Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Гибриды соматических клеток как объект для исследования 9
1.1. Значение гибридизации клеток в изучении генетических проблем 9
1.2. Слияние и гибридизация клеток 12
1.3. Изоляция гибридных клонов (селективные системы) 18
1.4. Потери хромосом в гибридных клетках 25
Глава II. Гибридизация соматических клеток в изучении признаков дифференцировки 33
2.1. Проявление признаков дифференцировки в гибридных соматических клетках 33
2.2. Значение определения фермента щелочной фосфатазы в медицинской практике 37
2.3. Генетическая детерминация щелочной фосфатазы 39
Глава III. Цитологическое проявление функционирования рибосомных генов 44
3.1. Активность ядрышковых организаторов в нормальных клетках человека 44
3.2. Активность ядрышковых организаторов в опухолевых клетках и клетках с аномальным кариотипом 47
3.3. Ассоциации акроцентрических хромосом и цитологическое проявление в клетках человека 50
3.4. Активность ядрышковых организаторов в гибридных клетках 53
Глава ІV. Материалы и методы 61
4.1. Клеточные линии 61
4.2. Селективные и неселективные питательные среды 61
4.3. Метод пассирования 62
4.4. Глубокое замораживание штаммов, клеточных линий и клонов 63
4.5. Гибридизация клеток человека и китайского хомячка 64
4.6. Цитоморфологический анализ родительских и гибридных клеток 65
4.7. Определение времени удвоения популяции клеток 66
4.8. Выявление фермента щелочной фосфатазы 67
4.9. Приготовление хромосомных препаратов . 68
4.10. Окраска хромосомных препаратов 69
4.11. Критерии оценки активности ядрышковых организаторов и ассоциативной способности методом Ag-окраски 70
4.12. Микрофотографирование 71
Глава V. Получение гибридных соматических клеток человек-китайский хомячок 72
Характеристика родительских клеток . 72
5.1. Выживаемость клеток на среде ГАТТ 72
5.2. Влияние уабаина на жизнеспособность клеток 74
5.3. Влияние полиэтиленгликоля на клетки человека и китайского хомячка 76
5.4. Гибридизация клеток человека и хомячка . 79
Глава VІ. Доказательства гибридой природы полученных клонов 81
6.1. Морфология клеток 81
6.2. Культуральные свойства . 81!
6.3. Время удвоения популяции клеток 83
6.4. Хромосомный состав гибридных клонов 84
Глава VII. Сохранение родительских признаков в гибридных клетках . 100
7.1. Влияние компонентов селективной среды на выживаемость гибридных клеток 100
7.2. Активность щелочной фосфатазы в гибридных клетках 104
Глава VIII. Исследование состояния ядрышковых организаторов в гибридных соматических клетках человек-китайский хомячок 108
8.1. Активность ЯОР хромосом человека и китайского хомячка в родительских и гибридных клетках 108
8.2. Ассоциации ЯОР хромосом в гибридных клетках 115
8.3. Количество активных ЯОР хромосом в клонах различной плоидности 120
Обсуждение 128
Выводы... 145
Список сокращений 146
Список литературы . 147
- Значение определения фермента щелочной фосфатазы в медицинской практике
- Активность ядрышковых организаторов в опухолевых клетках и клетках с аномальным кариотипом
- Влияние полиэтиленгликоля на клетки человека и китайского хомячка
- Активность ЯОР хромосом человека и китайского хомячка в родительских и гибридных клетках
Введение к работе
Актуальность темы, В настоящее время мы являемся свидетелями бурного развития новой отрасли в биологии - биоинженерии. Одним из ярких представителей этого направления является гибридизация соматических клеток. С использованием этого метода уже получены важные результаты в области картирования и определения сцепления генов человека, изучаются механизмы регуляции действия генов, исследуются проблемы канцерогенеза, дифференпировки. С помощью гибридизации стало возможным получение гибридом - клонов клеток, синтезирующих моноклональные антитела, которые, в свою очередь, являются уникальным инструментом для изучения молекулярных механизмов функционирования многих биологических структур. Применение техники соматической гибридизации внесло важный вклад и в практическую медицину - установлена гетерогенность ряда наследственных заболеваний.
Для медицинских исследований наиболее пригодными являются межвидовые соматические гибриды, в которых в качестве одного из партнеров для слияния использованы нормальные клетки человека. Однако, ввиду ряда технических сложностей, в нашей стране этот метод не отработан.
Гибридизация соматических клеток является наиболее удобным экспериментальным подходом для изучения наследования родительских признаков на клеточном уровне. Среди других признаков особый интерес представляют ферменты, характеризующиеся нестабильным проявлением. Одним из таких ферментов является щелочная фосфатаза (Щ) человека. Определение Щ имеет диагностическую ценность при ряде заболеваний, в том числе и наследственных болезней (М.Г.Щубич, Б.С.Нагоев, 1980; stigbrand et al , 1982).
Исследование Щ во многом затруднено ввиду его нестабильного проявления в клетках. Вместе с тем закрепление этого признака в ряде клеточных поколений с помощью метода соматической гибридизации сделал бы Щ удобным объектом для анализа, К настоящему времени проявление фермента Щ в межвидовых соматических гибридах не исследовано Исследования межвидовых соматических гибридов с помощью Ag-окраски внес существенный вклад в выяснении закономерностей функционирования рДНК. Было установлено, что серебром окрашивается лишь транскрибщонно активный в предшествующей интерфазе ядрышкообразующий район хромосомы (ЯОР) (Miller et ai. , 1976а), было показано ядрышковое доминирование в гибридах мышь-человек ( Miller et al, 1976а. 19766), крыса-человек ( Miller et al , 1978a ; Tantravahi et al , 1979), динамика ядрышкового доминирования в гибридах мышь-человек ( Dev et а\ 1979). Однако исследование гибридных клеток мышь-сирийский хомяк (міііег et al t 19786) и мышь-китайский хомячок (ffieide et al , 1979) показало совместное функционирование рРНК генов разных видов внутри одной клетки.
В гибридах человек-китайский хомячок функционирование рибо-сомных генов не исследовано.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось отработать метод получения гибридных соматических клеток человек-китайский хомячок с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ) и полной селективной среды, содержащей гипоксантин, аминоптерин, ти-мидин, глицин и уабаин (ГАТГУ), исследовать проявление фермента Щ в этих гибридах, исследовать активность ЯОР хромосом с помощью Ag-окраски. Для достижения поставленной цели последовательно решали следующие задачи.
1. Отработка дозы уабаина для среды ГАТГУ Определить способность роста родительских клеток на среде, содержащей гипо-ксантин» аминоптерин, тимидин и глицин (ГАТТ); исследовать чувствительность родительских клеток к уабаину. Установить оптимальное время экспозиции для слияния клеток агентом ПЭГ.
2. Доказать гибридную природу полученных клонов.
3. Определить проявление фермента ЩБ в гибридных клетках.
4. Исследовать активность ЯОР хромосом в гибридных клетках. Для этого сравнивали количество положительных по Ag-окраске ЯОР (Ag+H0P) хромосом в гибридных и родительских клетках, сравнивали количество клеток с ассоциациями в гибридных и родительских клетках.
5. Дать ответ на вопрос: как меняется количество Ав+Я0Р хромосом при увеличении уровня плоидности в клетках внутри одного генома, имеет ли место супрессия ЯОР после короткого времени или этот процесс происходит лишь в клетках межвидовых соматических гибридов. Для этого изолировали клоны клеток китайского хомячка разной плоидности и сравнивали количество Ag+H0P в клетках гиподиплоидных и гипотетраплоидных клонов.
Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые в отечественных исследованиях получены гибридные клоны соматических клеток (где в качестве одного из партнеров использовались нормальные клетки) человека и китайского хомячка.
Впервые обнаружено, что уабаин повышает выживаемость гибридных клеток после их длительного культивирования на селективной среде ГАТТ.
Установлено, что геном китайского хомячка не подавляет вы-являемость Щ& человека в гибридной клетке, при этом гибридная клетка наследует свойство нестабильного проявления Щ.
Впервые показана совместная активность ЯОР хромосом человека и китайского хомячка в гибридных клетках.
Впервые обнаружено резкое повышение ассоциативной способности ЯОР хромосом китайского хомячка на фоне уменьшения количества Ag+#0P в гибридной клетке по сравнению с клетками в родительской линии Впервые показано, что в клонах различной плоидности количество Ав+Я0Р хромосом китайского хомячка пропорционально плоидности.
Теоретическое значение и практическая ценность. Результаты проведенной работы, состоящие в обнаружении совместной активности ЯОР хромосом человека и китайского хомячка, появление ассоциативной способности ЯОР хромосом при снижении их активности в гибридных клетках, пропорциональная зависимость количества активных ЯОР хромосом хомячка с уровнем плоидности дают новое представление о функционировании рибосомных генов.
Отработанный нами метод получения межвидовых гибридных соматических клеток человек-китайский хомячок может быть использован для получения аналогичных гибридов для проведения фундаментальных исследований на гибридных соматических клетках. Установленное нами повышение выживаемости гибридных клеток при добавлении в среду уабаина может значительно повысить жизнеспособность полученных и изолированных гибридных клеток.
На основе разработанной наш методики соматической гибридизации в институте медицинской генетики были получены гибридные клетки человек-мышь и гибридомы-клоны гибридных клеток, продуцирующие моноклоналыше антитела.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались:
1) на межлабораторной конференции Института медицинской генетики АМН СССР, октябрь 1979 г. ;
2) на ученом совете Института генеративной функции человека имДордания МЗ ГССР, декабрь 1979 г, ;
3) на юбилейной конференции молодых ученых Института медицинской генетики АМН СССР, посвященной ІІО-ілетию со дня рождения В.И.Ленина, апрель 1980 г. ;
4) на I всесоюзном совещании по генетике соматических клеток в культуре в Звенигороде, октябрь 1980 г. ;
5) в Институте молекулярной биологии АН СССР, май 1981 г. ;
6) на Юбилейной конференции Института медицинской генетики АМН СССР, посвященной 15-летию основания института, июнь 1981 г. ;
7) на межлабораторной конференции Института медицинской генетики АМН СССР, март 1983 г. ;
8) на межлабораторной конференции Института генеративной функции человека имДордания, МЗ ГССР, май І983 г. ;
9) на межлабораторном семинаре "Гены и хромосомы" Института медицинской генетики АМН СССР, июнь 1983 г. ;
10) на ученом совете Института генеративной функции человека им.Жордания МЗ ГССР, март 1984 г. ;
11) в целом диссертационная работа апробирована на объединенном заседании межлабораторных семинаров "Гены и хромосомы" и "Гены и признаки" Института медицинской генетики АМН СССР 5 сентября 1984 г.
Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 4-х журнальных статьях в центральной печати и в материалах I Всесоюзного совещания по генетике соматических клеток в культуре (I статья).
Значение определения фермента щелочной фосфатазы в медицинской практике
Као и Риск (1970), получив впервые гибриды человек-китайский хомячок, также обнаружили, что в этих гибридных клетках элиминируются хромосомы человека. Хромосомы человека элиминируются и в гибридах человек-крыса (Weiss, Ephrussd, 1969). Следует заметить, что гибриды человек-мышь и человек-китайский хомячок используются наиболее часто, поскольку, во-первых, довольно часто удается получить гибридные клоны, содержащие всего несколько хромосом человека, что позволяет картировать в них генные локусы, кроме того, путем электрофоретического анализа легко и достоверно можно различить белковые компоненты обоих партнеров в составе гибридных клеток (Риск, 1974).
Miller с сотр. (1976а) продемонстрировали, что при слиянии клеток мыши А-9 (производное от клеток L ) с клетками лимфоблас-тоидной линии от больного лимфомой Буркниста происходит элиминация хромосом человека.
На определенном этапе исследований вначале казалось, что существенную роль в направленной элиминации хромосом имеет видовая принадлежность гибридизируемых клеток. При слиянии клеток определенных видов элиминируются хромосомы одного и того же вида.
Однако в ряде случаев наблюдались и исключения из этого положения . Minna и Coon (1974), исследуя гибриды человек-мышь, обнаружили, что элиминации подверглись хромосомы мыши. Сгосе с сотр. (1976), сливая клетки человека линии HTI0-80 с нормальными и опухолевыми клетками мыши, во всех случаях наблюдали элиминацию хромосом мыши. Клеточную линию НТЮ-80 в дальнейшем стали использовать и другие исследователи в качестве партнера для слияния. Она была выделена из фибросаркомной ткани 35-летнего мужчины, В большинстве клеток содержится 46 хромосом и почти не имеется хромосомных перестроек. Клетки в полутвердой среде растут в виде колоний (Rashed et al , 1974), способны вызвать опухоль у иммуносупрессированных животных (Jones et al , 1975).
В дальнейшем Miller с сотр. (1978) использовали для слияния также клетки НТЮ-80. Их сливали с различными клеточными линиями мыши, в том числе с линией 0ТТ6050, выделенной из тератокарцино-мы, и клеточной линией крысы. Во всех случаях элиминировались хромосомы грызунов. Tantxavahi с сотр. (1979) сливали клетки HT-I080-6TG (производные от клеток НТЮ-80 недостаточные по гену ГФРТ) с тремя различными линиями крысы обнаружили, что во всех случаях элиминировались хромосомы крысы. Результаты этих исследований показали, что в элиминации хромосом в межвидовых гибридах соматических клеток, помимо видовой принадлежности, важное значение могут иметь генетические свойства сливающихся клеток и что элиминации подвергаются хромосомы либо того, либо другого, но лишь одного родительского вида.
В отличие от вышеприведенных примеров, когда элиминации подлежат хромосомы лишь одного вида,Van der Noordea с сотр. (1972), исследуя гибриды мышь-крыса, обнаружили, что элиминируются хромосомы обоих видов. В дальнейшем элиминацию хромосом обоих родительских видов наблюдали Miller с сотр. (1978) в гибридах мышь-сирийский хомяк и Weide с сотр. (1979) в гибридах мыть-китайский хомячок.
Разными исследователями высказывались предположения, что причиной элиминации хромосом является асинхронность репликации ДНК, генетический контроль митаза, преждевременная конденсация и пульверизация хромосом, генетическая несовместимость между родительскими генами и нарушение контроля метаболизма белков (Weiss and Ephrussi , 1966 ; Engel et al , 1969 ; Kao and Puck, 1970 Barclay et al , 1972 ; Rao and Johnson , 1972 ; Handmaker 1973 ; Bennet et al , 1976 ; Labella et al , 1976 ; Wang et al 1979). В целом установлено, что обычно теряются хромосомы того родительского партнера, клетки которого размножаются медленней (Т.И.1зужиевская, 1978). Это подтверждается данными Какпаковой с сотр., которые изучили II клонов внутривидовых соматических гибридов, происходящих от слияния злокачественных фибробластов, трансформированных вирусом sv -40, и нормальных лимфоидных, не культивировавшихся in vitro клеток джунгарского хомячка Все гибриды оказывались злокачественными, практически во всех случаях сохранялись маркеры опухолевого партнера, а преимущественной элиминации подвергались в основном хромосомы нормального партнера (Е.СКакпакова с сотр., 19806).
В настоящее время в генетике соматических клеток в сферу исследований начинают вовлекаться виды животных, имеющих народнохозяйственное значение. Недавно было показано, что в гибридах китайский хомячок-кролик (Echard et al , 1981) элиминируются хромосомы кролика, а в гибридах китайский хомячок-американская норка (Н.Б.Рубцов и сотр., 1982) элиминируются хромосомы норки. Результаты подобных исследований даются в сводных таблицах, где указывается хромосомы какого вида элиминируются (Н.Рингерц, Р. Сэвидж, 1979). Это позволяет исследователям правильно отбирать клетки для слияния и заранее знать, хромосомы какого вида будут сегрегировать.
Важным вопросом при изучении элиминации хромосом в гибридных клетках представляется динамика этого процесса, т.е. когда начинается потеря хромосом, какой период времени охватывает и как происходит этот процесс в разных клетках гибридного клона.
Исследуя кинетику потери хромосом в гибридах мышь-человек Schall и Rechsteiner (1978) установили, что время, когда начинается потеря хромосом в гибридных клетках может различаться в зависимости от генетических свойств сливающихся клеток. В частности, авторы показали, что при слиянии клеток мыши ЗТЗ(ТК") с нормальными фибробластами человека, потеря хромосом начинается сразу же после слияния ; но при слиянии тех же мышиных клеток ЗТЗ с опухолевыми клетками человека HeLa (ГФРТ""), элиминация начинается после 5-Ю делений.
Активность ядрышковых организаторов в опухолевых клетках и клетках с аномальным кариотипом
При выделении гибридных клеток очень важно, чтобы на селективной среде погибали клетки обоих родительских партнеров и выживали только гибриды. Для гибели клеток 2-го партнера, а именно, нормальных человеческих клеток, решено было апробировать пригодность использования в селективной среде уабаина. Уабаин является аналогом строфантина и подавляет активность К, Na-зависимой АТфа-зы. Признак резистентности к уабаину является доминантным по отношению к чувствительности. Согласно литературным данным клетки грызунов в 1000 и более раз резистентны к уабаину, чем клетки человека (Chu and Powell , 1976).
Поэтому для разработки метода гибридизации мы, с одной стороны, исследовали чувствительность клеток китайского хомячка и человека к различным концентрациям уабаина и, с другой, предприняли попытки выделения резистентных к уабаину клеток хомячка.
На таблице 2 представлены результаты выживаемости клеток китайского хомячка (клон М) и клеток человека (штаммы ИМГ-І58 и ИМГ-794) на среде с различными концентрациями уабаина. Из таблицы видно, что увеличение концентрации уабаина от. 0 до 5 мкМ существенно не сказывается на выживаемости клеток М. Увеличение концентрации от 5 мкМ до 50 мкМ вызывало понижение выживаемости этих клеток в первом опыте до 20,8$, во втором опыте - до 27,6$ по сравнению с контролем. Концентрация 1000 мкМ привела к почти полной гибели клеток. Влияние уабаина на клетки человека начало сказываться при значительно более низких концентрациях.
Клетки человека не размножались при концентрации уабаина 0,005 мкМ и погибали при концентрации, равной 0,05 мкМ, на 6 день после посева. В то же время эффективность посева хомячко-вых клеток М при дозе 50 мкМ уабаина была сравнимой с эффективностью посева на нормальной среде. Эти результаты позволили избрать для селективной среды, предназначенной для выделения гибридов, концентрацию уабаина, равную 0,5 мкМ.
Таким образом, селективной средой для выделения гибридов в наших экспериментах служила среда ГАТТ плюс уабаин в дозе 0,5 мкМ, т.е. полная селективная среда ГАТІУ.
Из литературных данных известно, что полиэтиленгликоль ока-зывает сильное токсическое действие на клетки. К тому же разные исследователи использовали ПЭГ с различными молекулярными массами. Поэтому нам необходимо было исследовать влияние избранного наїли полиэтиленгликоля на клетки человека и китайского хомячка.
О способности вызывать слияние судили по образованию двух-ядерных и многоядерных клеток после обработки монослойных культур в течение I и 2 минут полиэтиленгликолем. На рис.1 представлена зависимость образования гомокарионов клеток человека (ИМГ-І58) и китайского хомячка (М) от длительности обработки ПЭГ. Как видно из представленного рисунка, процент образования гомокарионов при одноминутном воздействии ПЭГ для клеток человека составляет 12,4$, а для клеток китайского хомячка 10$ ; при увеличении времени воздействия ПЭГ до двух минут?, возрастает процент образования гомокарионов ; для клеток человека до 18,4$, а для клеток китайского хомячка до 13,2$. Таким образом, увеличение времени воздействия ПЭГ от одной минуты до двух минут увеличивает образование гомокарионов в обеих родительских линиях. Цель следующей серии опытов состояла в том, чтобы выяснить цитотоксическое действие ПЭГ в зависимости от длительности воздействия В одном из опытов было установлено, что эффективность посева клеток китайского хомячка линии М при одноминутном воздействии ПЭГ снижается до 57,8$, а при двухминутном - до 32,6$ по сравнению с контролем. Такая же обратная зависимость выживаемости от длительности экспозиции наблюдалась на клетках человека в трех экспериментах. В среднем, на следующий день после обработки ПЭГ в течение одной минуты количество выросших клеток составляло 61,2$, а после двух минут - 26,1$ по сравнению с клетками, не подвергавшимися воздействию полиэтиленгликоля. Учитывая высокую токсичность двухминутной обработки ПЭГ, для опытов по гибридизации была избрана экспозиция клеток с полиэтиленгликолем в течение I минуты.
Результаты экспериментов по гибридизации клеток человека и китайского хомячка представлены в таблице 3. Из данных таблицы видно, что на селективной среде ГАТІ7 практически не выживают клетки китайского хомячка (вариант I) и полностью погибают клетки человека (вариант 2). Незначительный рост колоний в I варианте первого опыта, вероятно, обусловлен возникновением ревертан-тов среди мутантных клеток китайского хомячка М.
Незначительный рост колоний в 4 варианте второго опыта также может быть обусловлен либо ростом ревертантов клеток китайского хомячка, либо родительских мутантных клеток китайского хомячка в результате метаболической кооперации с клетками человека. Однако второе предположение менее вероятно, поскольку клетки человека погибают при воздействии уабаина уже на 6 день. Следовательно родительским клеткам китайского хомячка не с чем кооперироваться .
Рост клеток в 3-ем варианте на фоне "нулевых" значений в остальных контрольных вариантах свидетельствует о том, что мы имеем дело с формированием колоний из гибридных клеток человек--хомячок.
Влияние полиэтиленгликоля на клетки человека и китайского хомячка
Исследование различных признаков в гибридных и родительских клетках позволяет оценить вклад генетических и средовых факторов в фенотип гибридных клеток. В данном разделе представлены данные о влиянии длительного культивирования гибридных клеток в неселективной среде на способность формировать колонии в селективных средах, содержащих те же компоненты, которые использовались для отбора гибридных клеток во время гибридизации. Исследование проводили на гибридных клетках М0И-8-І и М0И--8-3, которые являются субклонами гибридного клона М0И-8,
Для отбора гибридных клеток МОИ-8 при гибридизации использовали среду ГАТТ плюс уабаин в концентрации 10 мМ. Необходимо было выяснить, как долго и в какой степени гибридные клетки М0И-8-І и МОИ-8-3 сохраняют в неселективных условиях родительские признаки: признак клеток человека - выживать на среде ГАТТ и признак клеток китайского хомячка - выживать на среде с уабаином в дозе I мМ.
С этой целью популяцию каждого субклона разделили на 2 суб популяции, одна из которых велась на среде ГАТГ, другая на нормальной среде. Сопоставляли влияние длительного культивирования на нормальной среде с культивированием на селективной среде ГАТТ, В экспериментах анализировалась выживаемость клеток на нормальной среде, среде ГТГ, среде ГАТГ и среде с уабаином (I мМ).
Как показывают данные таблицы 6, выживаемость гибридных клеток М0И-8-І и МОИ-8-3 на нормальной среде в эксперименте в значительной степени зависит от условий длительного культивирования перед экспериментом. Следует отметить сходство в поведении обоих гибридных субклонов. Их абсолютная эффективность посева на нормальной среде достаточно высока, если клетки культивировали на нормальной среде (69,8 и 79,4), и резко снижается после культивирования на среде ГАТГ (17,3 и 22,4).
После культивирования в неселективной среде оба клона сохраняют достаточно высокую эффективность посева на среде ГАТТ и среде с уабаином (для субклона М0И-8-І значения равны 74,2$ и 95,4$ соответственно ; для субклона МОИ-8-3 - 67,3$ и 89,9$).
На токсическое действие аминоптерина указывает также тот факт, что гибридные клетки, длительное время инкубировавшиеся на среде ГАТТ, имеют более высокую выживаемость на среде ГАТТ по сравнению с нормальной. Еще более высокая жизнеспособность клеток наблюдается на среде ГТГ, в отсутствии аминоптерина. В данном случае относительная эффективность посева выражается уже величинами, превышающими 100$, так как за 100$ принимали выживаемость клеток на нормальной среде. Видимо, действительно, целесообразно во время изоляции гибридных клеток не сразу переводить их со среды ГАТГ на нормальную среду, а сначала некоторое время.инкубировать на среде ГТГ, с целью их быстрейшего размножения, как это и делается в некоторых работах (Draber et al , 1980).
Не удивительно, что после длительного культивирования на среде ГАТГ, добавление к нормальной среде гипоксантина, тимиди-на и глицина, даже в присутствии аминоптерина, увеличивает эффективность посева гибридных клеток по сравнению с нормальной средой. Однако неожиданным оказался тот факт, что добавление уабаи-на также повышает эффективность посева гибридных клеток по сравнению с нормальной средой (у клеток М0И-8-І эффективность посева составила 373,7$, у клеток МОИ-8-3 - 383,8$).
Для того, чтобы выяснить, сказывается ли в данном случае на фенотипе гибридных клеток сочетание двух геномов или имеет место физиологическое влияние уабаина, независимо от того, действует ли он на генотип гибридной или негибридной клетки, выделили резистентные к уабаину клетки 0-1 из клеток линии китайского хомячка 237. После выделения клетки 0-1 культивировали на среде ГАТТ в течение 29 пассажей. Часть клеток 0-1 на 27 пассаже перевели на культивирование с нормальной средой и пассировали 2 раза. С этими двумя субпопуляциями клеток поставили аналогичные эксперименты. Данные представлены в той же таблице.
Результаты указывают, что после длительного культивирования на среде ГАТТ клетки 0-1 так же, как и гибридные клетки, имеют более высокую эффективность посева на среде с уабаином (132,2$) по сравнению с нормальной средой. Приведенные данные экспериментов позволяют заключить, что после культивирования на селективной среде ГАТГ выживаемость на нормальной среде как гибридных, так и уабаинрезистентных клеток китайского хомячка понижается, но повышается при добавлении уабаина в нормальную среду.
В этом разделе мы показали, что в гибридных клетках проявляются на протяжении длительного времени такие признаки родительских клеток, как свойства клеток человека - расти на селективной среде ГАТГ, и свойства клеток хомячка - резистентность к уабаину. Наследование этих признаков можно было предположить ввиду селективного сохранения Х-хромосомы человека, содержащей ген ГФРТ, и доминантной наследуемости признака резистентности к уабаину.
Активность ЯОР хромосом человека и китайского хомячка в родительских и гибридных клетках
Появление ассоциативной способности ЯОР хромосом хомячка в гибридных клетках наблюдается на фоне снижения активности ЯОР по сравнению с родительскими клетками, что было установлено нами ранее. В данной главе мы наблюдали, что в гибридных клетках при увеличении количества Я0-хромосом, их активность снижена по сравнению с клетками родительских видов. Является ли этот процесс взаимодействием лишь двух геномов или супрессия ЯОР происходит при увеличении количества ЯОР-хромосом в клетках внутри одного генома? Хотя в литературе есть сведения о соотношении количества Ав+Я0Р с количеством Я0-хромосом, однако авторы сравнивают при этом клетки, содержащие разные количества ЯОР, либо опухолевые ткани разного происхождения и с разным числом ЯОР. Результаты, полученные при этих исследованиях, носят противоречивый характер (Л.Н.Мамаев, 1980 ; Hubbell and Hay, 1977 ; Miller et al , 1978 ; Trent et al , 1980).
Вместе с тем, Dev с сотр. (1979) установили, что в гибридных клетках мышь-человек сохраняется первоначально активный ЯОР обоих видов и лишь к 12 дню наблюдается супрессия ЯОР хромосом человека. Таким образом, результаты, полученные об активности ЯОР в опухолевых клетках с увеличенным количеством ЯОР не отвечают на вопрос: сохраняется ли такое состояние ЯОР, либо со временем происходит снижение их активности в "экстрахромосомах".
Решить этот вопрос можно путем сравнения Ав+Я0Р в родительских клетках и клетках, полученных от внутривидового слилния, либо путем сравнения количества Ag+H0P в клонах различного уровня шюидности.
В настоящее время в литературе нет информации об активности ЯОР хромосом в клонах различной плоидности ни для какого вида. В этой связи нам представлялось важным исследовать этот вопрос в клетках китайского хомячка, имеющих общее происхождение с клетками М и М0-І, использованных нами в качестве родительских линий и не отличающихся от последних по кариотшу.
Для исследования активности ЯОР в клонах разной плоидности в работе использовали имеющие общее происхождение (от клеток 237j), резистентные к 6-меркаптопурину клоны M-I5-2 и М с модальным числом хромосом 18 (гиподиплоид) и 36 (гипотетраплоид) соответственно. Для выделения клонов с повышенной плоидностью использовали селективный агент уабаин (I мМ). Известно, что резистентность к уабаину обусловлена доминантной мутацией. Поэтому среди выживших на уабаине колоний выше вероятность встретить клоны с повышенной плоидностью. Из клеток M-I5-2 были выделены резистентные к уабаину клоны МО-2-3, МО-2-4, МО-2-5 ; из клеток М выделен клон М0-І. Все резистентные к уабаину клоны оказались гипотетраплоидами, с модальным числом хромосом 36.
Установлено, что в клоне М0-І изменений кариотипа по сравнению с исходными клетками М не произошло. В клонах М0-2-3, М0--2-4 и МО-2-5 увеличение числа хромосом произошло за счет удвоения всех хромосом исходных клеток M-I5-2, в том числе ядрышко-образующих, без преимущественной дупликации каких-либо определенных хромосом (рисЛІ, 12, ІЗ, 14).
С целью выявления более четкой корреляции между количеством Ag+H0P и уровнем плоидности в гиподиплоидном клоне исследовали клетки, содержащие лишь 18 хромосом, а в гипотетрапло-идных клонах клетки, содержащие 36 хромосом, С помощью -окраски было установлено, что в клетках гиподиплоидного клона M-I5-2 І, Ш и ІУ ЯО-хромосомы содержались по одной каждая, а число ЯО-хромосомы П в этих же клетках равнялось 2. В клетках всех гипотетрашюидных клонов число каждой ЯО-хромосомы было увеличено вдвое по сравнению с гиподиплоидным клоном M-I5-2, т.е. I хромосом было 2, П - 4, Ш - 2, ІУ - 2 (рис.II, 12, 13, 14).
С целью исключения влияния уабаина на количество Ав+Я0Р в полученных гипотетрашюидных клонах, дополнительно сравнивали количество Ав+Я0Р клеток линии М, не культивировавшиеся на среде с уабаином с клетками его производного клона - М0-І, полученном как и клоны МО-2-3, МО-2-4 и МО-2-5 путем селекции на среде с уабаином, но при этом не претерпевшим изменения карио-типа.- Результаты исследования представлены в таблице 12.
Прежде всего заметим, что, как видно из таблицы 12, количество Аб+Я0Р среди клеток линии М и клона M0-I практически не различаются, это свидетельствует о том, что культивирование на среде с Уабаином не влияет на количество выявляемых Аб+Я0Р в хромосомах хомячка, следовательно активность ЯОР в клетках гиподиплоидного и гипотетраплоидных клонов отражает истинную зависимость активности ЯОР от уровня плоидности.
