Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Нейрогенез и стволовые клетки взрослого мозга млекопитающих 8
1.2. Выделение, культивирование и исследование развития нейральных стволовых клеток in vitro 20
1.3. Биологические основы нейротрансплантации 36
1.4. Трансплантация нейральных стволовых клеток в ЦНС 43
Глава 2. Материалы и методы 56
2.1. Культивирование нейральных стволовых/прогениторных клеток человека.56
2.2. Методы трансплантации культур нейральных стволовых/прогениторных клеток человека в головной мозг взрослых крыс 57
2.3. Фиксация головного мозга 58
2.4. Методы фиксации клеточных культур 58
2.5. Приготовление срезов головного мозга крыс 58
2.6. Приготовление срезов нейросфер 59
2.7. Гистологические методики 59
2.8. Методы иммуногистохимического окрашивания 59
2.9. Антитела и их описание 60
2.10. Документирование и обработка результатов микроскопических исследований 62
2.11. Гипоксическая модель повреждения головного мозга 63
Глава 3. Дифференцировка и поведение нейральных стволовых клеток эмбрионального мозга человека в культуре in vitro 64
3.1. Введение 64
3.2. Результаты исследования 65
3.3. Обсуждение 90
Глава 4. Трансплантация популяций нейральных стволовых/прогениторных клеток эмбрионального мозга человека в головной мозг взрослых крыс 101
4.1. Введение 101
4.2. Результаты исследования 102
4.3. Обсуждение 120
Глава 5. Трансплантация клеток ненсирального происхождения в головной мозг взрослых крыс 126
5.1. Введение 126
5.2. Материалы и методы 128
5.3. Результаты исследования 130
5.4. Обсуждение 139
Заключение 142
Выводы 146
Список литературы 147
- Выделение, культивирование и исследование развития нейральных стволовых клеток in vitro
- Методы трансплантации культур нейральных стволовых/прогениторных клеток человека в головной мозг взрослых крыс
- Документирование и обработка результатов микроскопических исследований
- Гипоксическая модель повреждения головного мозга
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее время в нейробиологии особое внимание приковано к проблеме стволовых клеток в центральной нервной системе. На сегодняшний день окончательно утвердились представления о постоянном нейрогенезе в некоторых областях мозга млекопитающих, который обеспечивается за счет пула неиральных стволовых клеток (Doetsch et al., 1999; Palmer et al., 2000; Seri et al., 2001). Нейральные стволовые клетки определяют как клетки с неограниченным пролиферативным потенциалом, способные к самовоспроизведению и генерации мультипотентных потомков, которые в последствии дадут три основные ветви нейральной дифференцировки: нейроны, астроциты и олигодендроциты.
Существенным шагом в изучении стволовых клеток стало их выделение и культивирование. В культуре in vitro стволовые клетки активно размножаются в условиях бессывороточных сред с ростовыми факторами, формируя свободноплавающие колонии шарообразной формы, которые называются нейросферами (Reynolds and Weiss, 1992; Lois and Alvarez-Buylla, 1993; Palmer et al., 1995; Weiss et al., 1996). Клонирование нейросфер дало инструмент для установления свойства «стволовости» у тех или иных первичных популяций неиральных клеток. Именно с помощью этого подхода было продемонстрировано, что некоторые области развивающегося и зрелого мозга млекопитающих, включая человека, содержат пулы неиральных стволовых клеток (Reynolds and Weiss, 1996; Carpenter et al., 1999; Kukekov et al., 1999; Pagano et al., 2000; Vescovi et al., 1999).
С одной стороны, культивирование неиральных стволовых клеток позволяет по-новому подойти к проблемам исследований дифференцировки клеток нервной системы, а с другой - развить идею о применении клеточной терапии для лечения различных патологий центральной нервной системы.
Проведенные многочисленные исследования показали, что культуры неиральных стволовых клеток гетерогенны (Mokry et al., 1996; Carpenter et al., 1999; Kukekov et al., 1999; Vescovi et al., 1999; Suslov et al., 2002; Bez et al., 2003; Lobo et al., 2003), и эта гетерогенность обусловлена многими факторами. По этой причине такие культуры стали называть популяциями неиральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК). Здесь возникает вопрос о стандартизации методов их выращивания и способов получения их характеристик. Этот вопрос является особенно принципиальным по отношению к культурам клеток человека. Кроме того, анализ культур in vitro может быть недостаточным для оценки их потенциальной значимости для практического применения, и поэтому необходимо учитывать результаты трансплантационных исследований на моделях повреждений мозга у животных.
Нейротрансплантация уже достаточно давно рассматривается как перспективный подход для коррекции патологических состояний мозга. В 70-х и 80-х годах прошлого столетия эксперименты с трансплантацией эмбриональной нервной ткани показали большую эффективность этого подхода как в фундаментальных вопросах нейральной дифференцировки, так и для практических целей. На сегодняшний день именно пересадка культур нейральных стволовых клеток стала новым этапом развития направления, связанного с нейротрансплантацией (Svendsen et al., 1996; Lundberg et al., 1997; Snyder et al., 1997; Brock et al., 1998; Fricker et al., 1999; Vescovi et al., 1999; Auerbach et al., 2000; Rubio et al., 2000; Akiyama et al., 2001; Ogawa et al., 2002; Enomoto et al., 2003). Анализ переживания и поведения клеток после трансплантации, а также их влияния на компенсаторные процессы на экспериментальных моделях повреждения мозга у животных является основной задачей исследований по нейротрансплантации.
Однако для предполагаемого практического использования клеточных культур существует некоторые проблемы. Получение культур нейральных стволовых клеток для аутотрансплантации является фактически невыполнимой задачей, в связи с тем, что нет возможности доступа к областям зрелого мозга человека, из которых такие клетки могут быть выделены. Другая проблема носит этический характер. Это выделение нейральных стволовых клеток из образцов тканей мозга эмбрионов человека, полученных путем медицинского аборта. По этой причине возникла задача поиска альтернативных источников нейральных клеток. С развитием представлений о стволовых клетках, присутствующих практически во всех органах и тканях, появилась концепция «пластичности стволовых клеток», которая заключается в том, что при определенных условиях стволовая клетка данной ткани способна давать потомков с нетипичными ветвями дифференцировки. В частности, имеются данные о том, что мезенхимные стволовые клетки (МСК) стромы костного мозга могут развиваться по нейральному пути как in vitro, так и при трансплантации в центральную нервную систему (Azizi et al., 1998; Kopen et al., 1999; Nakano et al., 2001; Priller et al., 2001; Munoz-Elias et al., 2004). Эти данные в корне меняют представления о процессах развития и дифференцировки клеток в организме. Однако результаты многих таких исследований все-таки можно поставить под сомнение.
Многочисленные работы по проблеме нейральных стволовых клеток концентрируют свой взгляд в основном либо на анализе клеточных культур, либо на изучении результатов трансплантации. По этой причине возникает необходимость в проведении исследования, которое захватило бы оба аспекта проблемы. Кроме того, появившиеся в последнее время работы, в которых авторы демонстрируют нейральную дифференцировку культур мезенхимных стволовых клеток после трансплантации в мозг, требуют тщательной проверки. Вследствие этого, именно параллельный анализ культур нейральных и мезенхимных стволовых клеток in vitro и при трансплантации позволит прояснить ситуацию в данной проблеме.
Цель исследования. Цель настоящей диссертационной работы состояла в изучении дифференцировки и пролиферации в культурах нейральных стволовых/прогениторных клеток развивающегося мозга человека in vitro и после трансплантации в мозг крыс.
Задачи исследования.
С использованием гистологических и иммуногистохимических методов охарактеризовать культуры НСПК развивающегося мозга человека.
Проанализировать судьбу (дифференцировку, пролиферацию и миграцию) трансплантированных клеток из культур НСПК эмбрионального мозга человека и их взаимодействие с тканями нормального и патологического мозга реципиентов.
Изучить влияние трансплантатов культур НСПК эмбрионального мозга человека на поведение крыс, подвергнутых острой гипоксии, и на гистологическую картину нейродегенеративных процессов.
Проанализировать культуру МСК стромы костного мозга человека и переживание клеток этой культуры после трансплантации в головной мозг нормальных крыс и крыс с острой гипоксией.
Научная новизна. Настоящая диссертационная работа посвящена анализу клеточного состава и поведения клеток в нейральных культурах, полученных из развивающегося мозга человека, а также изучению их судьбы и влияния на компенсаторные процессы в патологическом мозге крыс после трансплантации. Кроме того, в работе был исследован вопрос относительно нейралыюй дифференцировки нативных культур мезенхимных стволовых клеток в микроокружении зрелого мозга крыс при трансплантации.
Впервые в рамках одной работы детально были охарактеризованы с помощью методов гистологии, иммуногистохимии и электронной микроскопии культуры НСПК эмбрионального мозга человека, и затем была исследована культуры НСПК эмбрионального мозга человека, и затем была исследована судьба этих охарактеризованных культур после трансплантации в мозг крыс. Анализ клеточных культур показал, что они гетерогенны. Нейросферы включают клетки, находящиеся на разных этапах нейральной дифференцировки. Рост клеточной культуры обеспечивается за счет стволовых, прогениторных и глиальных клеток. Иммуногистохимическое исследование адгезивных нейросфер показало, что многие клетки могут одновременно экспрессировать маркеры предшественников и дифференцированных клеток. Культивирование нейросфер на бессывороточной среде с митогенами позволяет получить популяцию клеток только нейрального ряда. Впервые на модели диффузного повреждения мозга у крыс было продемонстрировано, что после трансплантации клеточных культур происходит нормализация поведения и улучшается выживаемость собственных нейронов мозга реципиента. Это указывает на то, что трансплантаты культур НСПК изменяют среду микроокружения патологического мозга, предотвращая гибель затронутых повреждением нейронов. Анализ переживания самих трансплантатов показал, что клетки человека сохраняются как минимум 27 дней после операции у животных без иммуносупрессии. В трансплантатах выявляются клетки на разных этапах дифференцировки: стволовые и прогениторные клетки, нейробласты и глиобласты. Однако дифференцированных нейронов выявлено не было. Трансплантированные клетки мигрируют по тканям мозга реципиента, часто вдоль капилляров.
Используя методические подходы, аналогичные тем, которые применяли для исследования нейральных клеток, был проведен анализ культуры МСК человека in vitro и при трансплантации. Здесь впервые были получены убедительные данные о том, что нативные МСК не дифференцируются в нейральном направлении в среде микроокружения зрелого мозга. Трансплантаты отторгаются с практически полной элиминацией клеток к 20-ым суткам. Вокруг трансплантатов развивается мощная глиальная реакция, и наблюдаются сильные морфологические изменения в окружающей ткани. В тоже время синтезируемый трансплантированными клетками фибронектин, по-видимому, обеспечивает врастание нервных волокон хозяина в область трансплантата.
Таким образом, полученные результаты служат важным звеном между фундаментальными проблемами биологии стволовых клеток (такими как дифференцировка, роль микроокружения в процессах дифференцировки клеток и регенерации в нервной системе, пластичность стволовых клеток) и клеточной терапией центральной нервной системы.
Практическая значимость работы. Результаты, полученные в настоящем исследовании, служат базой для разработки практических подходов клеточной терапии центральной нервной системы. Экспериментально обоснованно, что трансплантаты культур НСПК оказывают нейропротективное действие на дегенерирующие нейроны при диффузном поражении мозга, и это нейропротективное действие, пожалуй, должно служить отправной точкой при формулировании целей и задач для практической нейротрансплантации. Здесь явно продемонстрирована необходимость сравнительного анализа клеточного материала из различных источников, который предполагается использовать для нейротрансплантации в практических целях, и создания единой концепции оценки трансплантационных и терапевтических потенции тех или иных популяций клеток.
Материалы настоящей диссертации могут быть использованы в курсах лекций в биологических и медицинских ВУЗах.
Выделение, культивирование и исследование развития нейральных стволовых клеток in vitro
Пионерская работа Харрисона, выполненная в начале XX века, открыла новый альтернативный путь исследования нервной системы (Harrison, 1907). Он показал, что клетки, выделенные из эмбрионального мозга, могут сохраняться вне организма в специальном "питательном бульоне". В таких культурах изолированные клетки способны давать длинные отростки, приобретая морфологию характерную для нейронов. С тех пор метод культивирования клеток, выделенных из развивающегося и зрелого мозга млекопитающих, стал служить одним из основных инструментов для исследования широкого спектра вопросов, касающихся развития и функционирования центральной нервной системы.
Существенным этапом в изучении стволовых клеток нервной системы стало их выделение и культивирование. Получение культур нейральных клеток, способных генерировать основные клеточные фенотипы ЦНС: нейроны, глиальные клетки и олигодендроглию, позволило по-новому подойти к проблемам нейрогенеза с одной стороны, и развить идею о применении клеточной терапии для лечения различных патологий головного и спинного мозга - с другой.
Работы по культивированию стволовых клеток центральной нервной системы стали развиваться с начала 90-х годов XX столетия (Reynolds and Weiss, 1992; Lois and Alvarez-Buylla, 1993; Palmer et al., 1995; Weiss et al„ 1996; Kukekov et al., 1999; Pagano et al., 2000; Gritti et al., 2002). Суммарно, эти работы показали, что НСК могут быть эффективно размножены в культуре в присутствии в среде ЭФР и/или ФРФ-2. В таких культурах клетки растут с образованием свободноплавающих колоний шарообразной формы, которые называются нейросферами.
Культивирование нейросфер дало исследователям новый инструмент для установления свойства «стволовости» тех или иных популяций нейральных клеток. Так, существенным шагом в биологии НСК стала работа Рейнольдса и Вейсса (Reynolds and Weiss, 1996). В своей работе авторы попытались проверить следующую гипотезу: могут ли какие-нибудь клетки развивающегося мозга из популяции прогениторных демонстрировать свойства стволовых клеток в условиях in vitro. Для этого они использовали ранее разработанный ими с соавт. подход (Vescovi et al., 1993), который позволяет клеткам эмбрионального мозга расти в бессывороточной среде в присутствии ЭФР в виде свободноплавающих нейросфер. Исследование показало, что в первичной культуре диссоциированных клеток стриатума эмбрионов мышей 14-го дня развития только 1% клеток дает начало нейросферам, состоящих из недифференцированных клеток. Осаждение нейросфер на поли-Ь-орнитин в присутствии сыворотки стимулирует дифференцировку клеток в нейросферах, что было показано с использованием иммуноцитохимической окраски против белков-маркеров определенных клеточных фенотипов нервной системы. Основываясь на своих данных о том, что единичные клетки-предшественники из эмбрионального стриатума могут давать начало нейросферам (Reynolds et al., 1992), ими далее был использован метод клонирования нейросфер. В этом случае первичные нейросферы механически диссоциировали до единичных клеток. Затем клетки высаживали в многолуночные плашки по одной клетке на лунку. Количественная оценка показала, что уже 20% клеток давали начало вторичным нейросферам, и, кроме того, одна первичная нейросфера может давать начало нескольким вторичным. Полученные результаты демонстрируют свойство самовоспроизведения стволовых клеток эмбрионального мозга. Осаждение вторичных нейросфер на поли-Ь-орнитин в присутствии сыворотки показало, что вторичные нейросферы имеют также мультипотентный статус. В них выявляются клетки, которые дифференцируются в нейроны, астроциты и олигодендроциты. Суммарная количественная оценка показала, что 90% как первичных, так и вторичных нейросфер, полученных путем клонирования единичных клеток, содержат все три основных клеточных фенотипа ЦНС. Кроме этого, в работе сделали оценку прироста клеток. С этой целью, первичные нейросферы механически диссоциировали до единичных клеток, и клетки заново высевали в культуру в низкой плотности. Процедуру пассирования проводили через каждые 6-8 дней. Проведенный анализ показал, что клетки выдержали 10 пассажей без существенной потери их пролиферативного и дифференцировочного потенциала, и это привело к увеличению общего числа клеток в популяции в 10 миллионов раз по сравнению с первоначальным.
Таким образом, эта работа показывает, что in vitro могут быть получены популяции клеток нейральных предшественников из развивающегося мозга млекопитающих, среди которых содержатся клетки, обладающие в условиях культивирования свойствами стволовых клеток - способностью к самовоспроизведению и генерации трех основных клеточных фенотипов ЦНС.
Здесь хотелось бы сразу отметить, что, строго говоря, вырастить нейральную культуру, которая бы содержала только стволовые клетки, невозможно. В таких культурах происходит спонтанная дифференцировка клеток. Помимо стволовых, они всегда содержат клетки, находящиеся на более продвинутых стадиях дифференцировки: прогениторные клетки, нейробласты и глиобласты (см. ниже). По этой причине, говоря в дальнейшем о культурах клеток, о которых можно сказать, что они содержат нейральные стволовые клетки, будем использовать термин либо популяции, либо культуры нейральных стволовых/прогениторных клеток (НСПК), который наиболее точно отражает исследуемый объект.
Предваряя обзор многочисленных работ с культурами НСПК, нужно сразу выделить несколько основных направлений. Это - источники культур НСПК и методы культивирования, влияние ростовых, нейротрофических и других факторов на популяции НСПК, исследование молекулярных механизмов нейральной дифференцировки на модели популяций НСПК, культуры НСПК человека, нейротрансплантация (обзору работ по трансплантации культур НСПК будет посвящен п. 1.4. настоящей главы).
В большинстве работ, посвященных исследованиям НСПК, в качестве основных источников клеточного материала для культивирования были использованы диссоциированные клетки зрелой или развивающейся ЦНС мышей (Reynolds and Weiss, 1996, Murayama et al., 2002), крыс (Zhou et al. 2000; Lobo et al., 2003) и человека (Carpenter et al., 1999; Johansson et al., 1999b, Kukekov et al., 1999, Palm et al., 2000). Поэтому в начале необходимо сразу сказать о методах получения и последующего культивирования клеток из указанных источников.
В основном первичные культуры НСПК получали путем механической и ферментативной диссоциации клеток из образцов тканей различных областей мозга, препарированных хирургическим методом. В ряде работ использовали сортировку клеток первичных культур с целью обогащения начальной популяции НСПК стволовыми клетками и наименее дифференцированными прогениторными клетками. Так, обогащенные популяции НСПК из развивающегося и зрелого мозга мышей получали путем выделения клеток, слабо окрашивающихся ядерным люминесцентным красителем Hoechst 33342 (Murayama et al., 2002). Ранее такой метод был использован для обогащения популяций гематопоэтических стволовых клеток костного мозга (Goodel et al., 1996), и было показано, что популяция слабо окрашенных клеток (так называемая «сторонняя популяция», "Side Population" или "SP-cells") содержит стволовые клетки в количестве близком к 100%. Данный феномен обусловлен наличием у стволовых клеток белков множественной лекарственной устойчивости ("Multidrug-Resistance"), которые являются трансмембранными транспортерами и обеспечивают выброс различных субстратов из клетки через мембрану (Scharenberg et al., 2002). Популяции НСПК обогащали также с применением антител к поверхностным антигенам, являющихся маркерами малодифференцированных клеток (Uchida et al., 2000). Еще одна исследовательская группа выделяла популяции нестин-положительных клеток из мозга трансгенных мышей, у которых под промотером гена нестина (маркера нейроэктодермальных стволовых клеток) был помещен ген усиленного GFP-белка (Kawaguchi et al., 2001).
Методы трансплантации культур нейральных стволовых/прогениторных клеток человека в головной мозг взрослых крыс
Первые публикации, в которых развивалась идея внутримозговой трансплантации популяций культивированных стволовых/прогениторных клеток, и указывалось о проведении такой трансплантации, появились в начале 90-х годов прошлого столетия (Renfranz et al., 1991; Baetge, 1993; Gage et al., 1995a). Бурного роста исследования в области трансплантации популяций НСПК достигли к концу 90-х, когда уже достаточно были продвинуты методы культивирования популяций НСПК. Основной целью этих исследований было получение убедительных оснований к тому, чтобы применять трансплантацию культур НСПК для коррекции патологических состояний ЦНС, как, например, при болезнях Паркинсона, Гантингтона и Альцгеймера, при травмах головного и спинного мозга. Первым шагом в этом направлении было исследование поведения клеток из популяций НСПК после трансплантации.
Подавляющее большинство исследований было направлено на решение следующих вопросов. Во-первых, каковы потенции к дифференцировке культивированных популяций НСПК после трансплантации, и какие факторы направляют дифференцировку клеток трансплантатов? Во-вторых, как взаимодействуют трансплантированные клетки с тканями мозга реципиента (сюда относятся вопросы о миграции и о функциональном включении трансплантированных клеток в общую нейронную сеть)? И, наконец, какое влияние оказывают трансплантаты популяций НСПК на репаративные процессы при экспериментальных повреждениях мозга на моделях у животных?
В целом полученные результаты исследований показывают, что культивированные популяции НСПК могут быть успешно трансплантированы в различные отделы как зрелой, так и развивающейся ЦНС. Популяции НСПК хорошо приживляются, и даже в случаях ксенотрансплантации (наибольшее внимание было уделено ксенотрансплантации популяций НСПК человека в ЦНС грызунов). Клетки трансплантатов способны дифференцироваться в основные клеточные фенотипы ЦНС, устанавливать синаптические связи и мигрировать по тканям мозга реципиента (Gage et al., 1995а; Svendsen et al., 1996, 1997a; Lundberg et al., 1997; Snyder et al., 1997; Brock et al., 1998; Fricker et al., 1999; Vescovi et al., 1999; Auerbach et al., 2000; Rubio et al., 2000; Akiyama et al., 2001; Ogawa et al., 2002; Wu et al., 2002b; Enomoto et al., 2003). На основании полученных результатов был предложен ряд стратегий применения культивированных популяций НСПК для коррекции тех или иных патологических состояний головного и спинного мозга (Bunge, 2001; Cao et al., 2002; Reier, 2004).
Существенным показателем успешности переживания популяций НСПК является срок, в течение которого можно выявить трансплантированные клетки. Данные мировых исследований показывают, что клетки из культур НСПК могут переживать более 1-го года даже в случаях ксенотрансплантации. Здесь примечательны работы Энглунд с соавт. (Englund et al., 2002а, с). В этих работах популяции НСПК, полученные от 6.5-9-недельных эмбрионов человека, выращивали в культуре в виде нейросфер от 140 до 360 дней в присутствии ЭФР, ФРФ-2 и ЛИФ. Затем клеточные суспензии диссоциированных нейросфер трансплантировали в головной мозг пеонатальных и взрослых крыс: в область стриатума, гиппокампа и в субвентрикулярную зону. С использованием антител против специфического белка ядер клеток человека авторы показали, что трансплантированные клетки выявляются спустя 65 недель после пересадки. Важно отметить, что в этих работах авторы не выявили трансформации клеток и соответственно формирования опухолевых образований после трансплантации.
В вопросах о переживании клеток важную роль играет иммунологический аспект нейротрансплантации популяций НСПК. Собственно все рассуждения относительно иммунологической проблемы нейротрансплантации, приведенные в предыдущем пункте настоящей главы, остаются справедливыми. Однако имеются интересные данные, показывающие, что клетки, прошедшие этап культивирования, переживают гораздо лучше, нежели первичные суспензии диссоциированных клеток (Armstrong et al., 2001). Были поставлены следующие эксперименты. Взрослым крысам без иммуносупрессии трансплантировали либо первичные суспензии диссоциированных клеток эмбриональной нервной ткани свиньи, либо популяции НСПК из того же источника, но прошедшие этап культивирования. Исследования показали, что к 35-му дню переживания трансплантаты первичных суспензий полностью резорбировали, а клетки из популяций НСПК выявлялись даже спустя 60 дней переживания. Кроме этого, подсадка первичных суспензий в брюшную полость вызывала мощный гуморальный ответ, а при подсадке популяций НСПК такого ответа не наблюдалось. Методом проточной цитофлуориметрии было показано, что клетки первичной суспензии экспрессируют молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса, и уровень экспрессии был достаточен для запуска иммунного ответа. В тоже время уровень экспрессии этих молекул в популяции НСПК был значительно ниже. На основании этих данных авторы предположили, что, пройдя этап культивирования с митогенами, клетки в популяциях НСПК утрачивают свою иммуногенность. Этот факт с одной стороны обосновывает столь долгое переживание клеток даже при ксенотрансплантациях, а с другой -открывает значительные перспективы практического использования популяций НСПК.
Если говорить об исследовании поведения трансплантированных клеток, а именно о миграции и дифференцировке, то в этом направлении спектр работ достаточно широк. Это обусловлено тем, что популяции НСПК могут быть получены из различных областей развивающейся и зрелой ЦНС и имеют различные потенции к пролиферации, дифференцировке и ответу на инструктирующие сигналы. Например, в работе Гейджа с соавт. (Gage et al., 1995а) популяции НСПК, полученные из гиппокампа взрослых крыс, культивировали в течение одного года. Затем провели аллотрансплантацию клеток в область гиппокампа взрослым крысам. С использованием предварительного мечения клеток БрдУ или инфецирования аденовирусом, несущим ген lacZ, было показано, что трансплантированные клетки могут переживать до 3-х месяцев. При этом клетки, которые после трансплантации попали в СГЗ зубчатой извилины, дифференцируются преимущественно в нейроны гранулярного слоя, а клетки, попавшие в другие области, демонстрируют глиальную дифференцировку. На основе полученных данных авторы заключили, что на судьбу клеток оказывают влияние факторы микроокружения тканей мозга реципиента. В дальнейшем исследователи получили подтверждение этого вывода, когда сравнили дифференцировку популяций НСПК, полученных из взрослого спинного мозга, при трансплантации в гиппокамп и спинной мозг (Sihabuddin et al., 2000). В этом эксперименте было обнаружено, что при трансплантации в спинной мозг клетки дифференцировались по глиальному пути, в то время как клетки гиппокампальных трансплантатов, попавшие в СГЗ зубчатой извилины, дифференцировались в типичные нейроны гранулярного слоя.
Документирование и обработка результатов микроскопических исследований
Так, в работах японских исследователей, использовавших в качестве модели повреждения спинного мозга компрессию грузом, диссоциированные клетки нейросфер из популяций НСПК эмбриональной ЦНС крыс вводились либо непосредственно в область повреждения (Ogawa et al., 2002), либо в четвертый желудочек головного мозга (Wu et al., 2002а). Гистологические исследования, проведенные в работе Огавы с соавт. (Ogawa et al., 2002) спустя 5 недель после трансплантации популяции НСПК развивающегося спинного мозга, показали, что имплантированные клетки делятся, и генерируемые ими нейроны образуют синаптические связи с нейронами реципиента. Кроме этого анализ поведения показал восстановление моторных функций у животных получивших трансплантат, в отличие от животных с одной травмой. Особый интерес вызывает работа By с соавт. (Wu et al., 2002а). Трансплантированные в четвертый желудочек клетки из популяций НСПК эмбрионального гиппокампа диффундировали через цереброспинальную жидкость в спинной мозг, где они прикреплялись к внутренней выстилке цереброспинального канала в области повреждения и затем мигрировали в паренхиму спинного мозга реципиента. Клетки переживали до 8-ми месяцев после трансплантации. Электронно-микроскопическая иммуногистохимия показала, что имплантированные клетки распределялись среди волокон реципиента, дифференцируясь по глиальному пути, а также в клетки, которые имели морфологию сходную со Шванновскими клетками периферической нервной системы. Последние способствовали миелинизации поврежденных аксонов. В противоположность предыдущей работе дифференцировки по нейроЕіальному пути выявлено не было. Дифференцировка только по глиальному и олигодендроглиалыюму пути была также показана при трансплантации диссоциированных клеток нейросфер из популяций НСПК зрелого спинного мозга на модели рассеченного спинного мозга (Vroemen et al., 2003).
Особого внимания заслуживают модели с повреждением миелиновых оболочек аксонов нейронов спинного мозга, как, например, дефицит миелина у мутантных крыс линии md. Эти крысы служат прекрасной моделью такого тяжелого заболевания, как рассеянный склероз. Так, было показано, что трансплантированные клетки из популяций НСПК стриатума и вентрального мезенцефалона эмбрионов крыс способны к дифференцировке в олигодендроциты в миелиндефицитном окружении спинного мозга md крыс (Hammang et al., 1997). Дифференцированные олигодендроциты формируют миелиновые оболочки, что было выявлено при электронно-микроскопических исследованиях. Похожие результаты были получены при трансплантации культур НСПК взрослого мозга человека спинной мозг крыс с локальным повреждением миелиновых оболочек, путем воздействия рентгеновского излучения (Akiama et al., 2001).
Определенный прогресс был достигнут в направлении, связанном с эмбриональными столовыми клетками. Так, например, было показано, что нейральные клетки-предшественники, полученные путем направленной дифференцировки Л линии ЭСК мышей in vitro, при их имплантации в желудочки мозга эмбрионов крыс принимают участие в процессах развития мозга (Brustle et al., 1997). Они формируют «розетко»-подобные нейроэпителиальные структуры внутри желудочков. Клетки с нейрональной, глиалыюй и олигодендроглиальной дифференцировкой широко мигрируют в ткани мозга реципиента. И дифференцировка, и миграция трансплантированных клеток, как показало исследование, контролируются локальными инструктирующими сигналами. Похожие результаты были получены в аналогичном эксперименте с трансплантацией ЭСК человека линий HES1 и HES9 в латеральные желудочки неонатальных мышей (Zhang et al., 2001).
Андрессен с соавт. (Andressen et al., 2001) генетически модифицировали клетки линии D3 ЭСК мышей, путем встраивания гена GFP-белка под промотер нестина. После спонтанной дифференцировки ЭСК с образованием эмбриоидных тел клетки с экспрессией нестина выделяли путем сортировки и затем трансплантировали в стриатум взрослых крыс. Трансплантаты исследовали спустя 4 недели. Дифференцировка по нейрональному и глиальному пути трансплантированных клеток была показана с помощью антител против маркеров этих клеточных фенотипов. Формирования опухолевых образований выявлено не было.
Кроме этого, были сделаны трансплантации клеток нейральных предшественников, полученных из линий ЭСК, на моделях повреждения мозга. Так, например, клеточные популяции, обогащенные дофаминергическими нейробластами, трансплантировали мышам и обезьянам при токсическом повреждении дофаминергических нейронов мозга (Nishimura et al., 2003; Takagi et al., 2005). Обогащение проводили путем культивирования клеток из эмбриоидных тел сначала в селективной среде для выращивания популяций НСПК, а затем в среде с добавлением либо ФРФ-8 (Nishimura et al., 2003), либо ФРФ-20 (Takagi et al., 2005). Ранее было обнаружено, что эти факторы оказывают влияние на развитие и дифференцировку дофаминергических нейронов. Как на мышах, так и на обезьянах было показано, что трансплантированные дофаминергические нейробласты приживаются. Животные, получившие трансплантат демонстрируют лучшие показатели в поведенческих тестах по сравнению с контрольными группами животных.
Таким образом, культуры НСПК, полученные как из развивающейся, так и зрелой ЦНС, способны к длительному переживанию даже в случаях ксенотрансплантации. Клетки трансплантатов могут мигрировать и дифференцироваться под воздействием инструктирующих сигналов среды микроокружения мозга реципиентов. На моделях повреждения как головного, так и спинного мозга было показано, что клетки трансплантатов, демонстрируя направленную миграцию и дифференцировку в ответ на такое повреждение, способны, таким образом, компенсировать экспериментальное патологическое состояние. Это заключение подтверждают многочисленные данные поведенческих тестов. Кроме того, клетки из популяций НСПК могут давать начало полностью дифференцированным нейронам, которые в свою очередь устанавливают функциональные синаптические связи с клетками мозга реципиента. Это подтверждает целесообразность развития стратегии заместительной клеточной терапии ЦНС. Трансплантированные клетки из культур НСПК продуцируют нейротрофические и другие стимулирующие факторы. Посредством этого механизма они модулируют собственный регенерационный ответ ЦНС реципиента, а также обеспечивают нейропротекцию, предотвращая прогрессирующую дегенерацию. Это можно рассматривать как еще одну стратегию трансплантационного подхода в коррекции патологических состояний ЦНС. И, наконец, возможность сохранения в культуре популяций НСПК позволяет использовать метод генетической модификации этих клеток с целью доставки продуктов определенных генов в те области мозга, где их недостаток приводит к необратимым дегенеративным процессам.
Гипоксическая модель повреждения головного мозга
Получение нейральных культур, в которых сохраняются клетки, способные генерировать основные клеточные фенотипы ЦНС: нейроны, глиальные клетки и олигодендроглию, дало новый инструмент для исследований проблем нейрогенеза и, в особенности, проблем дифференцировки клеток в нейральном направлении. Это также позволило развить идею о применении таких культур в практических целях для трансплантации при различных патологиях ЦНС. За последние десять лет были сделаны существенные шаги в экспериментальных подходах по сохранению и размножению популяций НСПК млекопитающих в культуре. Широкий спектр исследований показывает, что культуры НСПК, а именно нейросферы, гетерогенны. Эта гетерогенность обусловлена: собственными свойствами стволовых клеток, входящих в состав культуры, а именно тем, как они и их потомки отвечают на факторы среды; областью мозга, из которой были получены клетки; стадией развития мозга; перманентным состоянием клеток на момент посева. Таким образом, не смотря на идентичность протоколов культивирования, существует много факторов, которые отражаются на результатах культивирования. Поэтому, одной из важнейших задач, которую необходимо решать, приступая к работе по выращиванию популяций НСПК, является изучение закономерностей их развития и получение молекулярных и морфологических характеристик клеток в них в условиях in vitro. Задача получения характеристик клеточных культур, особенно первичных, вызвана необходимостью создания единого представления о таком объекте, как культуры НСПК и, в особенности культуры НСПК человека, которые имеют перспективу клинического использования.
В связи с этим, в настоящем исследовании были поставлены следующие задачи. Исследовать клеточный состав нейросфер и их организацию и сравнить с ранее полученными данными. Провести анализ поведения клеток нейросфер после их осаждения в условиях среды, стимулирующей дифференцировку, и дать их морфологическое описание. Изучить детально экспрессию маркеров в клетках осажденных нейросфер. Сравнить клеточные популяции НСПК, выращенные в виде нейросфер в среде с митогенами и в виде адгезивной культуре в среде с сывороткой. Исследовать культуры НСПК на предмет присутствия в них клеток ненейралыюго происхождения.
В работе было исследовано восемь культур НСПК, полученных из эмбрионального мозга человека 9-12-ти недель развития. В этот период развития анатомия головного мозга эмбриона человека представлена всеми основными отделами, на которые обычно разделяют зрелый мозг. Это - (1) передний мозг, включающий в себя конечный мозг с хорошо выраженными большими полушариями и промежуточный мозг, (2) средний мозг, (3) задний мозг, представленный зачатком мозжечка и варолиевым мостом, и (4) продолговатый мозг. В указанный период развития большие полушария конечного мозга, имея незначительную толщину, представлены в основном эпендималыюй и субэпендимальной зонами. Ярко выраженная организация слоев нервных клеток отсутствует.
Первичную суспензию клеток эмбрионального мозга человека получали путем диссоциации кусочков тканей, выделенных из больших полушарий конечного мозга. Затем проводили культивирование (см. Главу 2). Ниже приведены протоколы культивирования популяций НСПК эмбрионального мозга человека, которые исследовали в данной работе. 1. Клетки для культивирования были выделены из мозга плода человека 9.5-ой недель гестации. Культивирование проводили параллельно двумя способами в бессывороточной среде с ЭФР и ФРФ-2 и в среде с 10% ФСТ без факторов роста. Через 15 дней культивирования свободноплавающие нейросферы и снятые трипсином клетки, выращенные предварительно в виде адгезивной культуры на пластике, поместили в чашки Петри с круглыми покровными стеклами в среду с 10% ФСТ без факторов роста. Клетки в этих условиях росли еще 3 дня. После этого материал забирали для иммуногистохимических исследований. 2. Клетки для культивирования были выделены из мозга плода человека 9.5-ой недель гестации. Культивирование проводили на бессывороточной среде с ЭФР и ФРФ-2. Образцы свободноплавающих нейросфер через 1 и 7 дней после начала культивирования были использованы для гистологических, иммуногистохимических и электронно-микроскопических исследований. 3. Клетки для культивирования были выделены из мозга плода человека 9.5-ой недель гестации. Культивирование проводили по схеме: среда с ФРФ + ЭФР + ЛИФ (+ гепарин) - 2-е недели; среда с ФРФ-2 (+ гепарин) - 2-е недели; среда с ЭФР - 2-е недели; среда с ФРФ-2 (+ гепарин) - 2-е недели; среда с ФРФ-2 и LIF (+ гепарин) - 9 дней. При смене комбинации ростовых факторов клетки тщательно пипетировали с трипсинизацией, добиваясь диссоциации до единичных клеток. Диссоциированные клетки с общим сроком культивирования 65 дней были использованы для трансплантации в головной мозг гипоксированных крыс. Для гистологических и электронно-микроскопических исследований образцы свободноплавающих нейросфер забирали в тот же день, когда проводили трансплантацию. 4. Клетки для культивирования были выделены из мозга плода человека 11-ти недель гестации. Культивирование проводили на бессывороточной среде с ЭФР и ФРФ-2. Для иммуногистохимических исследований образы свободноплавающих нейросфер забирали на 15-ый день культивирования, а прикрепленных нейросфер на 18-ый день после трехдневного осаждения на покровные стекла в среде с 10% ФСТ и без факторов роста. 5. Клетки для культивирования были выделены из мозга плода человека 9-ти недель гестации. Культивирование проводили на бессывороточной среде с ЭФР и ФРФ-2 в течение 17-ти дней. Затем свободноплавающие нейросферы поместили в чашки Петри с круглыми покровными стеклами в среду с 10% ФСТ без факторов роста еще на 3 дня. Прикрепившиеся нейросферы использовали для иммуногистохимического анализа. 6. Клетки для культивирования были выделены из мозга плода человека 9.5-ой недель гестации. Культивирование проводили на бессывороточной среде с ЭФР и ФРФ-2. Через 25 дней после начала культивирования часть нейросфер диссоциировали, и суспензию клеток трансплантировали в головной мозг нормальных и гипоксированных крыс. В этот же день были взяты образцы свободноплавающих нейросфер для иммуногистохимических исследований. Оставшиеся нейросферы продолжили культивировать, и часть из них перевели на среду с 10% ФСТ и без факторов роста. Через 3 дня прикрепленные к покровным стеклам нейросферы взяли для иммуногистохимического анализа. Свободноплавающие нейросферы культивировали еще 12 дней, и затем поместили в среду с 10% ФСТ и без факторов роста на 2 дня. Эти образцы также были взяты для иммуногистохимического анализа.
