Содержание к диссертации
Введение
I. Обзор литературы 11
1.1. Амниотическая жидкость: происхождение, функции, состав 11
1.2. Общая характеристика клеток амниотической жидкости 12
1.3. Стволовые клетки из амниотической жидкости 14
1.4. Потенции стволовых клеток амниотической жидкости к дифференцировке in vitro
1.4.1. Остеогенная дифференцировка 17
1.4.2. Адипогенная дифференцировка 20
1.4.3. Хондрогенная дифференцировка 21
1.4.4. Миогенная дифференцировка 22
1.4.5. Дифференцировка в кардиомиоциты 23
1.4.6. Дифференцировка в эндотелиальные клетки 24
1.4.7. Кроветворные клетки 25
1.4.8. Дифференцировка в гепатоциты 26
1.4.9. Дифференцировка в р-клетки поджелудочной железы 27
1.4.10. Нейральная дифференцировка 28
1.5. Трансплантация стволовых клеток амниотической жидкости без
предварительной дифференцировки in vitro 30
1.5.1. Мечение клеток перед трансплантацией 30
1.5.2. Интеграция клеток в ткани почки 31
1.5.3. Интеграция и дифференцировка в клетки эпителия легкого 32
1.5.4. Интеграция СК АЖ в ткани кишечника 32
1.5.5. Интеграция СК АЖ в ткани печени 33
1.5.6. Трансплантация СК АЖ при инфаркте миокарда 33
1.5.7. Трансплантация СК АЖ и мионекроз 35
1.5.8. Трансплантация СК АЖ при повреждении периферических нервов
1.6. Получение индуцированных плюрипотентных клеток из стволовых клеток амниотическои жидкости 36
II. Материалы и методы 39
II. 1. Культивирование клеток из амниотическои жидкости 39
II.2. Сканирующая-электронная микроскопия 40
II.З. Проточная цитофлуориметрия 40
II.4. Иммуноцитохимия 41
II.5. ОТ-ПЦР 43
II.6. Клонирование стволовых клеток амниотическои жидкости 44
ІI.7. Индукция дифференцировок стволовых клеток амниотическои жидкости 46
II.7.1. Индукция остеогенеза 46
II.7.2. Индукция адипогенеза 47
ІІ.7.3. Индукция миогенеза 47 ЇЇ.7.4. Дифференцировка в гепатоциты 47
II.7.5. Дифференцировка в эпидермальные клетки 48
II.8. Культивирование стволовых клеток амниотическои жидкости в трехмерном коллагеновом матриксе 48
II.8.1. Выделение коллагена изхвостов крыс 48
II.8.2 Приготовление коллагенового геля 49
II.8.3. Включение BrdU 49
11.8.4: Электронно-микроскопическое исследование СК АЖ, культивированных в коллагеновом геле 50
II.9. Индукция экспрессии в стволовых клетках амниотическои жидкости молекул главного комплекса гистосовместимости интерфероном-у 51
II. 10. Трансплантация стволовых клеток амниотическои жидкости иммунодефицитным животным 51
III. Результаты исследования 53
III. 1. Культивирование клеток из амниотическои жидкости 53
III.2. Сканирующая электронная микроскопия 55
III.З. Характеристика фенотипа по экспрессии молекулярных маркеров. 56
III.3.1. Иммуноцитохимический анализ 56 III.3.2. Проточная цитофлуориметрия 60
III.3.3. Двойное иммуноцитохимическое окрашивание 63
III.3.4. ОТ-ПЦР 63
III.4. Дифференцировка стволовых клеток амниотической жидкости 65
III.4.1. Остеогенная дифференцировка 65
111.4.2. Адипогенная дифференцировка 67
111.4.3. Эпидермальная дифференцировка 68
III.5. Трансплантация стволовых клеток амниотической жидкости иммунодефицитным животным 69
111.6. Клонирование стволовых клеток амниотической жидкости 71
III.6.1. Морфологическая характеристика клонированных клеток 71
III.6.2. Иммуноцитохимический анализ клонированных клеток 74
III.6.3. Дифференцировка клонированных клеток 75
III.6.3.1 Остеогенная дифференцировка 75
III.6.3.2. Миогенез 76
IIL6.3-.3. Дифференцировка в гепатоциты 77
111.7. Стволовые клетки амниотической жидкости в трехмерном коллагеновом матриксе ! 78
III. 7.1. Культивирование СК АЖ в коллагеновом геле 79
III.7.2. Электронно-микроскопическое исследование СК АЖ, культивированных в геле 81
III.7.3. Иммуноцитохимический анализ СК АЖ, культивированных в геле 82
111.8. Актиновые микрофиламенты в стволовых клетках амниотической жидкости 84
111.9. Индукция интерфероном-у 85
IV. Обсуждение 87
Заключение 104
Выводы 107
Список литературы 108
- Адипогенная дифференцировка
- Иммуноцитохимия
- Индукция экспрессии в стволовых клетках амниотическои жидкости молекул главного комплекса гистосовместимости интерфероном-у
- Морфологическая характеристика клонированных клеток
Введение к работе
Актуальность проблемы. Всестороннее исследование биологии стволовых клеток (СК) представляет большой интерес как для решения фундаментальных проблем биологии развития, таких как детерминация и дифференцировка, так и в связи с перспективами применения СК в регенеративной медицине.
В настоящее время СК выделены практически из всех тканей взрослого организма, из эмбрионов и плодов, а также из внезародышевых тканей (Guillot et ah, 2006; Mosna et al., 2010). К последним относятся и СК из амниотической жидкости (АЖ). Эти клетки способны к длительной пролиферации in vitro и дифференцировке в производные трех зародышевых листков. В отличие от других клеток из экстраэмбриональных структур, например, плаценты или пуповины, которые становятся доступны только после родов, СК АЖ получают в середине беременности (16-23 нед) в ходе амниоцентеза, проводимого для пренатальной диагностики. Эта процедура безопасна для матери и плода. Таким образом, исследование выделенных из АЖ клеток не сопряжено с этическими проблемами, которые неизбежно возникают при работе с эмбриональными СК (ЭСК) человека. При этом попадают СК в АЖ на самых ранних стадиях эмбриогенеза, т.е. эти клетки могут обладать более примитивным статусом, чем СК из плаценты, пуповины, пуповинной крови или дифференцированных тканей взрослого организма.
Обнаружены СК АЖ были недавно и сейчас активно изучаются (In 't Anker et al, 2003; De Coppi et al., 2007a). В настоящее время получено множество данных относительно иммунофенотипа и потенций этих клеток к дифференцировке. Тем не менее, многие из этих данных противоречивы и однозначного определения, к какому типу клеток относить СК АЖ, пока нет.
Целью исследования было изучение фенотипических свойств и дифференцировки стволовых клеток амниотической жидкости человека в условиях in vitro.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
Получить культуры стволовых клеток из амниотической жидкости человека второго триместра беременности;
Охарактеризовать профиль экспрессии маркеров мезенхимных, нейральных и эпителиальных клеток, а также маркеров плюрипотентности в выделенных клетках;
Провести клональный анализ и определить степень гетерогенности популяции клеток из амниотической жидкости;
Оценить потенции стволовых клеток амниотической жидкости к дифференцировке в разные типы специализированных клеток;
Изучить поведение стволовых клеток амниотической жидкости в трехмерном матриксе и оценить их морфогенетический потенциал. Научная новизна и практическая значимость. Впервые выявлено, что СК
АЖ характеризуются коэкспрессией маркеров мезенхимного и эпителиального типов дифференцировки, что отличает их от мезенхимных СК (МСК) из тканей взрослого организма. В условиях культуры эти клетки способны спонтанно и обратимо изменять свою морфологию с мезенхимной на эпителиоподобную.
Впервые показано, что актиновые микрофиламенты формируют в цитоплазме СК АЖ не только типичные для МСК стресс-фибриллы, но и характерный для эпителиальных клеток кольцевой пучок под плазматической мембраной. Таким образом, особенности цитоскелета этих клеток позволяют характеризовать их как клетки смешанного фенотипа.
Впервые получены данные о морфогенетических потенциях СК АЖ, проявляющихся при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки способны образовывать в геле эпителиоподобные структуры - трубочки и цисты. Между СК АЖ выявляются характерные для эпителиальных клеток адгезивные соединения, и одновременно с этим в них сохраняется экспрессия маркеров мезенхимного типа дифференцировки. В совокупности полученные результаты позволили заключить, что выделенные клетки не являются истинно мезенхимными, они проявляют также свойства эпителиальных клеток, т.е. обладают переходным эпителио-мезенхимным фенотипом.
Впервые в культурах СК АЖ выявлены особые межклеточные соединения -нанотрубочки. Через них могут передаваться крупные белковые молекулы и даже целые органеллы.
Полученные данные относительно фенотипических свойств и пластичности СК АЖ свидетельствуют о возможности и перспективности использования этих клеток в клеточных технологиях, в том числе и при лечении некоторых заболеваний in utero или сразу после рождения. Кроме того, СК АЖ могут быть трансфицированы с целью дальнейшего применения в генной терапии.
Результаты настоящего исследования могут быть использованы в курсе лекций по биологии развития и клеточной биологии.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2008, 2009); Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных
технологий» (Санкт-Петербург, 2009); VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009); VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009); XVII и XVIII Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011); III Конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», посвященной памяти академика Н.Г. Хрущева (Москва, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ. Из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 8.
Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных результатов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах, содержит 21 рисунок, 8 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 215 источников.
Адипогенная дифференцировка
Способность к дифференцировке в остеогенном направлении показана для МСК из АЖ мыши (Nadri, Soleimani, 2007), кролика (Steigman et al., 2009), свиньи (Zheng et al, 2011a), козы (Zheng et al, 2011b), собаки (Filioli Uranio et al, 2011), лошади (Lovati et ah, 2011), а также для селектированных no c-kit (Siddiqui, Atala, 2004; De Coppi et al., 2007a) и для неселектированных СК АЖ (Tsai et al., 2004; Steigman et al., 2009) человека. При этом к настоящему времени для СК, выделенных из АЖ третьего триместра беременности, установлен только этот тип дифференцировки (You et al., 2009).
При культивировании СК АЖ в среде с добавлением дексаметазона, Р-глицерофосфата и аскорбат-2-фосфата в них наблюдаются морфологические изменения и возрастает активность щелочной фосфатазы. К 16 дню клетки агрегируют в типичные для кости ламеллярные структуры, в которых выявляются очаги кальцификации, окрашивающиеся по фон Коссу. При дальнейшем культивировании в среде, содержащей факторы, индуцирующие остеогенную дифференцировку, кальцификация усиливается. По данным ОТ-ПЦР анализа экспрессия кодирующего транскрипционный фактор гена cbfal на 8 сут достигает максимума, после чего постепенно снижается на 16, 24 и 32 сут. Экспрессия гена OGN наблюдается в клетках только на 8 сут индукции (Siddiqui, Atala, 2004; De Coppi et al, 2008). В ходе дифференцировки происходят не только измения в профиле экспрессии генов, но- и изменения цитоскелета СК АЖ: постепенно стресс-фибриллы замещаются тонкой сетью актиновых микрофиламентов, что приводит к уменьшению эластичности клетою и характерно для- зрелых остеобластов (Chen etal, 2010b).
При культивировании в условиях, индуцирующих дифференцировку в остеогенном направлении в носителе из коллагена или капролактона, СК АЖ (c-kit+) сохраняют жизнеспособность в течение 4 мес. и продуцируют минерализованный матрикс, количество которого возрастает по мере культивирования (De Coppi et al, 2007a; Peister et al, 2011). После подкожного введеният таких конструкций крысам- СК АЖ продолжают продуцировать минерализованный матрикс и через 4-8 нед после трансплантации. Через 18 нед в зоне введения выявляется плотная костноподобная ткань (De Coppi et al, 2007a; Peister et al, 2009; Maraldi et al, 2011).
Показано, что конструкции с неселектированными СК АЖ (МСК) могут быть использованы для восстановления врожденных дефектов развития грудной» клетки. Трансплантированные кроликам с врожденными аномалиями, они хорошо приживаются и проявляют типичную костную морфологию. Преимущество использования конструкций, созданных на основе СК АЖ, в данном случае сводится к тому, что восстановление дефекта может быть проведено сразу после рождения (Steigman et al., 2009; Kleins al, 2010). стеобластные прогениторные клетки, полученные из АЖ, находят применение в инженерии кранио-фасциальных структур, при этом могут быть использованы титановые носители, которые обладают отличной биосовместимостью с клетками: Для индукции к дифференцировке используют как культивированные СК АЖ, так и свежевыделенные. В последнем случае значительно сокращается; время; дифференцировки: минерализация наблюдается г к 18 сут,. а экспрессия полного спектра-остеогенных маркеров (COM, ONC, OPN, 0CN, OPG, BSP; Runx2) - к 30 сут после получения АЖ. В5случае! использования культивированных СК АЖ для терминальной»дифференцировки требуется 50 сут (Antqnucci et al, 2009а; b);
Дйфференцировка СК АЖ в; остеогенном направлении может быть стимулирована фактором роста ВМР-7 (белок морфогенеза кости-7) (Sun et al, 2010); При создании трехмерных конструкций с использованием нанофибрилловьш носителей . . (имитируют, естественные коллагеновые фибриллы) значительно повышается минерализация матрикса (как in vitro, так и при трансплантации»таких конструкций in vivo) и возрастает экспрессия: специфических генов: OPN, BSP; ОЄИ, RJJNX2; OSX (Sum et al, 2010; Kolambkar et ali, 2010). Кроме того, дйфференцировка МЄК из АЖ человека может быть, вызвана ко-культивированием с остеобластами, полученными из СК пульпы зуба ил и при испо льзовании. кондиционированнош среды: от этих клеток (De Rosa et al., 2011). Усиливать дифференцировку СК АЖ в остеогенном направлении может обработка в первые 2 сут индукции этанолом. Он не оказывает негативного влияния на жизнеспособность клеток и увеличивает экспрессию остеопонтина, активность щелочной фосфатазы и стимулирует аккумуляцию кальция (Hipp et al, 2010). Схожий; эффект вызывает воздействие на клетки на начальных этапах индукции света определенной длины волны (470 нм (синий) или 525 нм? (зеленый)) (Higuchi etal, 2011). .
Неселектированные СК АЖ козы и собаки также способны к дифференцировке в остеогенном направлении: После индукции в клетках появляется экспрессия маркеров остеонектина, остеокальцина (Zheng et al, 2011b) и остеопонтина, а также наблюдается формирование кал ьцификатов (Filioli Uranio et al, 2011).
Адипогенная диф ференцировка Такой тип дифференцировки установлен как для c-kit+ СК АЖ (Siddiqui- Atala, 2004); так и для МСК из АЖ человека (Tsaietf а/, 2004; De Gemmis et al, 2006);a также для неселектированных СК. АЖ козы (Не et al, 2011), лошади (Lovati et ali, 2011)j свиньи (hen e? ah, 2011) и собаки (Filioli Uranio et al., .2011). При культивировании в среде с индукторами адипогенеза (дексаметазон; инсулищ индометацин, изобутилметилксантин) морфологические изменения СК АЖ человека; происходят в течение 8 сут: исходно удлиненные клетки приобретают округлую форму и накапливают липидные включения. После 16 сут культивирования более 95% клеток содержат заполненные триглицеридами; вакуоли;. окрашивающиеся? красителем Oil Red О. По результатам ОТ-ПЦР анализа в индуцированных клетках выявляется экспрессия гена PPAR у2, продукт которого регулирует адипогенез (Siddiqui, Atala 2004; De Coppi et al, 2008).
Дифференцировка неселектированных СК АЖ козы, свиньи; лошади и собаки в адипогенном направлении протекает. в течение 2-3 нед и подтверждается окраской красителем Oil Red-O (Не et al, 2011; Eovati et -al.,. 2011), а также экспрессией специфических генов - PPAR у, С/ЕВРа (Chen et al, 2011), лептин и адипонектин (Filioli Uranio et al, 201.1):.
Иммуноцитохимия
Электронно-микроскопический анализ морфологически гомогенной популяции (пассаж 4) показал, что клетки АЖ образовывали в культуре монослой, было отмечено их наползание друг на друга. Соседние клетки соединялись многочисленными нанотрубочками (рис. 2а), толщина которых составляла 0,02-0,1 мкм. Нанотрубочки могли разветвляться; в части из них обнаруживались везикулярные расширения - «гондолы» (рис. 26). Считается, что они являются зонами межклеточного транспорта (Veranic et al., 2008). Кроме того, на периферии клеточных пластов выявлялись клетки с необычной ламеллоплазмой, по краю которой были видны «грибовидные» утолщения, расположенные на расстоянии 3-5 мкм друг от друга (рис. 2а).
Сканирующая электронная микроскопия, (а) СК АЖ соединяются в культуре многочисленными нанотрубочками (н); (б) везикулярные расширения (в.р.) могут быть признаком межклеточного транспорта; г -«грибовидные» утолщения. Нанотрубочки представляют собой особый тип межклеточных контактов. Через них могут передаваться не только низкомолекулярные соединения, но и крупные, белковые молекулы и даже целые органеллы (например, митохондрии). В этом состоит их отличие от щелевых контактов. Ранее нанотрубочки были выявлены в культурах некоторых типов клеток, таких как иммунные, нервные, кардиомиоциты, т.е. в тех случаях, когда сигнал между клетками должен предаваться очень быстро (Plotnikov et ai, 2008). Мы впервые выявили такой тип соединений в культурах клеток АЖ.
Иммуно цитохимический анализ показал, что клетки АЖ (пассаж 2-3) экспрессировали маркеры MCK (CD105, CD73, STRO-1, CD49d), а также нейральные (Р3-тубулин, нестин, NF, транскрипционный фактор Рахб) и эпителиальные (кератин 19, кератин 18, кератин 7, транскрипционный фактор рбЗ) маркеры (рис. 3, табл. 4, 5). Кератин 14, являющийся маркером ороговевающего эпидермиса, в амниотических клетках не был обнаружен. Кроме того, в клетках была выявлена экспрессия маркера СК c-kit и эндотелиального маркера CD31, тогда как маркер гематопоэтических СК CD34 не выявлен. Рис. 3. Экспрессия маркеров разных типов дифференцировки в культивированных клетках АЖ (пассаж 2-3). Иммуноцитохимия. Ядра клеток докрашены DAPI (синий). Величина шкалы указана в мкм.
CD73 (SH3,SH4) участвует в гидролизе внеклеточных нуклеотидов, переводит их в нуклеозиды, способные проникнуть внутрь клетки CD49d интегрин а4 - принадлежит к семейству интегринов, которое включает в себя рецепторы к белкам внеклеточного матрикса и рецепторы, участвующие в адгезии лейкоцитов. Входит в состав рецепторного комплекса фибронектина CD 105 участвует в связывании эндотелиальных клеток с интегринами, является компонентом рецепторного комплекса TGFp CD90 (Thy-1) участвует в межклеточных взаимодействиях и взаимодействиях лиганд-клетка CD13 аминопептидаза N, участвует в расщеплении пептидов, полученных после первичного гидролиза протеазами желудка и поджелудочной железы CD29 интегрит pi - принадлежит к семейству интегринов, которое включает в себя рецепторы к белкам внеклеточного матрикса и рецепторы, участвующие в адгезии лейкоцитов. Входит в состав рецепторного комплекса фибронектина CD44 рецептор гиалуроновой кислоты. Играет важную роль в миграции клеток, активации лимфоцитов, гемопоэзе и канцерогенезе CD146 участвует в клеточной адгезии. В ходе эмбриогенеза выявляется в клетках нервного гребня, во взрослом организме функционирует в эндотелиальных клетках всех тканей CD71 трансферриновый рецептор. Входит в состав специализированных эндосом и участвует в поглощении железа CD54 (ICAM-1) молекула клеточной адгезии. Участвует в адгезии лейкоцитов CD106 (VCAM-1) молекула клеточной адгезии. Участвует в адгезии эндотелиальных клеток и лейкоцитов STRO-1 поверхностный маркер. Экспрессируется в мультипотентных стромальных клетках костного мозга NF нейрофиламент — промежуточный филамент в цитоплазме зрелых нейронов
Рз-тубулин член III класса Р-тубулинов, участвующих в сборке микротрубочек. Экспрессируется в первую очередь в нейронах и, возможно, участвует в нейрогенезе, направлении роста и поддержании аксонов
Нестин промежуточный филамент. Участвует в развитии глаза и мозга. Необходим для выживания, самоподдержания СК центральной нервной системы. Рахб транскрипционный фактор, участвующий в развитии глаза, центральной нервной системы и поджелудочной железы. Экспрессируется в фетальном мозге и глазу NS (Нуклеостемин) необходим для, поддержания, пролиферативного потенциала СК, участвует в канцерогенезе Кератин 19 вместе с кератином 8 образует промежуточные филаменты цитоскелета эпителиальных клеток. В настоящее время является одним из наиболее достоверных маркеров СК эпидермиса Nanog гомеобоксный белок, участвующий в пролиферации и самоподдержании ЭСК и клеток внутренней клеточной массы. Необходим для поддержания плюрипотентности ЭСК. Выявляется также в эмбриональных клетках карциномы и в фетальных гонадах Rexl фактор транскрипции с доменом типа «цинковых пальцев». Участвует в самоподдержании СК Sox2 член семейства гомологичных SRY HMG-box содержащих факторов транскрипции, участвующих в регуляции эмбрионального развития и клеточной дифференцировки. Необходим для поддержания плюрипотентности ЭСК
Stella участвует в поддержании плюрипотентности, экспрессируется в ЭСК и клетках карциномы, а также в тестикулярных опухолях из половых клеток
Информация получена из международных баз данных UniProt (Universal Protein Resource) и OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) В ходе культивирования профиль экспрессии маркеров менялся. В то время как к 11 пассажу эти изменения были минимальны (выявлялись все те же маркеры, лишь незначительно уменьшалось число клеток, окрашивающихся антителами к нестину), к 21 пассажу спектр экспрессируемых маркеров был уже другой (табл. 4). Иммуноцитохимический анализ одной из культур (АЖ 6) показал, что на 21 пассаже в клетках сохранялась экспрессия кератина 18, кератина 19, CD73, CD49d, c-kit, CD31. Причем уровень экспрессии этих маркеров был значительно ниже, чем на ранних пассажах; другие маркеры мезенхимного, нейрального и эпителиального типов дифференцировки не выявлялись.
Подобные изменения, происходящие при культивировании, описаны и другими авторами (Chen et al, 2009; Ют et al, 2010). Причем наблюдаться они могут уже после 5 пассажа. Значительные различия выявляются в уровне синтеза некоторых белков, среди которых белки цитоскелета и протеасом, сигнальные белки, шапероны и др. При этом распределение по клеточному циклу, кариотип и показатели апоптоза сохраняются неизменными до 25 пассажа.
IIL3.2. По результатам проточною цитофлуориметрии клетки АЖ (пассаж 6-7) экспрессировали мезенхимные маркеры GD90, CD73, CD105, CD13, CD29, CD44, CD 146, CD54, CD71 (слабая экспрессия) и не экспрессировали CD106, CD34, CD45 (рис. 4, табл. 5, 6). Эти данные позволили предположить, что в полученных культурах присутствовали МСК. Отсутствие экспрессии CD34 и CD45 указывало на то, что в культуре отсутствовали гематопоэтические стволовые/прогениторные клетки. Из эпителиальных маркеров1 с помощью проточной цитофлуориметрии был выявлен кератин 19. Из антигенов главного комплекса гистосовместимости присутствовали HLA-A,B,C и отсутствовали HLA-DR,DP,DQ, что совпадает с имеющимися данными по экспрессии этих антигенов в МСК и СК АЖ (In t Anker et al, 2003; Tsai et al, 2004; Sessarego et al, 2008; Zheng et al, 2008). FL2-H
Индукция экспрессии в стволовых клетках амниотическои жидкости молекул главного комплекса гистосовместимости интерфероном-у
Необходимость культивирования клеток АЖ исходно была продиктована потребностями пренатальной диагностики и осуществляется уже много лет. Морфология выделяемых из АЖ клеток была подробно описана еще в 70-е гг (Hoehn et al., 1974; Priest et al, 1978). Известно, что при культивировании из АЖ выделяются три типа клеток: эпителиоподобные, фибробластоподобные и специфические для АЖ клетки (Hoehn et al., 1974; Gosden, 1983). Эти клетки обнаруживаются на разных этапах культивирования, обладают разным пролиферативным потенциалом и присутствуют в АЖ в разном соотношении. При клонировании было показано, что основная часть популяции представлена специфическими для АЖ клетками, эпителиоподобные клетки обладают низкой клоногенностью и быстро элиминируются из культуры (Hoehn et al., 1974). Вопрос о происхождении клеток с разной морфологией остается открытым — большинство исследователей сходятся во мнении, что фибробластоподобные клетки происходят из мезенхимы, эпителиоподобные клетки — из эпителиальных выстилок пищеварительной, дыхательной, выделительной систем плода, а также из перидермы, специфические клетки — из амниотической мембраны (Priest et al, 1978; Prusa, Hengstschlager, 2002). Мультипотентные CK впервые были выделены из АЖ человека в 2003 г (In Ч Anker et al, 2003). В настоящее время четкого обозначения принадлежности СК АЖ к какому-то из ранее описанных морфологических типов клеток, пожалуй, нет. Некоторые авторы относят СК АЖ к фибробластоподобным клеткам (Tsai et al., 2004; Sessarego et al, 2008).
Мы получили культуры СК из АЖ 12 доноров. По данным цитогенетического анализа у 11 плодов кариотипы были нормальными (46, XX или 46, XY), у одного плода был выявлен синдром Дауна (47, XY, +21). Выделенные клетки обладали высоким пролиферативным потенциалом и прошли минимум 18 пассажей. Согласно имеющимся в литературе данным СК АЖ могут претерпевать более 300 удвоений популяции (более 42 пассажей) (Siddiqui, Atala, 2004; Wang et al., 2008).
При получении первичной культуры мы выявили, что прикрепившиеся к пластику клетки формируют колонии разной морфологии. Часть колоний была представлена веретеновидными (фибробластоподобными) клетками, другая часть — полигональными (эпителиоподобными) клетками. Так же, как было описано ранее (Hoehn et al., 1974), полигональные клетки практически не пролиферировали, тогда как веретеновидные клетки в колониях пролиферировали активно. Полученные после 2-3 пассирований культуры были морфологически гомогенны и в основном представлены веретеновидными клетками. Однако проведенный нами клональный анализ показал, что эпителиоподобные клетки полностью не удалялись из культуры. При клонировании клеток 7-10 пассажей были получены клоны, различающиеся по морфологии клеток. Часть клонов состояла из эпителиоподобных клеток, которые обладали низкой пролиферативной активностью (максимальное количество пройденных пассажей составило 5), другие клоны были представлены полярными клетками с многочисленными отростками. Эти клетки обладали подвижностью и напоминали фибробласты, однако при формировании монослоя их морфология изменялась — клетки становились полигональными. Как известно, исходя только из морфологических критериев отличить фибробластоподобные клетки от специфических для АЖ клеток невозможно. В то же время мы не использовали такие дополнительные критерии как спектр синтезируемых белков внеклеточного матрикса (Hoehn et al., 1974; Priest et al., 1977). Тем не менее, мы полагаем, что полученные клетки можно отнести именно к специфическим клеткам АЖ, по нескольким причинам. Во-первых, конфлюэнтные культуры этих клеток морфологически отличаются от фибробластов. Кроме того, считается, что истинные фибробласты присутствуют в АЖ крайне редко, выделяются не из всех образцов АЖ и только после длительного культивирования (Prusa, Hengstschlager, 2002). В то же время мы получили клетки из всех образцов АЖ, формирование колоний соответствующей морфологии наблюдали уже на 5-7 сут культивирования.
В современных исследованиях важную роль в характеристике клеточных культур отводят описанию иммунофенотипа клеток. Разные типы СК и дифференцированных клеток характеризуются экспрессией разных маркеров. Так, маркерами мезенхимных клеток являются CD73, CD 105, CD90, а также CD29, CD44 и ряд других (Киселева, Васильев, 2009; Augello et al, 2010). Кератин 19 считается маркером эпителиальных СК (Воротеляк и др., 2006; Michel et al, 1996), нестин - маркером нейральных СК (Dahlstrand et al, 1992; Xu et al, 2008), кроме того он выявляется в MCK (Wislet-Gendebien et al, 2004; Bertani et al, 2005). В то же время мезенхимные маркеры (например, CD90) могут экспрессироваться в нейральных и эпителиальных клетках (Паюшина и др., 2009), а эпителиальный маркер кератин 18 обнаруживается даже в ЭСК (Jezierski et al, 2010). Таким образом, ни один из маркеров не является стопроцентно специфичным. И для того чтобы отнести клетки к какому-то типу СК, нельзя опираться только на экспрессию одного из них.
Морфологическая характеристика клонированных клеток
Культивирование клеток АЖ в настоящее время широко используется как для пренатальной диагностики различных генетических заболеваний, так и для фундаментальных исследований (Siddiqui, Atala, 2004; Баранов, Кузнецова, 2007). Было показано, что в АЖ присутствуют СК, которые экспрессируют многие маркеры мезенхимных клеток, обладают адгезией к пластику и способны дифференцироваться в разных направлениях, включая остеогенное, адипогенное и хондрогенное. В связи с этим многие исследователи относят СК АЖ к МСК. Однако происхождение этих клеток точно неизвестно, а их - дифференцировочный статус (плюрипотентность/мультипотентность) в настоящее время обсуждается. Целью нашей работы было изучение фенотипических свойств и дифференцировки СК АЖ человека.
Проведенное нами исследование показало, что СК АЖ по многим характеристикам действительно сходны с МСК, однако одновременно с этим и принципиально отличаются от них. Кроме мезенхимных эти клетки экспрессируют нейральные маркеры, что не противоречит их классификации как МСК. Однако в СК АЖ выявляются также маркеры эпителиальных . клеток, что не характерно для МСК, выделенных из дифференцированных тканей взрослого организма. Причем по данным проточной цитофлуориметрии и двойного имуноцитохимического окрашивания коэкспрессия двух типов маркеров наблюдается не в единичных клетках, а в значительной части популяции (вплоть до 100% клеток). Клональный анализ подтвердил эти данные: в потомках одной клетки выявлены маркеры разных типов дифференцировки. Клонированные СК АЖ способны дифференцироваться в производные, по меньшей мере, двух зародышевых листков - мезодермы и энтодермы. По результатам ОТ-ПЦР анализа в СК АЖ обнаружены не только маркеры мезенхимных (THY-J), нейральных (TUBB3, NESTIN, NS, РАХб) и эпителиальных клеток {KRT19, РбЗ), но и некоторые из маркеров плюрипотентности (ОСТ4, NANOG, REX1). При этом в отличие от ЭСК, СК АЖ не формируют тератомы при трансплантации in vivo.
Мы впервые получили данные о морфогенетических потенциях СК АЖ, проявляющихся при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки сохраняют в геле пролиферативную активность и способны формировать многоклеточные цисто- и тубулоподобные структуры — это свойственно эпителиальным клеткам. Кроме того между СК АЖ выявляются типичные для эпителиев адгезивные соединения. При этом в трехмерном матриксе сохраняется экспрессия маркеров мезенхимных клеток и происходит значительная контракция (сокращение диаметра) коллагенового геля.
Мы также провели исследование особенностей цитоскелета СК АЖ и выявили в них как характерные для мезехимных клеток стресс-фибриллы актина, так и типичный для эпителиальных клеток кольцевой пучок микрофиламентов под плазматической мембраной. Впервые было показано, что СК АЖ в культуре соединяются нанотрубочками, которые обеспечивают тесную взаимосвязь клеток в условиях in vitro.
При проведении клонального анализа мы наблюдали интересное явление изменения морфологических характеристик СК АЖ. Клетки с многочисленными отростками (мезенхимной морфологии) в ходе культивирования становились эпителиоподобными, что сопровождалось резким снижением их пролиферативной активности. В течение нескольких суток они пребывали в таком состоянии, после чего вновь меняли свою морфологию и начинали активно делиться. Таким образом, наблюдаемый нами процесс был обратимым. При этом клонированные клетки разной морфологии экспрессировали маркеры как мезенхимного, так и эпителиального типов дифференцировки. Предположительно СК АЖ могут находиться в состоянии ЭМП, который активно протекает в эмбриогенезе.
Полученные нами результаты в целом противоречат существующему мнению о том, что СК АЖ являются МСК. Эти клетки проявляют многие свойства мезенхимных клеток, в том числе экспрессируют специфические маркеры и способны дифференцироваться в соответствующих направлениях. Однако СК АЖ демонстрируют и свойства эпителиальных клеток. В них выявляются маркеры эпителиального типа дифференцировки, адгезивные соединения, они проявляют морфогенетические потенции эпителиальных клеток в 3D условиях. Кроме того, мы обнаружили, что в условиях культуры СК АЖ способны изменять свою морфологию. Таким образом, выделенные нами клетки обладают особым переходным эпителио-мезенхимным фенотипом и не могут быть отнесены к одному из типов тканей: По всей видимости, эти клетки возникают на самых ранних этапах эмбриогенеза, могут сохраняться в АЖ и в условиях культуры проявлять свою двойственную природу. В свете полученных данных интересным представляется изучение возможной физиологической роли этих клеток, например, в поддержании иммунотолерантности и обеспечении нормального течения беременности.
Клетки, способные к длительной пролиферации in vitro и обладающие широкими дифференцировочными потенциями, являются перспективными для исследований в области клеточных технологий. Высокая эффективность трансфекции свидетельствует о возможности использования СК АЖ для генной терапии. Получение клеток в середине беременности открывает перспективы лечения некоторых заболеваний in utero или сразу после рождения, что предотвращает развитие вторичных повреждений. Таким образом, исследования СК, выделенных из АЖ, важны, не только для решения фундаментальных вопросов биологии развития, таких как детерминация и дифференцировка, они имеют и прикладное значение.
