Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Стволовые клетки и их типы 12
1.1.1. Эмбриональные карциномные клетки. Тератомы, тератокарциномы 14
1.1.2. Эмбриональные стволовые клетки 15
1.1.2.1. Механизмы сохранения плюрипотентности и гены, участвующие в поддержании плюрипотентного статуса линий ЭС клеток 20
1.1.2.2. Маркеры, характерные для шнорипотентных клеток 26
1.1.3. Эмбриональные терминальные клетки 27
1.1.4. Трофобластные стволовые клетки 28
1.1.4.1. Постимплантационное развитие эмбрионов, дифференцировка трофобластных клеток in vivo и формирование плаценты 28
1.1.4.2. Получение и дифференцировка ТС клеток 30
1.1.4.3. Транскрипционные факторы и сигнальные пути, характерные для ТС клеток мыши и их производных 32
1.1.5. Стволовые клетки экстраэмбрионалыюй энтодермы 37
1.2. Инактивация Х-хромосомы в клетках самок млекопитающих 39
Глава 2. Материалы и методы 45
2.1. Экспериментальные животные 45
2.2. Растворы, буферы 45
2.3. Среды для получения и культивирования клеточных линий 46
2.3.1. Ростовая среда для получения и культивирования первичных эмбриональных фибробластов 46
2.3.2. Ростовая среда для культивировании ЭС клеток мыши 46
2.3.3. Ростовая среда для получения и культивирования СК полевки эмбрионального происхождения 46
2.3.4. Приготовление кондиционной среды для культивирования СК полевки без эмбриональных фибробластов 46
2.3.5. Ростовая среда для культивирования ТС клеток мыши 47
2.3.6. Среда для культивирования эмбриоидных тел 47
2.4. Получение культур клеток 48
2.4.1. Получение первичных эмбриональных фибробластов 48
2.4.2. Получение стволовых клеток полевки из предымплантационных бластоцист 48
2.4.3. Получение ЭГ клеток полевки из эмбрионов на стадии 7,5-8,5 д.п.о 49
2.5. Культивирование клеток 49
2.5.1. Культивирование первичных эмбриональных фибробластов 49
2.5.2. Культивирование и селекция СК полевки 50
2.5.3. Культивирование ЭС клеток мыши 51
2.5.4. Культивирование ТС клеток мыши 51
2.6. Замораживание клеток в жидком азоте 52
2.7. Размораживание клеток 52
2.8. Субклонирование 52
2.9 Тесты по оценке плюрипотентности линий полученных клеток 53
2.9.1. Гистохимическое выявление активности эндогенной щелочной фосфатазы 53
2.9.2. Спонтанная дифференцировка in vitro стволовых клеток полевок 53
2.9.3. Дифференцировка СК полевок in vivo 54
2.9.4. Иммуногистохимичсское выявление поверхностных клеточных антигенов ЕСМА7 и SSEA-1, транскрипционных факторов GATA4 и GATA6 54
2.10. Анализ кариотипа стволовых клеток 55
2.10.1. Фиксация клеток в суспензии 55
2.10.2. Фиксация культуры клеток в чашке Петри 56
2.10.3. Дифференциальное окрашивание хромосом (G-окрашивание) 56
2.10.4. Анализ плоидности линий СК полевок при помощи ДНК профилирования ядер клеток 56
2.11. Выделение РНК 57
2.11.1. Общие требования 57
2.11.2. Выделение РНК с помощью RNAzol В 57
2.11.3. Обработка РНК ДНКазойІ 58
2.12. Синтез кДНК методом обратной транскрипции 58
2.13. Полимеразная цепная реакция 59
2.14. Электрофорез ДНК в агарозном геле 60
2.15. Флуоресцентная in situ гибридизация 60
2.16. РНК-ДНК флуоресцентная in situ гибридизация 62
2.17. Выявление позднореплицирующегося хроматина 62
Глава 3. Результаты 64
3.1. Попытки получения СК полевки эмбрионального происхождения с использованием LIF мыши 64
3.2. Получение СК обыкновенной полевки эмбрионального происхождения с использованием LIF полевки 66
3.3. Фенотипическая характеристика полученных клеток полевки 67
3.4. Культивирование полученных клеток полевки 68
3.5. Дифференцировка полученных линий СК полевки 69
3.5.1. Спонтанная дифференцировка полученных клеток in vitro 69
3.5.2. Индуцированная дифференцировка полученных культур клеток 71
3.6. Анализ активности щелочной фосфатазы в полученных клетках 75
3.7. Кариотипирование полученных СК полевки 77
3.8. Молекулярно-генетическии анализ профиля экспрессии генов в полученных клетках полевки 79
3.9. Инактивация Х-хромосомы в полученных СК полевки 84
Заключение 97
Выводы 100
Список используемой литературы 101
- Инактивация Х-хромосомы в клетках самок млекопитающих
- Среды для получения и культивирования клеточных линий
- Тесты по оценке плюрипотентности линий полученных клеток
- Получение СК обыкновенной полевки эмбрионального происхождения с использованием LIF полевки
Введение к работе
Актуальность работы
Стволовые клетки (СК) представляют собой клетки, способные к интенсивной пролиферации в недифференцированном состоянии, а таюке к дифференцировке в зрелые специализированные типы клеток. СК являются экспериментальной моделью in vitro для изучения молекулярных процессов поддержания недифференцированного состояния и направленной дифференцировки клеток в раннем развитии млекопитающих: Научно-исследовательский интерес многих ученых обращен на проблему получения, характеристики и дальнейшего применения СК различных видов животных и человека. Изучаются возможности широкого применения этих клеток в лечении дегенеративных, в том числе аутоиммунных заболеваний, а таюке в направленной дифференцировке для образования различных органов и тканей.
Возможность получения из плюрипотентных СК человека большого количества чистых популяций эуплоидных клеток, таких как кардиомиоциты, нейроны, гепатоциты, может обеспечить потенциально безграничный источник клеток для трансплантаций, а также для тестирования лекарственных препаратов. Многие заболевания, такие как болезнь Паркинсона, рассеянный склероз, цирроз печени, диабет, возникают в результате гибели или дисфункции лишь одного или нескольких типов клеток. При трансплантации в пораженный орган СК, взятых у самого больного, или клеток, полученных при репрограммировании соматических клеток собственно пациента с последующей дифференцировкой в необходимый тип клеток, можно решить важнейшую проблему гистонесовместимости и иммунного отторжения. Поэтому работы по репрограммированию разных типов дифференцированных клеток в плюрипотентные являются революционными как в области фундаментальной науки, так и для клинической и экспериментальной медицины (Maherali et al., 2007; Takahashi et al., 2007; Yu et al., 2007; Okita et al., 2008; Kim et al., 2009). Таким образом, получение и исследование различных типов СК позволяет изучать механизмы не только поддержания недифференцированного состояния и направленной дифференцировки, но и репрограммирования клеток, что поможет лучше понимать эти процессы и позволит управлять ими.
Однако работы по репрограммированию были бы невозможны без
8 предшествующей колоссальной работы многих ученых по изучению СК разного происхождения. Известно, что при культивировании в определенных условиях предымплантационных бластоцист можно получить три основных типа СК. В зависимости от происхождения их разделяют на эмбриональные стволовые (ЭС) клетки, которые дают производные всех трех зародышевых листков, образующих собственно эмбрион, трофобластные (ТС) и экстраэмбриональные энтодермальные (XEN) клетки, участвующие в формировании экстраэмбриональных тканей, в том числе и плаценты. Вышеупомянутые типы СК отличаются по способу получения, культивирования, степени дифференцированности, экспрессии специфичных молекулярных маркеров, вкладу в химерные эмбрионы. Мышь является единственным млекопитающим, у которого были получены и детально проанализированы все три типа СК. Надо отметить, что получение видоспецифичных
СК является сложным процессом, зависящим от индивидуальных особенностей эмбриогенеза и требующим разработки оригинальных подходов.
В последнее время много фундаментальных работ посвящено изучению трофобластных стволовых клеток, которые являются производными клеток экстраэмбриональной эктодермы (ЭкЭ). Клетки ЭкЭ играют важную роль в имплантации эмбрионов и дальнейшем развитии эмбриональной части плаценты -первого жизненно важного экстраэмбрионального органа, нарушение формирования или функции которого приводят к гибели эмбрионов. ТС клетки вызывают большой интерес в связи с их применением в качестве модели in vitro для изучения механизмов имплантации и плацентации, а также для исследования сигнальных взаимодействий между эмбриональными и экстраэмбриональными клетками в ранних эмбрионах. Поэтому особенно интересным представляется изучение сигнальных факторов и взаимодействий у разных видов млекопитающих, выявление общих закономерностей и экстраполяция их на человека.
В лаборатории эпигенетики развития Института цитологии и генетики СО РАН изучают механизмы инактивации Х-хромосом у самок обыкновенных полевок рода Microtus. Интерес к изучению инактивации у обыкновенных полевок вызван феноменом неслучайной инактивации, происходящим при скрещивании межвидовых гибридов (Zakian et al., 1987), тогда как у мыши и человека в соматических тканях инактивация Х-хромосомы происходит случайным образом. Идеальным
9 инструментом для исследования данного процесса являются плюрипотентные стволовые клетки, так как инактивация одной из двух родительских Х-хромосом, происходящая при их дифференцировке in vitro, моделирует ситуацию, имеющую место в раннем эмбриональном развитии самок млекопитающих. Таким образом, данная работа посвящена получению СК обыкновенных полевок для изучения особенностей инактивации Х-хромосомы у самок этого вида млекопитающих.
Цель и задачи исследования
Целью данной работы было получение и характеристика стволовых клеток эмбрионального происхождения обыкновенных полевок рода Microtus.
Для достижения поставленной цели необходимо выполнение следующих задач:
Получение стволовых клеток обыкновенных полевок из предымплантационных бластоцист и эмбрионов более поздних стадий развития.
Характеристика полученных линий: фенотипическая характеристика; цитогенетическая характеристика (кариотипирование); оценка степени плюрипотентности (проведение теста на экспрессию эндогенной щелочной фосфатазы, получение эмбриоидных тел, инъекция клеток мышам линии Balb/c-nu и композиционный анализ полученных опухолей); анализ экспрессии специфичных молекулярно-генетических маркеров стволовых клеток, характерных для недифференцированных эмбриональных стволовых клеток (гены Oct4, Nanog, SSEA-1, ЕСМАТ), трофобластных стволовых клеток (гены Fgfr2, Errfi, Cdx-2, Eomes) и клеток экстраэмбриональной энтодермы (гены Gata4, Gata6, Нп/4, Foxa2, Sall4); исследование статуса Х-хромосом в полученных стволовых клетках самки полевки.
Научная новизна
Впервые получены подобные трофобластным стволовым клеткам мыши линии стволовых клеток обыкновенной полевки Microtus rossiaemeridionalis. Показано, что, в отличие от трофобластных стволовых клеток мыши, для их выделения и продолжительного культивирования не требуется фактор FGF4. Проведен
10 уникальный сравнительный анализ полученных клеток полевки с трофобластными стволовыми клетками мыши, показавший их сходство по характеру роста, экспрессии молекулярно-генетических маркеров, а также типу дифференцированных производных.
Практическая значимость
Получение линий трофобластных стволовых клеток позволяет создать новую клеточную систему in vitro для исследования регуляции пролиферации трофобласта и его дифференцировки, изучения генетических механизмов импринтированной инактивации Х-хромосомы в экстраэмбриональных тканях. Также трофобластные стволовые клетки могут служить моделью in vitro для изучения процессов образования и функционирования плаценты и помогут в лечении различных патологий беременности, приводящих к аномалиям развития зародыша и спонтанным выкидышам, связанным с нарушением развития плаценты.
Апробация результатов
Материалы диссертации были представлены на:
Международном симпозиуме по биологии клетки в культуре «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия», Санкт-Петербург, 2004; VI Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток", Звенигород, 2005;
Второй международной конференции по Х-инактивации, Франция, 2006;
Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии», Томск, 2007;
Международной конференции «Хромосома 2009», Новосибирск, 2009; семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН.
Публикации
По материалам диссертационной работы автором опубликованы три научные статьи в отечественной и зарубежной печати. ,
Вклад автора
Экспериментальная работа по получению, культивированию, фиксации ТС-подобных клеток, цитогенетический анализ полученных культур, а также тесты по оценке плюрипотентности (гистохимическое выявление активности щелочной фосфатазы, инициация дифференцировки) проводились автором самостоятельно. Анализ экспрессии генов, специфичных для стволовых клеток в различной степени дифференцированности, иммунофлуоресцентныи анализ, флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH), РНК-ДНК FISH, анализ поздней репликации проводились автором совместно с А.И. Шевченко. ДНК профилирование ядер проводилось автором совместно с Я.Р. Ефремовым.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, выводов и списка используемой литературы. Работа изложена на 117 страницах, содержит 19 рисунков и 4 таблицы.
Инактивация Х-хромосомы в клетках самок млекопитающих
Одним из важных процессов, протекающих в эмбриональных клетках и тканях в ходе раннего развития зародышей самок млекопитающих in vivo (Okamoto et al., 2004), а также в плюрипотентных CK при дифференцировке in vitro (Wutz, Jaenisch, 2000), является инактивация Х-хромосомы. Исследование дифференцировки культур плюрипотентных клеток открывает широкие возможности в изучении различных мутаций центра инактивации Х-хромосомы (ХІС/Хіс, X inactivation centre) и анализе их влияния на вероятность инактивации родительских Х-хромосом.
Инактивация Х-хромосомы - явление, при котором одна из двух родительских Х-хромосом в клетках самок млекопитающих в раннем эмбриогенезе гетерохроматизируется и становится транскрипционно неактивной. Данный механизм уравнивает дозу генов Х-хромосомы у гомогаметных самок и гетерогаметных самцов (Lyon, 1961). Инициация инактивации Х-хромосомы связана с событиями ранней дифференцировки, происходящими в течение развития мыши, а также сопровождается подавлением транскрипции генов и различными модификациями хроматина неактивной Х-хромосомы (см. обзор Шевченко и др., 2006). Процесс инактивации Х-хромосомы подразделяется на четыре этапа: подсчет хромосом; инициация инактивации; распространение по длинне Х-хромосомы гетерохроматинового состояния и поддержание неактивного состояния на протяжении последующих митотических делений (см. обзор Avner, Heard, 2001).
На человеческой Х-хромосоме был идентифицирован ген XIST (X inactive specific transcript) в пределах XIC (на мышиной Х-хромосоме ему соответствует ген Xist) (Brown et al., 1991), продуктом которого является некодирующая ядерная РНК длинной около 16 000 нуклеотидов. Используя in situ гибридизацию, было обнаружено накопление транскрипта гена XIST на периферии интерфазного ядра около тельца Барра, причем, наблюдалась корреляция между количеством накопленной XIST РНК и числом неактивных Х-хромосом в анеуплоидных клетках (Brown et al., 1992). Было также показано, что в дифференцированных ЭС клетках Xist РНК экспрессируется исключительно с неактивной Х-хромосомы и, вероятно, находится в ассоциации с ней (Brockdorff et al., 1992). В настоящее время экзон/интронная структура гена XIST/Xist достаточно хорошо изучена у многих видов млекопитающих (Ноге et al., 2007; Brockdorff et al., 1992; Nesterova et al., 2001), также было показано наличие альтернативных вариантов сплайсинга этого гена у человека (Brown et al., 1992), мыши (Sheardown, 1997) и полевки (Павлова и др. 2004). Обнаружено, что Х-хромосома с протяженной делецией в гене XIST не способна инактивироваться (Clerc, Avner, 1998). Однако дальнейшие исследования показали, что локализация Xist РНК на активной Х-хромосоме мыши не приводит к инактивации этой хромосомы (Clemson et al., 1998). Также было показано, что, установившись однажды, неактивное состояние стабильно в отсутствие Xic и гена Xist (Lee, Jaenisch, 1997). Другими словами, на ранних стадиях развития инактивация X хромосомы является Jfr -зависимой и обратимой, тогда как в дифференцированных клетках поддержание молчания неактивной Х-хромосомы является Х/ -независимым и, как правило, необратимым процессом. Было предположено, что ассоциация Xist РНК с будущей неактивной Х-хромосомой может инициировать дальнейшие события, требуемые для транскрипционного молчания неактивной Х-хромосомы.
Более поздние исследования в области инактивации Х-хромосомы выявили ген Tsix, расположенный на антисмысловой цепи ДНК в пределах Xic (Lee et al., 1999). РНК гена Tsix находится исключительно в ядре и не найдена ни в одной клетке на неактивной Х-хромосоме. Ген Tsix является негативным регулятором гена Xist, так как, при разрушении промотора гена Tsix, происходила конститутивная экспрессия РНК гена Xist в z/ис-положении, что приводило к инактивации материнской X-хромосомы в экстраэмбриональных тканях (Lee, Lu, 1999; Lee, 2000). Поскольку X-хромосома отцовского происхождения в этих тканях уже была инактивирована (см. ниже), то инактивация материнской Х-хромосомы приводила к гибели эмбриона.
Рассмотрим некоторые аспекты инактивации и реактивации Х-хромосомы в раннем эмбриональном развитии мыши. При помощи РНК флуоресцентной in situ гибридизации (РНК FISH анализ) было показано, что стабильный транскрипт гена Xist, накапливается во всех XX бластомерах, начиная с 2-А-х клеточной стадии. Далее происходит ряд модификаций хроматина отцовской Х-хромосомы и к стадии средней бластоцисты данная хромосома приобретает инактивированное состояние (Kay et al., 1993; 1994). Однако, по мере развития, судьба неактивной Х-хромосомы отцовского происхождения отличается в клетках ТЭ и ВКМ бластоцисты, которая подразделяется на клетки эпибласта и экстраэмбриональной энтодермы. В клетках ТЭ отцовская X-хромосома сохраняет неактивный статус, приобретенный к стадии средней бластоцисты. Тогда как в клетках ВКМ поздних бластоцист на 4,5 д.п.о. происходят глобальные изменения на неактивной Х-хромосоме - утрата модификаций неактивного хроматина, в результате чего происходит реактивация Х-хромосомы (Мак et al., 2004; Okamoto et al, 2004; Шевченко и др., 2006). В экстраэмбриональной энтодерме, несмотря на утрату ряда модификаций, статус экспрессии генов остается таким же, как в ТЭ, на отцовской Х-хромосоме обнаруживается стабильный транскрипт гена Xist. На 6-6,5 д.п.о. репликация инактивированной Х-хромосомы в ТЭ и экстраэмбриональной энтодерме смещается в позднюю S фазу, по сравнению с активной Х-хромосомой и аутосомами (Gartler, Riggs, 1983; Schmidt, Migeon, 1990; Heard etal, 1997).
Среды для получения и культивирования клеточных линий
45 % среды а-МЕМ (а-modification Minimum Essential Medium, Invitrogen) или F12 (Nutrient Mixture, Invitrogen), 45 % среды D-MEM (Dullbecco s Modified Eagle Medium, Invitrogen), 8-10 % эмбриональная телячья сыворотка (FCS, fetal calf serum, Autogene Bioclear), 1 мМ L-глютамин (Invitrogen), 50 ед/мл пенициллин (Invitrogen), 50 мкг/мл стрептомицин (Invitrogen). 85 % среды G-MEM (Glasgow Minimum Essential Medium, Invitrogen) или F12/DMEM (1:1), 15% FCS (Autogene Bioclear), lx раствор несущественных аминокислот (NEAA, non-essential amino acids, Invitrogen), 1 мМ L-глютамин (Invitrogen), 50 ед/мл пенициллин (Invitrogen), 50 мкг/мл стрептомицин (Invitrogen), 0,1 мМ Р-меркаптоэтанол (Sigma), LIF мыши (Chemicon), конечная концентрация 1000 ед/мл. За основу брали состав среды для получения и культивирования ЭС клеток мыши с небольшими модификациями. Среда для получения СК полеки: 40 % среды F12 (Nutrient Mixture, Invitrogen), 40% среды D-MEM (Invitrogen), 20% FCS (Autogene Bioclear), lx NEAA (Invitrogen), 1 мМ раствор пиру вата натрия (Invitrogen), 1 мМ L-глютамин (Invitrogen), 50 ед/мл пенициллин (Invitrogen), 50 мкг/мл стрептомицин (Invitrogen), їх нуклеозиды, 0,1 мМ Р-меркаптоэтанол (Sigma), LIF полевки 0,1-0,2 мкг/мл (получен группой сотрудников лаборатории во главе со Слободянюком С.Я.). - для культивирования стабильных линий СК полевки добавляли 15 % FCS. - для культивирования стабильных линий СК полевки LIF не добавляли.
Кондиционную среду готовили, руководствуясь протоколом получения кондиционной среды для ТС клеток мыши (протокол MRC Clinical Science Center, London). Для ее приготовления использовали митотически инактивированные эмбриональные фибробласты мыши (см. раздел "Культивирование первичных эмбриональных фибробластов"). В культуральных матрасах с плотным монослоем инактивированных ЭФМ меняли среду на следующую: 42% среды F12 (Nutrient Mixture, Invitrogen), 42% среды D-MEM (Invitrogen), 15 % FCS (Autogene Bioclear), 50 ед/мл пенициллин (Invitrogen), 50 мкг/мл стрептомицин (Invitrogen). Оставляли в С02 инкубаторе — — (37-Сг 5 %- углекислого газа, влажная камера) на трое суток. Далее среду центрифугировали 10 минут на 1500 об/мин и добавляли: lx NEAA (Invitrogen), 1 мМ раствор пирувата натрия (Invitrogen), 1 мМ L-глютамин (Invitrogen), 50 ед/мл пенициллин (Invitrogen), 50 мкг/мл стрептомицин (Invitrogen), їх нуклеозиды, 0,1 мМ р-меркаптоэтанол (Sigma), LIF полевки до конечной концентрации 0,1-0,2 мкг/мл. Кондиционную среду для культивирования СК полевки готовили из расчета 60-70 % среды, кондиционированной эмбриональными фибробластами, и 40-30 % ростовой среды (см. пункт 2.3.3.). 40 % среды F12 (Nutrient Mixture, Invitrogen), 40 % среды D-MEM (Invitrogen) или 80 % среды RPMI 1640 (Invitrogen), 20 % FCS (Autogene Bioclear), 1 мМ раствор пирувата натрия (Invitrogen), 0,1 мМ Р-меркаптоэтанол (Sigma), 2 мМ L-глютамин (Invitrogen), 50 ед/мл пенициллин (Invitrogen), 50 мкг/мл стрептомицин (Invitrogen), 25 нг/мл FGF4 (Sigma), 1 мкг/мл гепарин (Sigma). 45 % среды F12 (Nutrient Mixture, Invitrogen), 45 % среды D-MEM (Invitrogen), 10 % FCS (Autogene Bioclear), lx NEAA (Invitrogen), 0,1 мМ Р-меркаптоэтанол (Sigma), 1 мМ L-глютамин (Invitrogen), 50 ед/мл пенициллин (Invitrogen), 50 мкг/мл стрептомицин (Invitrogen). В качестве питающего субстрата для стволовых клеток мыши и полевки использовали эмбриональные фибробласты полевки (ЭФП) М. kirgisorum, М. arvalis, М. rossiaemeridionalis и ЭФМ, которые получали по стандартному методу (Robertson, 1987). Из рогов матки животных выделяли эмбрионы на 12-14 день после оплодотворения (д.п.о.). Промывали в буфере DPBS, удаляли голову и печень. Измельчали ткани в небольшом количестве раствора трипсина. Полученные измельченные ткани эмбрионов инкубировали в 3-4 мл раствора трипсина в С02 инкубаторе 20 минут. После инактивировали действие трипсина ростовой средой для получения и культивирования первичных эмбриональных фибробластов (см. пункт 2.3.1.), центрифугировали 5 минут при 1000 об/мин, удаляли супернатант, ресуспендировали клетки в той же ростовой среде и переносили в культуральныи матрас (из расчета 1 эмбрион на 50-75 см2). Получали СК по ранее описанному методу (Robertson, 1987). На 3,5 д.п.о. из матки полевок М. rossiaemeridionalis, М. arvalis и М. kirgisorum минимальной средой М2 (Sigma) вымывали морулы и бластоцисты на ранней, средней и поздней стадии развития. Бластоцисты также получали в результате межвидовых скрещиваний: М. rossiaemeridionalis х М. arvalis, М. arvalis х М. rossiaemeridionalis, М. rossiaemeridionalis х М. kirgisorum. Для получения бластоцист с разросшейся ВКМ их инкубировали in vitro в ростовой среде для получения и культивирования СК полевки (см. пункт 2.3.3.) без добавления LIF в течение суток в блестящей оболочке (zona pellucida), предотвращающей прикрепление к эмбриональным фибробластам. Для дальнейшего прикрепления бластоцист блестящую оболочку снимали при помощи инкубации в растворе Тироде в течение 1-2 минут и высаживали в 4-ячеечные планшеты (по 2-3 бластоцисты на лунку), с заранее посаженными митотически инактивированными эмбриональными фибробластами (см. ниже), в ростовую среду для получения и культивирования СК полевки эмбрионального происхождения. Культивирование бластоцист проводили в С02
Тесты по оценке плюрипотентности линий полученных клеток
Стволовые клетки очень чувствительны к условиям культивирования. При достижении большой плотности посева клеток или изменении рН среды начиналась их дифференцировка. Для получения спонтанно дифференцированных производных СК полевок достаточно было оставить клетки без пересева или без смены среды на 3-4 дня. Культивирование без эмбриональных фибробластов Для получения дифференцированных производных в отсутствие эмбриональных фибробластов, полученные клетки полевки пересаживали на покрытые 0,1% желатином лунки. Получение ЭТсуспензионным методом Суспензию СК полевок малой плотности (1-2 млн.) высаживали в среду для культивирования ЭТ на 90 мм культуральные чашки Петри без эмбриональных фибробластов и желатина на 3 дня. После образовавшиеся колонии аккуратно смывали от дна струей среды и переносили в бактериологические чашки или чашки Петри, покрытые 1% агарозой (Sigma). Через 7-21 день сформированные ЭТ вновь помещали в культуральные чашки Петри без фибробластов, где они распластывались, росли и дифференцировались в течение 8-15 дней. Для индукции дифференцировки в полученных клетках полевки in vivo производили инъекцию суспензии клеток (8-9 млн. в 150 мкл среды без сыворотки и ростовых факторов) подкожно в область шеи между ушей бестимуспым мышам линии Balb/c-nu и изогенной линии полевок М. rossiaemeridionalis. Через 1—3 недели животных умерщвляли методом цервикальной дислокации и проводили анализ полученных опухолей. Стенки капсулы опухолей фиксировали раствором
Буэна (Ромейс, 1953), делали гистологические срезы и анализировали состав тканей (анализ проводили П.А. Дыбан и А.П. Дыбан). Часть стенок измельчали и культивировали в ростовой среде для СК полевки. Иммуногистохимическое окрашивание полученных клеток проводили согласно ранее описанной методике (Baribault, Kemler, 1989). СК обыкновенной полевки, растущие на стеклах с полилизиновым покрытием, промывали 2 раза DPBS, фиксировали в растворе 3,7-4 % формальдегид/DPBS 20 мин при 4 С и отмывали 2 раза по 5-Ю минут буфером DPBS или 0,05 % Tween-20 (Sigma)/DPBS. Выдерживали клетки с 0,1% Triton XI00 (Sigma)/DPBS 10 минут при комнатной температуре, и снова промывали дважды буфером. Инкубировали в блокирующем буфере (1% овальбумин или 4% козья сыворотка/DPBS) 30 минут при комнатной температуре и дважды промывали по 5 минут в DPBS. После инкубировали в течение 1 часа при 37 С с первыми антителами в следующих разведениях: - моноклональными антителами, полученными в мыши (ЕСМА7, любезно предоставленные доктором Кемлером; SSEA-1, любезно предоставленные доктором Н. Брокдорфом, без разведения; GATA4 (sc-25310, Santa Cruz Biotechnology), разведение 1:50; - поликлональными антителами, полученными в кролике (GATA6 (sc-9055, Santa Cruz Biotechnology) разведение 1:50). Отмывали DPBS 3 раза по 5-10 минут и инкубировали со вторыми флуоресцентно мечеными антителами к иммуноглобулинам мыши или кролика, anti-mouse IgG, FITC Conjugate (Sigma) и Alexa 568 goat anti-rabbit IgG (Ы+L) (Molecular probes) 30-60 минут при 37 С в темноте.
Промывали DPBS 3 раза по 5-Ю минут, дистиллированной водой. Готовили препараты следующим образом: обрабатывали раствором DAPI/антифейд (1:10) и накрывали покровным стеклом. Анализировали полученные препараты на флуоресцентном микроскопе NICON XI00. Изображения обрабатывали с помощью программного обеспечения фирмы Imstar и программы Adobe Photoshop (Adobe Systems 1989-2000). Для фиксации использовали клетки через 40 48 часов после посадки. За три часа до начала фиксации меняли среду на свежую ростовую среду. Добавляли этидиум бромид (до конечной концентрации 1,5 мкг/мл) на время от 20 минут до 2 часов 20 минут. Время экспозиции подбирали индивидуально для каждой культуры. Па 40 минут добавляли колхицин (до конечной концентрации 0,1 мкг/мл). Клетки собирали в две конические пробирки, стоящие на льду (при 0 С), и фиксировали независимо. В первую пробирку отбирали ростовую среду. Клетки промывали раствором ЭС-трипсина или DPBS и сливали в ту же пробирку. Добавляли ЭС-трипсин на 4-5 минут и вместе с оторвавшимися клетками переновили в первую пробирку. К оставшимся клеткам снова добавляли ЭС-трипсин на 4-5 минут, после добавляли ростовую среду для фибробластов, аккуратно пипетировали и все переносили во вторую пробирку. Центрифугировали 5 минут 1000 об/мин. Тщательно удаляли супернатант, добавляли в пробирку 3 мл гипотонического раствора (0,56% КС1). Держали 15-35 минут на водяной бане при 37 С. Время экспозиции варьировали в зависимости от культуры. Прикапывали 90-100 мкл фиксатора Карнуа (смесь метанол/уксусная кислота в объемном соотношении 3:1) 4 С. Центрифугировали 5 минут 1000 об/мин. Удаляли супернатант, добавляли 1 мл фиксатора и оставляли на 20 минут при 0 С. Ресуспендировали, центрифугировали и проводили еще две смены фиксатора. После третьей смены фиксатора раскапывали суспензию клеток на холодные влажные стекла. Визуализировали метафазы под микроскопом.
Получение СК обыкновенной полевки эмбрионального происхождения с использованием LIF полевки
В настоящее время коммерчески доступны два вида фактора LIF - мышиный и человеческий. Несмотря на значительную степень гомологии - более 80 %, фактор LIF человека уступает мышиному на три порядка в эффективности подавления роста мышиных миелоидных клеток линии Ml. Анализируя литературу, а таюке ранние попытки получения ЭС клеток полевки, был сделан вывод, что причиной неудач может являться использование гетерологичного цитокина LIF мыши. В связи с этим было решено выделить функциональный фактор LIF полевки М. rossiaemeridionalis, который в дальнейшем был получен группой сотрудников нашей лаборатории во главе со Слободянюком С.Я.. Клонирование кДНК LIF в плазмидном векторе, наращивание биомассы Е. coli, индукцию синтеза LIF, его выделение и очистку проводили, как описано на сайте фирмы New England BioLabs www.neb.com.
Эксперимент по культивированию ЭС клеток мыши (линия клеток TG-2a) в присутствии гетерологичного фактора LIF полевки показал, что фактор является неэффективным в поддержании недифференцированного состояния данных клеток. При добавлении в ростовую среду данного фактора в концентрации от 1:100 до 1:50 000, колонии ЭС клеток мыши ведут себя так же, как и в его отсутствие, то есть дифференцируются и перестают экспрессировать щелочную фосфатазу.
При использовании некоммерческого LIF полевки картина роста клеток из бластоцист полевок поменялась. В первом же эксперименте при посадке 12 предымплантационных бластоцист М. rossiaemeridionalis на ЭФП с добавлением LIF полевки каждая ВКМ дала от 1 до 42-х первичных колоний клеток. В настоящее время получены 3 стабильные независимые линии стволовых клеток М. rossiaemeridionalis и 1 линия получена из гибридных бластоцист
M. rossiaemeridionalis х М. arvalis (см. таблицу 2). Остальные колонии клеток были утеряны в результате спонтанной дифференцировки на 3-4 пассаже.
Полученные колонии клеток обыкновенной полевки отличаются по морфологии и характеру роста от многослойных колоний ЭС клеток мыши. Исследуемые клетки растут уплощенными колониями эпителиальной морфологии с четкими границами (рис. 3), напоминающими ТС клетки мыши (см. рис. 1).
Полученные клетки полевки делятся по периферии колоний, раздвигая клетки фибробластов, прикрепляясь ко дну культуральных чашек, покрытому желатином. Разросшиеся колонии в центральной области содержат клетки, расположенные в один слой с видимыми границами (рис. З.А), тогда как клетки в колониях через 24 часа после пересадки имеют плотные межклеточные контакты, образуя "ЭС-подобные" колонии клеток (рис. З.Б). По периферии колоний полученных линий клеток, аналогично колониям ТС клеток мыши (см. рис. 1), находятся интенсивно пролиферирующие клетки (рис. З.А).
На первых этапах культивирования использовали механический метод пересадки без трипсина при помощи микрокапилляра, так как использование ферментативных диссоциирующих буферов может приводить к дифференцировке первичных колоний. Метод механического пассирования также используют для линий ЭС-подобных клеток крысы (Vassilieva et al., 2000), крупного рогатого скота (Cibelli et al., 1998; Talbot et al., 2000), а также для культивирования ЭС и ЭГ клеток человека (Shamblott et al., 1998). По мере увеличения количества клеток проводили дезагрегацию индивидуальных колоний клеток в капле ЭС-трипсина, после чего переносили в ростовую среду. Также подобрали режим мягкого центрифугирования в течение 8 минут при 600 об/мин после дезагрегации полученных клеток ЭС-трипсином в лунках.
На более поздних пассажах (после 13-го пассажа) культуры клеток стали пересевать при помощи раствора трипсина с использованием стандартного центрифугирования (5 минут при 1000 об/мин). Пересадки осуществляли каждые 1-2 дня, не допуская перероста колоний клеток, так как было замечено, что большая плотность полученных колоний клеток провоцирует дифференцировку клеток, как было описано для человеческих линий ЭС клеток (Thomson et al., 1998).
Полученные клетки хорошо переносят не только вышеописанный режим культивирования, но и криоконсервацию. Исследуемые линии клегок пассировались, как минимум, 70 пассажей в течение девяти месяцев, существенно не меняя фенотипические характеристики. Устоявшиеся линии способны пролиферировать в отсутствие фактора LIF полевки на эмбриональных фибробластах как полевки, так и мыши, не дифференцируясь и без изменения морфологии колоний клеток. Надо заметить, что при их культивировании на желатинизироваиой подложке без эмбриональных фибробластов, далее в присутствии LIF полевки, происходила дифференцировка уже на 2-ом пассаже, тогда как при использовании 70% кондиционной среды и без эмбриональных фибробластов, удалось получить стабильные линии, культивируемые на протяжении, по крайней мере, 35 пассажей.
