов во
8 времени с учетом поливалентности реагентов и их агглютинационной способности, что, в свою очередь, позволяет обладая данными о валентности и агглютинационной способности реагентов (в данной диссертационной работе это нормальные эритроциты человека и агглютинины системы АВО групповой принадлежности крови) оптимизировать подбор исходных концентраций реагентов для получения максимальной разрешающей способности метода регистрации процесса агглютинации и сокращения времени теста;
разработан комплекс алгоритмов и программ для моделирования экспе
риментально регистрируемых величин отклика фотоприемника при реги
страции процессов агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическими
и нефелометрическими методами с учетом воздействия на реакционную
смесь поля стоячей ультразвуковой волны.
Апробация работы:
Материалы, изложенные в диссертации, докладывались на следующих конференциях и симпозиумах:
6th International Conference on Laser Application in Life Sciences. Jena, Germany. 1996.
Международная конференция: Проблемы и перспективы прецизионной механики и управления в машиностроении. Саратов, Россия. 1997.
Biomedical Optics*98: Nonlinear Dynamics and Structures in Biology and Medicine: Optical and Laser Technologies. San Jose, USA. 1996.
Biomedical Optics'98: Coherence domain optical methods in biomedical science and clinical application II. San Jose, USA. 1998.
Biomedical Optics'99: Coherence Domain Optical Methods in Biomedical Science and Clinical Applications III. San Jose, USA. 1999.
Публикации:
9 По материалам диссертации опубликовано 14 работ (4 статьи в журналах, 3 статьи в межвузовских научных сборниках, 3 статьи в сборниках трудов научных конференций и 4 тезисов докладов) в отечественных и зарубежных изданиях.
Структура и объем работы:
Диссертация состоит из введения, основной части, содержащей 4 главы, заключения и списка цитируемой литературы.
Первая глава посвящена описанию процесса агрегации эритроцитов in vitro» включающему описание механизмов спонтанной агрегации и индуцированной агглютинации эритроцитов in vitro, физических и биологических параметров влияющих на эти процессы. Кратко рассмотрены основные методы регистрации агрегационных процессов эритроцитов in vitro.
Вторая глава посвящена изучению агрегации эритроцитов in vitro методом упругого светорассеяния. Рассмотрены оптические свойства объекта исследования - клеток крови человека. Коротко рассмотрены основные методы аппроксимирующие упругое рассеяние света форменными элементами крови. Представлено описание гониофотометрической установки, использовавшийся для измерения индикатрис однократного и многократного рассеяния исследуемых объектов. Дано описание нефелометрических измерений тестовых объектов — частиц латекса. Проведенные нефелометрические исследования тестовых частиц латекса с размерами 0,37 и 1,00 мкм, показали, что чувствительности гониофотометрической установки достаточно для регистрации процессов агглютинации эритроцитов человека in vitro. Также дано описание нефелометрических измерений разбавленных суспензий клеток крови и их агрегатов. Исследована зависимость индикатрисы рассеянного света от количества форменных элементов крови в единице объема в широком диапазоне концентраций (0,05 — 3,1 % от цельной крови). Показано, что для на-
10 блюдения за процессами, связанными с изменением количества клеток в единице объема (например, из-за их осаждения) наиболее выгодными для наблюдения являются следующие угловые диапазоны: от 0 до 10 или больше 110. Сравнение индикатрис рассеянного света от сильно разбавленных суспензий агрегированных и неагрегированных эритроцитов показало, что на всем угловом диапазоне различие между регистрируемыми оптическими сигналами не превышает 200%. Показана возможность качественного восстановления распределения частиц по размерам с помощью нефелометриче-ских измерений разбавленных суспензий клеток крови и их агрегатов.
Третья глава посвящена усилению агрегации эритроцитов in vitro с помощью поля стоячей ультразвуковой волны. Проведен подбор оптимальных параметров регистрации и пробоподготовки экспериментов по регистрация агрегации эритроцитов человека in vitro. Выполнен анализ нескольких возможных оптических схем для фотометрических и нефелометрических измерений агрегации эритроцитов человека. Показано, что разрешающая способность метода (отличие регистрируемых сигналов от спонтанной и индуцированной реакций агглютинации эритроцитов) может достигать, в лучших случаях, нескольких порядков. Проведен анализ методики пробоподготовки, включающий в себя подбор оптимального времени воздействия ультразвукового поля на реакционную смесь и выбор оптимального разведения исходных реагентов реакции агглютинации.
В четвертой главе построена теоретическая модель, позволяющая моделировать экспериментально регистрируемые величины отклика фотоприемника при регистрации процессов агглютинации эритроцитов in vitro фотометрическими и нефелометрическими методами с учетом воздействия на реакционную смесь поля стоячей ультразвуковой волны.
Она позволяет учитывать такие начальные параметры как скорость расслоения суспензии клеток в поле стоячей УЗ волны в зависимости от началь-
11 ного количества эритроцитов в единице объема и структурной вязкости клеточной суспензии; кинетику образования как спонтанных, так и вынужденных эритроцитарных комплексов в зависимости от начальных концентраций реагентов, констант ассоциации и вязкости среды; седиментационные процессы за время инкубации (после окончания УЗ воздействия).
Полученные теоретические данные хорошо совпадают с имеющимися экспериментальными данными, что говорит об адекватности построенного модельного приближения.
В заключении кратко перечислены основные результаты и выводы работы.
Физические и биологические параметры влияющие на агрегацию
Состав плазмы. В общих чертах можно утверждать, что чем больше моле кулярный вес белков плазмы крови, тем выше эффективность агрегации. Са ма структура белка также важна. Гибкая цепевидная структура более благо приятна для образования агрегатов, чем более компактная шаровидная структура. Следовательно, любое увеличение фибриногена, а2 макроглобулина или концентрации IgM повышает агрегацию. Кроме того, нужно обращать внимание на наличие пара- и криопротеинов, присутствие которых приводит к образованию агрегатов, способных противостоять, в отличие от обычных, значительным сдвиговым силам. Недавно было продемонстрировано, что фракции липопротеинов также влияют на агрегацию эритроцитов in vitro [17]. Аналогичные результаты были получены при исследовании влияния LDL-Apheresis на агрегацию эритроцитов [18]. Также нужно иметь в виду, что на агрегацию эритроцитов также влияет изменение концентрации любого белка плазмы крови, ионной силы и состава электролитов плазмы, величины рН и многие другие факторы. Агрегационность эритроцитов. Физиологически нормальный rouleaux может сформироваться только при условии того, что эритроциты обладают гибкостью для создания достаточно больших контактных областей.
Любое уменьшение деформируемости эритроцитов уменьшает способность к формированию агрегатов [19]. Следовательно, такие явления как уменьшение отношения площади мембраны к объему эритроцитов, увеличение концентрации или повышение вязкости гемоглобина, уменьшение деформируемости мембраны клеток или изменение формы эритроцитов всегда создавали затруднения процессу агрегации и в большинстве случаев приводили к уменьшению размеров агрегатов. Также любые электрические или стериче-ские изменения на поверхности эритроцитов влияют на процесс агрегации. Например, уменьшение суммарного заряда мембраны с помощью Neuraminidase усиливает агрегацию эритроцитов [20]. Концентрация эритроцитов. Вероятность вступления эритроцита в контакт с другими эритроцитами, естественно, зависит от их концентрации. Оптимум достигается при величине гематокрита равной 0,35 [21 75]. При дальнейшем увеличении концентрации клеток крови наблюдается тенденция к постепенному уменьшению агрегации. Агрегаты можно легко наблюдать с помощью обыкновенного оптического микроскопа. В этом случае агрегаты сформированы в статических условиях (при отсутствии потока). Если клетки находятся в потоке со скоростью сдвига (удвоенная скорость деформации [22]) около 0,5 с"1 [23], то наблюдается усиление агрегации. Этот факт можно объяснить увеличением числа столкновений между эритроцитами в потоке. При более высоких показателях скорости сдвига увеличивается и напряжение сдвига (сила, отнесенная к некоторой площади), которое мешает формироваться агрегатам.
При напряжении сдвига выше 2 Н/м [23] физиологически нормальные агрегаты полностью разрушаются. Следовательно, любые внешние воздействия, приводящие к изменению числа столкновений между эритроцитами, влияют на процесс агрегации эритроцитов. К таковым можно отнести, например, электрические [24], магнитные [25] и ультразвуковые поля [26]. Кроме того, нужно принимать во внимание такие параметры как температура или вязкость плазмы. Влияние температуры на процесс агрегации достаточно сложно предсказать [27]. Так, с одной стороны сила притяжения увеличивается с уменьшением температуры, а с другой стороны увеличивается вязкость плазмы, что в свою очередь уменьшает скорость агрегации. Кроме обратимой агрегации в виде монетных столбиков (rouleaux), в патологических ситуациях наблюдается практически необратимое склеивание эритроцитов в кучки неправильной формы - агглютинация (рис.1 Л (справа)). Агглютинация эритроцитов осуществляется за счет антигенных групп на их поверхностной мембране под влиянием агглютининов: либо нормально присутствующих в несовместимой донорской плазме (агглютинины системы АВО групповой принадлежности крови и др.), либо появляющихся в плазме при иммунизации чужеродными эритроцитами. Т.е. процесс агглютинации эритроцитов можно отнести к иммунологической реакции, где в роли антител выступают агглютинины (по большей части относящиеся к макромолекулам), а антигенами являются сами эритроциты (точнее антигенные группы -своеобразные антенны, встроенные в мембрану эритроцита). Силы, связывающие эритроциты в результате такой "специфической" реакции агглютинации, на порядок выше, чем при рассмотренной выше "неспецифической" агрегации. Рассмотрим подробнее причину этого явления.
Сразу же следует подчеркнуть, что силы, удерживающие вместе антиген и антитело, принципиально ничем не отличаются от сил, участвующих в так называемых неспецифических взаимодействиях, которые возникают между любыми двумя белками или другими макромолекулами. Эти межмолекулярные силы можно разделить на четыре группы [28]. Электростатические силы: эти силы обусловлены притяжением между двумя противоположно заряженными ионизированными группами, например аминогруппой NH лизина, входящего в состав одного белка, и карбоксильной группой СОО глютаминовой кислоты, входящей в состав другого белка.
Сила притяжения F обратно пропорциональна квадрату расстояния между зарядами d: F l/kod , где 1 - диэлектрическая постоянная. Кроме того, поскольку диэлектрическая постоянная воды очень высока, удаление молекул воды из пространства, разделяющего взаимодействующие аминокислотные остатки, должно приводить к значительному увеличению F. Диполи, расположенные на поверхности антитела и антигена, также должны притягиваться друг к другу. Электростатические взаимодействия могут возникать и в результате переноса заряда между антителом и антигеном. Так, например, аминокислотный остаток, служащий донором электронов (скажем, триптофан), может отдавать электрон химической группе - акцептору электронов (скажем, динитрофенилу). В результате антитело приобретет заряд +1, а антиген -1. Водородные связи: образование слабых водородных связей между гидрофильными группами, такими, как ОН, NH2 и СООН, зависит, прежде всего, от пространственного сближения молекул, несущих эти группы. Водородные связи относительно слабы, поскольку они имеют чисто электростатическую природу. Тем не менее, удаление молекул воды из среды, в которой находятся взаимодействующие боковые группы аминокислот, значительно увеличи
Классификация методов аппроксимирующих упругое рассеяние света форменными элементами крови
Из-за сложности реализации точной теории для клеточных систем, отсутствии отработанной методики ее расчетов и универсальных алгоритмов большинство исследователей, занимающихся изучением взаимодействия излучения с биологическими частицами, оптимизацией оптического эксперимента, вынуждены обращаться к приближенным методам решения - часто единственно доступным для них инструментам познания. Однако многие аппроксимации имеют существенные ограничения на форму и размер исследуемых частиц или ее относительный показатель преломления (отношение показателя преломления исследуемой частицы к показателю преломления среды, в которой она находится). В этих методах светорассеивающую среду в основном представляют в виде совокупность однородных сфероидов (эллипсоидов вращения). Это имеет определенный смысл, ибо многие клетки по форме напоминают шары или эллипсоиды, а, варьируя соотношение осей эллипсоида, можно получить палочкообразные, доскообразные и шарообразные частицы. Вторым важным ограничением применимости этих методов является оптическая «мягкость» объектов исследования, то есть относительный показатель преломления исследуемой частицы близок к единице. В нашем случае, отношение показателя преломления эритроцита (1,42) к показателю преломления физиологического раствора (1,34) равно 1,06. Наиболее адекватными и простыми аппроксимациями, предсказывающими светорассеяние биологическими взвесями и позволяющими значительные упрощения в расчетах, являются методы Релея-Ганса-Дебая и аномальной дифракции. Метод аномальной дифракции Название этого метода весьма условно, т.к. на самом деле это ничто иное, как сочетание геометрической оптики со скалярной теорией дифракции.
С помощью геометрической оптики рассматривается луч падающий на поверхность частицы, который частично отражается и частично преломляется. Подобное же разделение на преломленный и отраженный луч происходит, когда преломленный луч снова достигает поверхности: часть его преломляется и выходит из частицы, тогда как другая часть испытывает внутреннее отражение. Так продолжается до бесконечности. В результате энергия падающего луча определенным образом распределяется среди выходящих лучей. Если такой расчет провести для всех лучей, падающих на частицу, и результаты сложить, мы получим диаграмму рассеяния, соответствующую законам геометрической оптики. Лучи, проходящие вне частицы, образуют фронт плоской волны, часть которого, по форме и размеру соответствующая геометрической тени частицы, теряется. Согласно принципу Гюйгенса, эта неполнота волнового фронта приводит к появлению в дальней зоне наблюдения определенного углового распределения интенсивности, известного под названием картины дифракции Фраунгофера. В ней распределение интенсивности зависит от формы и размера частицы, но не зависит от ее строения или природы ее поверхности [56].
Если сложить интенсивности, полученные с помощью геометрической оптики и скалярной теории дифракции, с учетом интерференции, то получим индикатрису рассеяния в приближении аномальной дифракции. Оптическая "мягкость" большинства биологических систем делает возможным использование этого метода и в диапазоне размеров частиц сравнимых с длиной волны (в котором и лежат форменные элементы крови) [57]. В приближении Релея-Ганса-Дебая (РГД) поле внутри частицы принимается равным полю падающей волны, без учета искажений волнового фронта, возникающего за счет разницы показателей преломления среды и частицы. Для применимости такого приближения необходимо, чтобы показатель преломления вещества, составляющего частицу, мало отличался от показателя преломления среды, или, другими словами, частица должна быть оптически мягкой: ш-11«1, где m - относительный показатель преломления. Второе ограничение накладывается из условия, что набег фазы волны при прохождении через частицу за счет разницы показателей преломления должен быть много меньше единицы: m-l jkd«l, здесь d - характерный диаметр частицы. Физическое обоснование рассеяния РГД очень простое: каждый элемент объема дает рэлеевское рассеяние независимо от других элементов объема. Так как излучения разных элементов при этом когерентны, то волны, рассеянные ими, интерферируют между собой и частично гасят друг друга из-за различия положения элементов в пространстве. Таким образом, в приближе ний РГД задача определения характеристик рассеяния сводится к нахождению так называемого фактора внутренней интерференции G(0,cp) [58]: где о — фазовый сдвиг луча некоторого элементарного объема рассеивателя в направлении Э,ф, Простота и адекватность, по сравнению с точными методами, привели к широкому использованию метода РГД для анализа многих экспериментов [59]. В природе однородные сферические частицы представляют собой скорее исключения, чем правило. Поэтому бьшо разработано множество методов для определения поглощения и рассеяния на несферических частицах с учетом внутренней структуры клеток. Метод дискретных диполей В принципе решение задачи рассеяния на произвольной частице может быть найдено путем вычисления дипольного момента, наведенного на каждом ее атоме падающем полем и полем, создаваемым всеми остальными атомами.
Однако даже в маленькой частице (=1 мкм) содержится более 100атомов; следовательно, нужно решить систему уравнений из такого же числа уравнений, что представляет собой трудную задачу. Парселл и Пенни-пакер [60] воспользовались методикой этого подхода, но сократили ее до более реальных пределов. Частица делится на небольшое число элементов, каждый из которых содержит большое количество атомов, но еще достаточно мал, чтобы его можно было рассматривать как дипольный осциллятор. Полное рассеянное поле представляет собой сумму всех этих дипольных полей. Современные достижения в области применения приближения дискретных диполей (ПДД) к задачам рассеяния электромагнитного излучения на объектах произвольной формы проанализированы в работе Дрейна [61]. По
Подбор оптимальных параметров пробоподготовки экспериментов по регистрации агрегации эритроцитов человека in vitro
Первоначально пробоподготовка проводилась по стандартному методу определения группы крови прямой реакцией. Эритроцитарная масса донорской крови разводилась стандартной сывороткой в соотношении 1:10 без добавления физиологического раствора, приготовленная таким образом суспензия заливалась в кювету и ставилась под луч лазера установки (рис. 3.3). В случае положительной реакции агглютинации, образовавшиеся крупные эритроцитарные комплексы выпадали в осадок, что приводило к увеличению уровня фотоэлектрического сигнала. В противном случае (отрицательноаяя реакция - когда к эритроцитам человека добавлялась изогемоагглютини-рующаяя сыворотка, не приводящая и индуцированной агглютинации [49]) комплексообразование не наблюдалось, и эритроциты крови находились во взвешенном состоянии, при этом за счет рассеяния света уровень регистрируемого фотоэлектрического сигнала оказывался значительно ниже. Время, необходимое для протекания, реакции составляет величину порядка 10 минут. За это время крупные эритроцитарные комплексы (образовывающиеся только в случае положительной реакции агглютинации) успевают покинуть зону наблюдения, а слабые эритророцитарные комплексы и свободные эритроциты (составляющие большинство в случае отрицательной реакции агглютинации) еще нет.
Полученные численные результаты, сведенные в (табл. 3.2) и представленные на (рис. 3.6), соответствуют уровням фотоэлектрического тока фотодиода измеренного именно на 10-й минуте протекания реакции. По полученным результатам можно сделать предварительные выводы. Реакции можно разделить не только на положительные и отрицательные, но и на сильно выраженные и слабо выраженные (табл. 3.1). Параллельно проведенные для контроля микроскопические наблюдения за процессом агглютинации эритроцитов in vitro показали, что в случае положительных реакций, для которых величина регистрируемого фотоэлектрического сигнала достигала наибольших значений 50 — 60 мВ (табл. ЗЛ), образовавшиеся эритроцитарные комплексы имеют значительно большие размеры, чем в случае слабо выраженных положительных реакций, когда аналогичные регистрируемые величины достигают значения 6—10 мВ. В этом случае, хотя эритророцитарные комплексы в кювете и образовывались, но их малые размеры, а также достаточно высокая вязкость суспензии не позволяют этим комплексам выпасть в осадок за время регистрации. Из анализа полученных экспериментальных данных (табл. 3.2 и рис. 3.6) следует, что при данной методике пробоподготовки достигнуть уверенного различия, между наблюдаемыми фотометрическим методом индуцированными и спонтанными агтлютинационными процессами, не представляется возможным.
Одной из мер повышения чувствительности метода для регистрации слабых положительных реакций агглютинации является понижение вязкости суспензии путем разведения физиологическим раствором. Эксперименты показали, что при разведении эритроцитарной массы в несколько десятков раз слабые положительные реакции начинают проявляться более отчетливо, но при этом оптимальное время наблюдения за реакцией агглютинации возрастает с 10 до 30 минут (рис. 3.7), что нежелательно. Выходом из сложившегося положения является, описанное выше, уменьшение вязкости суспензии при уменьшении времени наблюдения за реакцией агглютинации. Добиться этого можно только при наличии внешних сдвиго вых сил, с помощью которых можно добиться уменьшения расстояния между клетками крови, что в свою очередь приведет к ускорению процесса ком-плексообразования. Одним из распространенных способов повышения концентрации эритроцитов в единице объема является центрифугирование [21,37-38]. В этом случае на клетки крови действуют центробежные силы, возникающие в процессе вращения сосуда. Однако наш метод регистрации, основанный на измерении интенсивности лазерного луча, прошедшего через надосадочный слой жидкости в горизонтальной плоскости реакционного сосуда, а также реакционный сосуд в форме прямоугольной кюветы конструктивно плохо сочетается с центрифугой. Кроме того, центрифугирование предполагает регистрацию реакции на конечной фазе, когда комплексообразование завершилось и образовался осадок на дне сосуда. Выбранный метод регистрации позволяет судить о характере реакции аглютинации в любой момент времени, т.е. отслеживать динамику процесса. Поэтому, в качестве внешней сдвиговой силы, была выбрана радиационная сила давления, возникающая при образовании стоячей ультразвуковой волны. Однако, помимо очевидного выигрыша в скорости комплексообразо-вания, не следует забывать о достаточно хорошо изученном действии ультразвука на многие биологические объекты [89,90], и в частности на клетки крови [91-93]. Как следует из результатов экспериментов, ультразвук достаточно большой мощности приводит к разрушению эритроцитов (гемолизу), что в данном случае не желательно. Действие ультразвука меньшей интенсивности (0,05 + 3,0 Вт/см2) на клетки приводит, по-видимому, к другому эффекту - с поверхности клеток снимается часть антигенов, меняется их поверхностная антигенная структура, а жизнеспособность клеток не снижается. Возможность такого механизма действия ультразвука на клетки была предложена и косвенно подтверждена в работе [94]. Подтверждением наличия такого механизма являются результаты [91,93]. В [93] показана возможность изменения антигенной активности эритроцитов человека под действием на них ультразвука, а в [91] — избирательность действия ультразвука малой и средней интенсивности на антигены А и В системы АВО.
При этом остается открытым вопрос о причинах изменения антигенной активности эритроцитов: либо просто срыв поверхностных антигенов, либо срыв сахарных остатков от гликопротеида, либо и то и другое одновременно. В [94] показано, что под действием ультразвука происходит освобождение части антигенов с поверхности эритроцитов. Следовательно, при использовании радиационной силы давления стоячей ультразвуковой волны в качестве внешней сдвиговой силы ускоряющей процесс комплексообразо-вания нужно осторожно подходить к выбору таких параметров как интенсивность ультразвуковой волны и время озвучивания. В качестве источника ультразвука нами использовалась пьезокерамиче-ская пластина, которая запитывалась генератором ультразвука УД-76. Частота Ультразвуковых колебаний составляла величину порядка 2,64 мГц ± 20%. Генератор работал в непрерывном режиме и выдавал мощность не более 1 Вт. Недостатком такого генератора является невозможность варьирования частоты, режима и мощности облучения, таким образом, мы имеем ограниченную возможность выбора, режима ультразвукового воздействия на реакционную смесь. Напряжение, приложенной к пьезоэлектрической керамической пластине (следовательно, ультразвуковая волновая мощность), ограничивалось величинами позволяющими избегать процесса гемолиза (разрушения эритроцитов). Для всех экспериментов и методик пробоподготовки эта величина оставалась постоянной. Время облучения УЗ полем реакционной смеси в разных сериях экспериментов, для определения его оптимального значения, варьировалась в пределах от 20 до 200 секунд. После окончания УЗ воздействия эритроциты и их комплексы с разными скоростями оседали под действием силы тяжести, что приводило к уменьшению количества рас-сеивателей в области наблюдения. Сигнал с фотоприемника регистрировался через 3 минуты после окончания УЗ воздействия на реакционную смесь.
Оценка величины отклика фотоприемника при фотометрическом методе наблюдения за агглютинационными процессами
В связи с тем, что исследуемый нами объект представляет собой сильно концентрированную суспензию частиц, сильно различающихся по размерам, существующие теории однократного рассеяния света не дают удовлетворительного решения задачи. Использование теории многократного рассеяния света дисперсными системами в общем виде требует использования громоздких математических методов и малодоступных физических сведений. Для прохождения нормально падающего света через суспензию эритроцитов в предположении, что практически всё излучение рассеивается в переднюю полуплоскость, при ряде дополнительных упрощений из общей теории следует [74]: где I и 10 — интенсивности прошедшего и падающего световых потоков; С — концентрация рассеивателей; аа и as — сечения поглощения и рассеяния (для эритроцитов, в аппроксимации Ми, они составляют приблизительно 0,1 и 85,9 urn2 [51]); d - толщина рассеивающего слоя, а q описывает долю полной мощности, рассеянную в телесный угол приёма от одиночного рассеивателя. Для теоретического расчета величины q необходимо знание геометрии эксперимента, а также зависимости интенсивности рассеянного света от угла наблюдения. Последнее весьма затруднительно для эритроцитов с учетом их распределения по размерам, форме и ориентациям.
Поэтому при моделировании величина q подбиралась эмпирически, исходя из величин фототоков в начальный момент времени (когда концентрация частиц была достоверно известна) и в конечный момент времени (когда после седиментации клеток их концентрация в наблюдаемом объеме равнялась нулю). Величина q оказалась приблизительно равной 10 . Далее полученная выше зависимость концентрации клеток крови от времени с учётом её изменения за счёт действия УЗ поля и седиментации, подставленная в уравнение (4.16) позволяла оценить динамику просветления среды с течением времени и производить сравнительный анализ с экспериментальными данными. Теоретические результаты и экспериментальные точки для случая, когда межклеточное взаимодействие не носит специфического, иммунного характера, приведены на (рис. 4.66). Кривая 1 и точки 3 отображают теоретические и экспериментальные результаты соответственно для однопроцентного раствора крови, а кривая 2 и точки 4 - для шести процентного. Видно, что до некоторых значений времени действия УЗ поля среда слабо просветляется, а затем скорость просветления резко возрастает. Это можно объяснить следующим образом. Вероятность спонтанного образования прочного и крупного эритроцитарного комплекса довольно мала, она возрастает по мере увеличения концентрации клеток в зонах узловых плоскостей давления УЗ стоячей волны, т.к. увеличивается вероятность соприкосновения мембран клеток. Сопоставление результатов, отображенных (рис. 4.66) показывает, что характерное время, при котором наблюдается резкое увеличение просветления среды, соответствует тому моменту, когда практически все клетки соберутся вблизи узловых плоскостей стоячей УЗ волны.
Дальнейшее действие УЗ поля приводит к ещё более плотной упаковке клеток и, следовательно, увеличению количества крупных клеточных комплексов, которые, быстро седимен-тируя, приводят к наблюдаемому просветлению среды. Стоит заметить, что время, за которое клетки соберутся вблизи узловых плоскостей сильно зависит от начальной концентрации эритроцитов в растворе. Рис. 4.6. (А) Зависимость фототока от времени действия ультразвука при индуцированном образовании эритроцитарных комплексов; (Б) Зависимость фототока от времени действия ультразвука при спонтанном образовании эритроцитарных комплексов. Точки (3) и (4) соответствуют экспериментальным данным, а кривые (1) и (2) получены с помощью построенной теоретической модели, для 1 и 6% суспензий эритроцитов соответственно. Действительно, как видно из эксперимента (рис. 4.66), отличие характерных времен для концентраций крови 1 % и 6 % составляет примерно 2.5 раза, что хорошо согласуется с результатами теоретического моделирования (рис. 4.3). Аналогичные результаты для реакции агглютинации (специфическое, иммунное межклеточное взаимодействие) приведены на (рис. 4.6а). Их сравнение с результатами, отображенными на (рис. 4.66), показывает, что характерное время начала резкого просветления среды значительно меньше, чем в случае спонтанного эритроцитарного комплексообразования. Это отличие можно объяснить следующим образом. В отличие от спонтанного процесса, индуцированная агглютинации интенсивно протекает как во время инкубации исследуемых образцов, так и во время ультразвукового действия. В поле УЗ волны скорость движения эритроцитов и их комплексов сильно зависит от размеров биообъектов (6). Это приводит к уменьшению, по сравнению со спонтанным процессом, времени, за которое большинство эритроцитов соберутся вблизи узловых плоскостей поля стоячей УЗ волны. Строгое описание этого процесса представляет собой довольно сложную задачу, поэтому мы воспользовались приближением, в котором все комплексы имеют некоторый эффективный размер (радиус эффективной сферы). Оценка этого размера методом наименьших квадратов дает приблизительно 5 мкм, что примерно соответствует комплексу из 6 эритроцитов. Естественно, что для случая агглютинации процесс индуцированного комплексообразования, а, следовательно, и седиментации происходит значительно интенсивнее, чем для спонтанного, что сказывается на регистрируемой степени просветления среды. Из (рис. 4.6а) видно, что оно достигает величин в сотни раз больших, чем в предыдущем случае (рис. 4.66). Следует отметить, что в конечном итоге все кривые (рис. 4.6а,б)) насыщаются, что объясняется осаждением практически всех клеток. Величина разрешения К для 1 % и 6 % раствора крови приведена на (рис. 4.7). Колоколообразная форма кривых объясняется тем, что просветление среды для случаев индуцированного и спонтанного процессов комплексооб-разования идёт с разными скоростями (рис. 4.6а,б).
Это различие складывается из двух составляющих. Во-первых, из-за описанной выше разницы в константах ассоциаций для спонтанной и индуцированной реакций агглютинации эритроцитов. А, во-вторых, из-за описанного выше уменьшения времени, за которое суспензия эритроцитов расслаивается под действием стоячей УЗ волны. Этими двумя составляющими можно манипулировать. Скорость индуцированной агглютинации эритроцитов можно увеличить путём подбора оптимального соотношения концентраций изогемагглютинирующей сыворотки и клеток крови. С увеличением времени инкубации суспензии эритроцитов увеличивается глубина реакции агглютинации. Это увеличивает долю крупных эритроцитарных комплексов, что в свою очередь приводит к уменьшению времени расслоения среды а, следовательно, к ускорению процесса её просветления. Однако, зависимость выигрыша в разрешении метода от времени инкубации имеет вид кривой насыщения [83]. Последнее объясняется тем, что увеличение времени инкубации может приводить к состоянию, когда реакция агглютинации практически полностью завершена и дальнейшее увеличение времени инкубации не приводит к существенному изменению распределения эритроцитарных комплексов по размерам. В свою очередь это ведет к уменьшению изменения времени расслоения среды и к насыщению зависимости величины выигрыша в разрешающей способности К от времени инкубации. Уменьшение разрешающей способности метода при больших временах действия УЗ поля (рис. 4.7) также обусловлено разностью скоростей процессов комплексообразования и седиментации. В случае реакции агглютинации практически все клетки крови седиментируют через некоторое время и, следовательно, регистрируемое просветление среды достигает своего максимального значения (рис. 4.6а). В то же время при спонтанном комплексооб
