Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Некоторые аспекты организации и эволюции генома млекопитающих 13
1.2. Гетерохроматиновые районы в хромосомах млекопитающих 16
1.2.1. Конститутивный гетерохроматин 16
1.2.2. Центромерные районы 20
1.2.3. Теломерные районы 26
1.2.4. Ядрышкообразующие районы 27
1.3. Повторяющиеся последовательности ДНК и хромосомные перестройки 32
1.3.1. Мобильные элементы 33
1.3.2. Интерстициальные теломерные повторы 34
1.3.3. Сегментные дупликации 36
1.4. Эволюционная консервативность Х-хромосомы млекопитающих 38
1.5. Микродисекционные ДНК-пробы в хромосомном пэйнтинге 40
1.6. Группа обыкновенных полевок рода Microtus (отряд Rodentia) 43
1.6.1. Систематическое положение и филогенетические отношения внутри группы 44
1.6.2. Кариологические характеристики обыкновенных полевок 45
Глава 2. Материалы и методы. 49
2.1. Животные 49
2.2. Получение культур первичных фибробластов легких 49
2.3. Фиксация клеток. 50
2.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом 51
2.5. Дифференциальное окрашивание метафазных хромосом 51
2.5.1. GTG-дифференциальное окрашивание хромосом 51
2.5.2. Ag-окрашивание 52
2.5.3. Последовательное окрашивание хромосом разными методами ...52
2.5.4. С-дифференциальное окрашивание 52
2.5.5. GTG-окрашивание хромосом для микродиссекции 53
2.6. Получение микродиссекционных ДНК-проб 53
2.7. Введение метки в ДИК микродиссекционных ДНК-проб 54
2.8. ДНК-проба для детекции рДНК 54
2.9. Флуоресцентная in situ гибридизация 54
2.9.1. Супрессионная in situ гибридизация 55
2.10. Детекция на цитологических препаратах меченых ДНК-проб 56
2.10.1. Детекция ДНК-проб, меченных биотин-16-дУТФ 56
2.10.2. Детекция ДНК-проб, меченых дигоксигенин-11-дУТФ 56
2.10.3. Совместное выявление двух гаптен-меченых ДНК-проб 57
2.11. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом 57
Глава 3. Результаты 58
3.1. Локализация ядрышкообразующих районов в хромосомах обыкновенных полевок 58
3.1.1. Локализация ЯО-районов с применением Ag-окрашивания хромосом 58
3.1.2. Локализация генов рибосомных РНКс применением FISH 62
3.1.3. Сравнение хромосомной локализации ЯО-районов у разных видов 64
3.2. Анализ реорганизации гомологов хромосом 5 и 8 М. arvalis "obscurus" при формировании дополнительных блоков гетерохроматина и в процессе эволюции видов 66
3.2.1. Характеристика дополнительных блоков гетерохроматина перестроенных гомологов хромосом 5 и 8 М arvalis "obscurus" 66
3.2.2. Районоспецифические ДНК-пробы хромосом M.arvalis «obscurus» 69
3.2.3. CISS-гибридизация ДНК-проб гетерохроматиновых блоков 5RC и 8RC 70
3.2.4. Сравнение организации эухроматиновых районов хромосом 8, 8R M.arvalis «obscurus» и ихгомеологов 74
3.2.5. Сравнение организации эухроматиновых районов хромосом 5 и 5KM.arvalis "obscurus" 75
3.2.6. Сравнение организации эухроматиновых районов хромосомы 5 M.arvalis "obscurus" и еегомеологов 77
3.3. Распределение в хромосомах полевок подрода Microtus кластеров повторяющихся последовательностей ДНК, выявленных
в разных вариантах FISH 78
3.3.1. CISS-гибридизация ДНК-проб гетерохроматинового блока 5RC сметафазными хромосомами полевок 78
3.3.2. CISS-гибридизация ДНК-пробы гетерохроматинового блока 8RC с метафазными хромосомами полевок 82
3.3.3. CISS-гибридизация ДНК-пробы р-плеча хромосомы 8R с метафазными хромосомами полевок; 84
3.3.4. Одновременная FISH ДНК-проб разных гетерохроматиновых блоков с метафазными хромосомами полевок 85
3.3.5. Межвидовые различия обыкновенных полевок по характеру распределения кластеров повторяющихся последовательностей, гомологичных ДНК гетерохроматиновых блоков M.arvalis «obscurus» 87 3.4. Анализ организации эухроматиновых районов Х-хромосом обыкновенных полевок 90
3.4.1. Установление гомологии эухроматиновых районов в Х-хромосомах полевок 92
3.4.2. Анализ возможных перестроек эухроматиновых районов Х-хромосом в эволюции обыкновенных полевок 94
3.4.3. Анализ локализации точек разрывов-воссоединений предполагаемых инверсий в ходе реорганизации Х-хромосом полевок 96
Глава 4. Обсуждение... 99
4.1.Кластеры гомологичных повторяющихся последовательностей ДНК в хромосомах обыкновенных полевок 99
4.2.Повторяющиеся последовательности ДНК и дивергенция видов обыкновенных полевок 101
4.3. ЯО-районы и кластеры повторяющихся последовательностей ДНК в хромосомах обыкновенных полевок 105
4.4. Эволюция ЯО-районов обыкновенных полевок 109
4.5. Транспозиции центромер в хромосомах полевок 113
4.5. Эволюция Х-хромосом обыкновенных полевок 116
Заключение 120
Выводы ...123
Список литературы пт7 125
- Повторяющиеся последовательности ДНК и хромосомные перестройки
- Последовательное окрашивание хромосом разными методами
- Анализ реорганизации гомологов хромосом 5 и 8 М. arvalis "obscurus" при формировании дополнительных блоков гетерохроматина и в процессе эволюции видов
- CISS-гибридизация ДНК-проб гетерохроматинового блока 5RC сметафазными хромосомами полевок
Введение к работе
Совокупность результатов дифференциального окрашивания хромосом, сравнительного картирования и сравнительного хромосомного пэйнтинга (ZOO-FISH) позволила провести сравнение хромосом у большого числа видов, даже у филогенетически весьма далеких, и определить основные закономерности макроэволюции геномов млекопитающих. К настоящему времени установлена гомология хромосом и хромосомных районов у нескольких десятков видов, выявлены, так называемые, консервативные районы хромосом млекопитающих, которые в ряде таксонов сохраняют свою целостность в течение десятков миллионов лет эволюции (O'Brien et al., 1999). Самой консервативной группой сцепления в геноме млекопитающих является Х-хромосома, и у всех плацентарных она представлена единым элементом (Graves, 1998). Кариотипическая эволюция внутри большинства таксонов обычно ограничивается рекомбинацией базовых элементов, внутрихромосомными инверсиями, транспозициями центромер и вариациями в локализации и размерах блоков С-гетерохроматина. В то же время, в некоторых филогенетических ветвях происходили значительные преобразования кариотипов за счет множественных перестроек хромосом, приводящих к нарушению их целостности и образованию новых групп сцепления (Rubtsov et al., 1988; Graphodatsky 1989). Значительная реорганизация хромосом в одних таксонах и их высокая консервативность в других свидетельствуют о неравномерных темпах хромосомной эволюции в разных ветвях филогенетического древа млекопитающих. Самые высокие темпы кариотипической дивергенции по современным представлениям характерны для мышевидных грызунов (Van Etten et al., 1999; Murphy et al., 2001).
Сравнительный цитогенетический и молекулярно-генетический анализ близкородственных видов показал, что наиболее эволюционно лабильными элементами хромосом являются центромерные, теломерные и ядрышкообразующие районы. Именно эти районы хромосом чаще- всего принимают участие в эволюционных межхромосомных перестройках при рекомбинации базовых групп сцепления и при создании новых морфологических вариантов хромосом за счет внутрихромсомных перестроек. Во всех
8 перечисленных выше районах хромосом находится большое число разнообразных повторяющихся последовательностей ДНК (Karpen, Allshire, 1997; Blackburn, 1991; Mefford, Trask, 2002).
Возможно, именно изучение закономерностей формирования кластеров повторяющихся последовательностей ДНК даст ключ к пониманию механизмов эволюционной реорганизации хромосом млекопитающих. Расположение «горячих точек» хромосомных перестроек при патологиях у человека в значительной степени совпадает с локализацией кластеров различных повторов в эухроматиновых районах хромосом (Azzalin et al., 2001; Bailey et al., 2002). Результаты ZOO-FISH продемонстрировали, что в эволюционных перестройках хромосом млекопитающих также существуют «горячие точки», то есть районы, в которых происходят разрывы хромосом в разных филогенетических ветвях. В некоторых случаях было показано совпадение локализации точек разрыва хромосом в эволюции млекопитающих с точками разрыва при хромосомных аномалиях у человека (Schibler et al., 1998).
В решении ряда вопросов, связанных с механизмами эволюционных хромосомных перестроек, большую пользу может принести сравнительный анализ близкородственных видов из таксонов, для которых характерны высокие темпы кариотипической эволюции. В хромосомах видов, начавших дивергировать относительно недавно, с большей вероятностью могут сохраниться «следы» молекулярных процессов, сопряженных с реорганизацией хромосом.
Одним из эффективных методов анализа реорганизации хромосом при сравнении близкородственных видов млекопитающих является хромосомный пэйнтинг с использованием районоспецифических ДНК-проб, полученных на основе микродиссекции метафазных хромосом. Такие ДНК-пробы с равным успехом могут быть получены и для эухроматиновых, и для гетерохроматиновых районов хромосом, поэтому их можно использовать для анализа различных вариантов хромосомных перестроек (Guan et al., 1994; Rubtsov et al., 1995; Chudoba et al., 1996). Применение районоспецифических ДНК-проб позволяет выявлять внутрихромосомные перестройки при сравнении гомологичных по генетическому составу хромосомных элементов разных видов. При анализе перестроек в эухроматиновых районах Х-хромосом млекопитающих хромосомный пэйнтинг
9 может быть информативным только при использовании районоспецифических ДНК-проб (Rubtsov et al., 1997; Hassanane et al., 1998).
Группа видов обыкновенных полевок (группа «arvalis») рода Microtus обладает набором характеристик, которые делают ее весьма перспективной для использования в качестве модельного объекта при изучении механизмов эволюции хромосом млекопитающих. Род Microtus относится к быстро эволюционирующей филогенетической ветви отряда Rodentia - мышевидным грызунам (Myomorpha). Обыкновенные полевки начали дивергировать относительно недавно, но при этом отличаются большим набором внутрихромосомных перестроек (Мейер и др., 1996; Mazurok et al., 2001). Ряд данных свидетельствует о том, что процесс реорганизации хромосом у наиболее молодого вида M.arvalis продолжается и в настоящее время.
Цели и задачи.
Основные цели данного исследования - выявление закономерностей реорганизации эволюционно лабильных районов хромосом и консервативных хромосомных элементов в ходе дивергенции близкородственных видов полевок рода Microtus. Для достижения поставленных целей необходимо было решить несколько конкретных задач.
Установить хромосомную локализацию ядрышкообразующих районов и сравнить ЯОР-несущие хромосомы у 4 видов обыкновенных полевок.
Определить наличие в хромосомах вида M.arvalis «obscurus» кластеров повторяющихся последовательностей, гомологичных последовательностям ДНК, принимавшим участие в формировании «новых» С-гетерохроматиновых блоков в аутосомах 5 и 8.
Провести анализ распределения в хромосомах обыкновенных полевок кластеров повторяющихся последовательностей, гомологичных последовательностям ДНК новых С-гетерохроматиновых блоков двух аутосом М. arvalis «obscurus».
Сравнить порядок расположения эухроматиновых сегментов р-плеча и околоцентромерного района q-плеча в стандартной хромосоме 5 М. arvalis «obscurus» с расположением гомологичных сегментов в перестроенном акроцентрическом гомологе с дополнительным блоком С-гетерохроматина.
Сравнить порядок расположения эухроматионовых сегментов р-плеча и околоцентромерного района q-плеча в хромосоме 5 М. arvalis «obscurus» с порядком сегментов в гомеологичных районах хромосом других видов обыкновенных полевок.
Определить расположение гомологичных эухроматиновых районов в Х-хромосомах пяти близкородственных видов рода Microtus, и провести анализ возможных перестроек в эволюции Х-хромосом полевок.
Научная новизна.
Впервые для сравнительного анализа хромосом полевок был применен пэйнтинг с использованием районоспецифических ДНК-проб, и не только эухроматиновых, но и гетерохроматиновых районов хромосом полевок.
Впервые было показано, что формирование «новых» гетерохроматиновых С-блоков в аутосомах полевок может происходить за счет амплификации последовательностей ДНК, представленных в виде кластеров в прителомерных, прицентромерных и ядрышкообразующих районах многих хромосом кариотипа.
Впервые однозначно показано, что транспозиция центромерного района при формировании акроцентрического гомолога хромосомы 5 М. arvalis «obscurus» не сопровождалась изменением позиции теломерного, центромерного и эухроматиновых сегментов р-плеча исходной субметацентрической хромосомы.
Впервые в хромосомах четырех видов обыкновенных полевок показана связь межвидовых различий в субхромосомной локализации ЯОР с наличием разных наборов кластеров повторяющихся последовательностей ДНК.
Впервые сравнительный анализ Х-хромосом близкородственных видов был проведен с использованием набора районоспецифических ДНК-проб, перекрывающих все эухроматиновые районы Х-хромосомы. При анализе перестроек в Х-хромосомах пяти видов серых полевок была обнаружена солокализация «горячих точек» эволюционных перестроек с расположением интеркалярных кластеров повторяющихся последовательностей.
Практическая ценность.
Данные по хромосомной локализации ЯО-районов и перестройкам внутри X-хромосом дополняют общую цитогенетическую характеристику хромосомных наборов четырех видов группы обыкновенных полевок, которая в настоящее время используется в качестве модельного объекта в работах по исследованию механизмов процесса инактивации в Х-хромосомах млекопитающих. Полученные в работе результаты расширяют наши представления о возможных механизмах эволюционных перестроек в хромосомах млекопитающих и позволяют по-новому взглянуть на роль повторяющихся последовательностей ДНК в возникновении однотипных перестроек хромосом, в том числе в эволюции ядрышкообразующих районов.
Апробация.
Результаты работы были доложены на следующих конференциях и совещаниях:
Конференция «Геном человека 2000», Черноголовка, декабрь 2000;
Всероссийское Совещание «Современные проблемы эволюции и филогении животных» Москва, 3-5 декабря 2001;
ISTC Scientific Advisory Committee Seminar^ on "Basic science in ISTC Activities" Novosibirsk, 23-27 April, 2001.
Кроме того, результаты были представлены на отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН в феврале 2002.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях. Работы были поддержаны грантами РФФИ, ПНГ и INTAS.
Вклад автора.
Автором были выполнены в основном или в полном объеме следующие виды работ: получение и культивирование используемых в работе первичных линий фибробластов полевок; фиксация клеток и приготовление препаратов метафазных хромосом для всех вариантов цитогенетического анализа и для микродиссекции; дифференциальное окрашивание хромосом разными методами и в различных комбинациях и анализ полученных при этом результатов; анализ результатов всех вариантов FISH; обработка и анализ полученных данных.
Мечение и FISH клонированного фрагмента ДНК, содержащего последовательности рДНК человека, провели к.б.н. Воробьева Н.В. и с.н.с. Сердюкова Н.А. (лаборатория цитогенетики человека и животных Института цитологии и генетики СО РАН).
Получение микродиссекционных ДНК-проб и FISH с их использованием выполнили д.б.н. Рубцов Н.Б.и к.б.н. Карамышева Т.В. (лаборатория морфологии и функции клеточных структур Института цитологии и генетики СО РАН).
Структура и объём диссертации.
Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы (257 ссылок); изложена на 146 страницах машинописного текста, иллюстрирована 19 рисунками и содержит 4 таблицы.
Повторяющиеся последовательности ДНК и хромосомные перестройки
В геноме эукариот значительная доля ДНК приходится на повторяющиеся последовательности. Различия по количеству повторяющихся последовательностей ДНК составляют основную причину разнообразия в размерах геномов (Britten, Kohne, 1968; Graphodatsky 1989). Повторяющиеся последовательности в совокупности формируют наиболее вариабельную и изменчивую часть генома, в отличие от его высоко консервативной кодирующей части. По мере накопления разнообразных данных становится все более очевидным, что разнообразные повторы вовлечены во многие процессы, происходящие в ядре и в клетке. Они выполняют структурную функцию в организации хроматина, являются составной частью таких важных хромосомных структур как теломеры, центромеры и ядрышковые организаторы, способны влиять на активность структурных генов, а также участвовать в создании новых генных комбинаций (Willard, 1990; Makalowski, 1995; Schmid, 1996).
В результате исследования повторов значительно изменились представления о стабильности генома, природе и источниках генетической изменчивости. К настоящему времени накоплено большое количество фактов, свидетельствующих о том, что перестройки хромосом, как в онтогенезе отдельной особи, так и в эволюции кариотипов млекопитающих, часто сопряжены с присутствием различных повторяющихся последовательностей (Giglio et al, 2001; Obe et al., 2002; Lonnig, Saedler, 2002). В некоторых случаях было показано совпадение локализации точек разрыва хромосом в эволюции млекопитающих с точками разрыва при хромосомных аномалиях у человека (Schilber et al., 1998; Azzalin et al., 2001). В связи с анализом механизмов эволюционных хромосомных перестроек значительный интерес представляют расположенные в эухроматиновых районах хромосом повторяющиеся последовательности ДНК такие, как мобильные элементы, интерстициальные теломерные повторы и сегментные дупликации. 1.3.1. Мобильные элементы.
Мобильные элементы - представляют собой высоко и умеренно повторяющиеся последовательности, диспергированные в геноме и способные к перемещению (транспозиции). Во многих случаях мобильные элементы сами кодируют ферменты, обеспечивающие их транспозицию. В зависимости от механизма перемещения их подразделяют на два класса: ретроэлементы (ретровирусы) и транспозиционные элементы (Finnegan, 1989; Charlesworth et al., 1994). Перемещение элементов первого класса происходит посредством обратной транскрипции РНК-копий (ДНК-РНК-ДНК), элементы второго перемещаются напрямую (ДНК-ДНК). Внутри каждого класса выделяются группы элементов, отличающихся структурными особенностями. Мобильные элементы были обнаружены у всех исследованных эукариот, в том числе и у млекопитающих. Наиболее распространеными ретроэлементами в геноме млекопитающих являются семейства LINE (Long interspersed nuclear element) и SINE (Short interspersed nuclear element) (Hutchison et al., 1989; Vogt, 1990; Tomilin, 1999), которые отличаются друг от друга структурой нуклеотидных последовательностей и особенностями локализации в геноме. У млекопитающих мобильные элементы расположены и в эухроматиновых и в гетерохроматиновых районах хромосом.
Совокупность имеющихся данных свидетельствует о том, что мобильные элементы могут принимать участие в различных вариантах реорганизации генома, изменяя комбинации (делеции, вставки, инверсии, транслокациии) и количество копий (дупликация и амплификация) последовательностей ДНК (Finnegan, 1989; Hutchison et al., 1989; Lonnig, Saedler, 2002). Причем в перестройки, опосредованные участием мобильных элементов, могут быть вовлечены и уникальные, и повторяющиеся последовательности. В некоторых ситуациях может происходить активация мобильных элементов (их активное расселение по геному), приводя к повышению частоты хромосомных перестроек и усилению процессов амплификации. События такого рода были обнаружены при межвидовой гибридизации у Drosophila (Engels, Preston, 1995; Petrov et al., 1995) и у гибридного кенгуру {Wallabia bicolor x Macropus eugenii) (O Neill et al., 1998). Молекулярные механизмы, лежащие в основе индуцирования хромосомных перестроек мобильными элементами, до конца не изучены. Одним из вероятных механизмов считается процесс рекомбинации, обусловленый гомологичным спариванием последовательностей диспергированных мобильных элементов, расположенных в негомологичных участках одной или разных хроматид. Кроме того, изменение позиции или числа копий уникальных последовательностей ДНК может быть опосредованно теми же механизмами (например, обратной транскрипцией), которые обеспечивают транспозицию расположенных рядом мобильных элементов (Finnegan, 1989; Lonnig, Saedler, 2002). 1.3.2. Интерстициальные теломерные повторы.
Присутствие кластеров теломерного повтора (TTAGGG)n в нетеломерных районах хромосом - прицетромерных, прителомерных, интеркалярных - было показано для разных видов позвоночных во многих исследованиях (Meyne et al., 1990; Bertony et al., 1996; Chute et al., 1997; Flint et al., 1997). Такие кластеры были названы интерстициальными теломерами (interstitial telomeres), сокращенно Its (Yen, et al., 1996; Azzalin et al., 2001). Размеры кластеров интерстициальных теломерных повторов отличаются у разных видов, и в разных районах хромосом. У китайского хомячка, например, прицентромерные районы практически всех хромосом содержат довольно крупные Its, занимающие от 250 до 500 т.п.н. (Faravelli et al., 1998). В интеркалярных районах хромосом мыши были выявлены примерно в 10 раз более мелкие кластеры теломерных повторов (Yen et al., 1996, 1997). Общее число выявляемых методом FISH интерстициальных теломер неодинаково в геномах разных видов. Так у китайского хомячка было выявлено 18, а у человека 50 таких кластеров (Slijepcevic et al., 1996; Azzalin et al., 1997). В отличие от итеркалярных и прицентромерных кластеров выявление прителомерных Its с использованием только FISH затруднено, поскольку на метафазных хромосомах их, как правило, нельзя отличить от собственно теломерных повторов. Для их выявления используют секвенирование прителомерных последовательностей ДНК (Chute et al., 1997; Flint et al., 1997; Azzalin et al., 2001). Кроме того, небольшие по размеру интеркалярно расположенные Its, могут остаться за пределами чувствительности метода in situ гибридизации. Поэтому общее количество Its в геноме млекопитающих может значительно превосходить то, что удается обнаружить в метафазных хромосомах с помощью FISH.
Последовательное окрашивание хромосом разными методами
Для получения последующего дифференциального или гомогенного (рутинного) окрашивания метафазных хромосом, предварительно окрашенных по Ag-методу, использовали методику Графодатского А.С. (Графодатский, Раджабли, 1988). После анализа Ag-окрашенных метафазных пластинок препараты отмывали от иммерсионного масла в ксилоле, затем в метанол-уксусном фиксаторе. Для удаления серебра препараты ополаскивали в 5-10% растворе красной кровяной соли, затем в проточной и дистилированной воде и высушивали. Последующее рутинное окрашивание для выявления вторичных перетяжек и уточнения субхромосомной локализации ЯО-районов проводили красителем Гимза или азур-эозином в течение 10 минут. Для идентификации ЯОР-несущих хромосом проводили GTG-дифференциальное окрашивание. В случае необходимости после рутинного окрашивания препараты отмывали от иммерсионного масла в ксилоле, обесцвечивали в фиксаторе, высушивали, а затем окрашивали по стандартному GTG-методу, как описано выше.
Для выявления районов конститутивного гетерохроматина использовали стандартный метод С-окраски (Sumner, 1972). Препараты обрабатывали 0,2N НС1 при комнатной температуре в течение 10-30 мин., ополаскивали дистиллированной водой и помещали в насыщенный горячий раствор Ва(ОН)2 (60-65С) на 5-15 мин. После этого препараты отмывали сначала в 0,2N НС1, затем в проточной воде и помещали в чашку Петри с буфером 2xSSC (lxSSC 0,15М NaCl и 0,015М цитрат натрия, рН 7. 0) при температуре 60-65 С. Через 1-1,5 часа препараты помещали в водный раствор красителя Гимза на 30-60мин. 2.5.5. GTG-окрашивание хромосом для микродиссекции.
Для получения GTG-исчерченности метафазных хромосом, предназначенных для микродисекции, препараты одну минуту инкубировали в буфере PBS (рН 7,2), затем обрабатывали 0,25% раствором трипсина (Bacto Trypsin Difco) в фосфатном буфере (рН 7,2) в течение 40-60 сек. при комнатной температуре, ополаскивали в PBS буфере и окрашивали 8%-ным раствором красителя Гимзы (Merck).
Микродиссекционные ДНК-пробы для проведения настоящих исследований были получены в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Института цитологии и генетики СО РАН. Микродиссекцию проводили на микроскопе AXIOVERT 10, оснащенном микроманипулятором IR (Zeiss, ФРГ) и механическим позиционером, в стерильных условиях специально приготовленными для этого микродиссекционными иглами. Диссектированный материал переносили в микрокаплю (20-40 нл), помещенную в силиконизированную микропипетку. Капля для сбора диссектированного материала содержала ЮмМ Трис НС1 (рН 7,5), ЮмМ NaCl, 0,1% SDS, 30% глицерин, 500 мкг/мл протеиназы К (Boehringer Mannheim). Во время сбора микропипетка находилась во влажной камере при комнатной температуре. По завершению сбора необходимого числа копий хромосом или хромосомных районов, пипетку с диссектированным хромосомным материалом переносили в коробку из нержавеющей стали, помещенную в водяную баню (60С), на 2 часа (Rubtsov et al., 2000b).
Амплификацию диссектированного материала проводили в полимеразной цепной реакции с частичновырожденным праймером MW6 (Telenius et al., 1992), в стандартных условиях (Rubtsov et al., 2000b). Качество и количество амплифицированного продукта проверяли методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. На старт наносили 1/10 объёма реакционной смеси. Гель окрашивали бромистым этидием (0,1 мкг/мл). Окрашенный гель смотрели в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе (Biometra).
При создании перекрывающихся ДНК-проб фрагменты хромосом для генерации каждой ДНК-пробы вырезали и собирали так, чтобы дистальному, относительно общего района диссекции, участку хромосомы соответствовало максимальное число собранных копий. Число собранных копий других сегментов хромосомы, в ходе создания ДНК-пробы, уменьшалось в направлении от этого «избранного» участка к концам района диссекции. Такой способ получения ДНК-пробы обеспечивал при проведении FISH максимальную интенсивность сигнала в «избранном» участке хромосомы и ее уменьшение в направлении второго района диссекции. При двухцветной FISH каждый сегмент анализируемого района имел уникальное соотношение интенсивностей сигналов двух разных ДНК-проб, которое можно было оценить на основании сравнения профилей относительных интенсивностей сигналов отдельных ДНК-проб.
ДНК метили в 17 циклах полимеразной цепной реакции (амплификатор фирмы Eppendorf (Mastercycler personal), температура крышки - 105С). 1 мкл DOP-библиотеки добавляли к 20 мкл ПЦР-смеси: ЮтМ Трис НС1, 50mM КС1, рН 8,3, 200 мкМ дАТФ, дЦТФ, дГТФ и 100 мкМ дТТФ и ЮОмкМ биотин-16-дУТФ или дигоксигенин-11-дУТФ, 2 мкМ DOP-праймера, 2,5мМ MgCb и 1,5 ед. Ampli Taq ДНК полимеразы. ПЦР проводили в режиме: денатурация 94С - 1 минута; отжиг 56С - 1,5 минуты; элонгация цепей при 72С - 2 минуты; с завершающей элонгацией цепей при 72С - 8 минут. Меченые продукты анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле. Па старт наносили 2 мкл реакционной смеси.
Клонированный в плазмиде pBR322 фрагмент гена 28S-PHK человека (3000 п.о.), меченный введением биотин-11-дУТФ, был любезно предоставлен лабораторией цитогенетики человека и животных Института цитологии и генетики СО РАН.
Анализ реорганизации гомологов хромосом 5 и 8 М. arvalis "obscurus" при формировании дополнительных блоков гетерохроматина и в процессе эволюции видов
В процессе анализа хромосом М. arvalis «obscurus» мы обнаружили гетероморфные пары аутосом у двух особей. Этот гетероморфизм был результатом наличия дополнительных блоков С-гетерохроматина в двух разных аутосомах. У одной особи это был дополнительный блок на длинном плече хромосомы 8, у другой - на коротком плече хромосомы 5. В каждой паре хромосом С-блок находился только на одном из гомологов (рис.6). Для удобства изложения здесь и в дальнейшем хромосомы с дополнительными блоками гетерохроматина будем обозначать 5R и 8R, а соответствующие им С-блоки - 5RC и 8RC. Обнаруженная нами перестройка хромосомы 5 М. arvalis «obscurus» полностью соответствовала описанной ранее в литературе (Раджабли, Графодатский, 1977; Малыгин, Саблина, 1994; Ахвердян и др., 1999). Один из гомологов имел достаточно крупный блок гетерохроматина, в пределах которого находились функционально активная центромера и функционально активный ядрышкообразующий район. По сравнению со стандартной хромосомой 5 не было обнаружено никаких заметных изменений GTG-исчерченности у перестроенного гомолога (рис.ба). Материал С-блока при этом выглядит как дополнительный по отношению к исходной хромосоме (рис. 66).
Гетероморфизм гомологов 8-ой пары хромосом М. arvalis «obscurus» до сих пор никем не был описан. Мы обнаружили перестройку только у одной самки, отловленной на территории Армении (Разданский район). Перестроенная хромосома легко идентифицируется и при GTG-, и при С-окраске метафазных хромосом. Формирование С-блока произошло в прителомерном районе длинного плеча хромосомы 8 (рис. 66), положение центромеры в хромосоме не изменилось. При С-окраске помимо основного крупного прителомерного блока на некотором расстоянии от него выявляется небольшой интеркалярный блок. Характер GTG-исчерченности в районе расположения этого блока несколько изменился по сравнению с исходным (рис. 6а). Эти изменения могут быть следствием инверсии, в результате которой небольшой участок эухроматина был перенесен в гетерохроматиновый блок и разделил его на две части. Однако нельзя исключить и независимое происхождение двух С-блоков. При этом также могли возникнуть изменения в GTG-исчерченности.
У особи М. arvalis «obscurus» с гетероморфной 8-ой парой хромосом ни в клетках костного мозга ни в фибробластах легких на первых пассажах культивирования Ag-окрашивание метафазных хромосом не выявило активных ЯО-районов ни на одном из гомологов этой пары. Однако, после достаточно длительного (20 пассажей) непрерывного культивирования одной из сублиний фибробластов легких, сопровождавшегося увеличением митотической активности клеток, на перестроенном гомологе хромосомы 8 внутри С-блока было обнаружено две зоны, позитивно окрашенные серебром. Это свидетельствовало о проявлении функциональной активности генов рибосомной РНК, находящихся внутри дополнительного гетерохроматинового блока (рис. 66).
Дополнительные гетерохроматиновые блоки хромосомы 5R и хромосомы 8R М. arvalis «obscurus» имеют некоторые сходные характеристики. Они представляют собой дополнительные С-блоки, сформировавшиеся в прителомерных районах одного из гомологов хромосомной пары. Их формирование сопряжено с возникновением ядрышкообразующих районов, в то время как в стандартных хромосомах 5 и 8 М. arvalis «obscurus» ЯО-районы обнаружены не были (рис. 5). Формирование этих гетерохроматиновых блоков, вероятнее всего, относится к событиям недавнего прошлого, либо даже настоящего времени. Принимая во внимание все вышесказанное, можно было ожидать, что во вновь сформированных гетерохроматиновых блоках M.arvalis «obscurus» присутствуют гомологичные повторяющиеся последовательности ДНК. И возможно, эти последовательности ДНК находятся не только в этих блоках, но и в других гетерохроматиновых районах хромосом. Несомненный интерес представляет также вопрос о наличии в гомологах с дополнительными блоками гетерохроматина каких-либо перестроек эухроматиновых районов, возможно имевших место в процессе реорганизации хромосом 5 и 8 M.arvalis «obscurus». Окончательные выводы о наличии или отсутствии перестроек можно делать только на основе сравнения положения уникальных последовательностей ДНК в соответствующих районах хромосом.
С целью решения обозначенных проблем были получены районоспецифические ДНК-пробы «новых» гетерохроматиновых блоков и эухроматиновых районов хромосом 5, 5R и 8R M.arvalis «obscurus» (Рубцова и др., 2001а; Rubtsov et al., 2001). 3.2.2. Районоспецифические ДНК-пробы хромосом M.arvalis «obscurus».
С помощью метода микородисекции и DOP-PCR были получены ДНК-пробы разных районов хромосом 5, 5R и 8R M.arvalis «obscurus». Схема микродиссекции хромосом представлена на рисунке 6а. Две ДНК-пробы (5R-C1 и 5R-C2) были получены из материала С-блока хромосомы 5R. Две пары перекрывающихся ДНК-проб (5-1 и 5-2, 5-11 и 5-12), были получены из материала короткого и части длинного плеча хромосомы 5. Пары перекрывающихся ДНК-проб создавались так, чтобы участки, для которых собиралось максимальное число копий, находились в противоположных концах соответствующих районов (на рисунке 6а эти участки отмечены утолщенной линией).
Ввиду более простой идентификации хромосомы 8R по сравнению со стандартной хромосомой 8 все ДНК-пробы получали микродиссекцией различных районов перестроенного гомолога (рис. 6а). Всего были созданы три ДНК-пробы: ДНК-проба 8 -С была получена из материала дополнительного теломерного гетерохроматинового блока; ДНК-проба 8R-1 - из материала эухроматинового района р-плеча хромосомы 8R; ДНК-проба 8R-2 - из материала, прилежащего к центромерному району эухроматинового сегмента q-плеча хромосомы 8R.
CISS-гибридизация ДНК-проб гетерохроматинового блока 5RC сметафазными хромосомами полевок
Анализ хромосом M.arvalis «obscurus» и M.arvalis «arvalis» показал, что ДНК-пробой 5R-C1 у обеих форм окрашивались ядрышкообразующие и центромерные районы (рис. И). Ядрышкообразующие районы выявлялись и в случае околоцентромерного (мелкие и средние акроцентрические хромосомы), и в случае прителомерного расположения (крупные метацентрические хромосомы M.arvalis «obscurus» и субметацентрическая хромосома 10 M.arvalis «arvalis»). Центромерные районы выявлялись у акроцентриков, несущих ЯО-районы, и у некоторых мелких метацентриков без ЯО-районов.
ДНК-проба 5 -С2 у обеих форм M.arvalis окрашивала прицентромерные гетерохроматиновые районы тех же самых хромосом, что и 5R-C1. Помимо этого ДНК-проба 5 -С2 выявляла эухроматиновые прителомерные районы хромосомы 5, что уже упоминалось выше.
У M.arvalis «obscurus» в отличие от M.arvalis «arvalis» были обнаружены зоны гибридизации ДНК-пробы 5R-C1 еще и в прителомерных районах длинных плеч некоторых акроцентрических аутосом и в прителомерных районах обоих плеч Х-хромосомы (рис. 11).
Расположение сигналов двух ДНК-проб на многих акроцентриках, несущих прицентромерные ЯО-районы, напоминало картину, выявленную в гетерохроматиновом блоке ЯОР-несущей хромосомы 5R (рис. 12), то есть в зоне центромеры оба сигнала перекрывались, а в зоне ЯО-района преобладал сигнал ДНК-пробы 5R-C1. В ЯО-районах, удаленных от центромер (хромосома 10 M.arvalis «arvalis» и метацентрические хромосомы 1-4 M.arvalis «obscurus»), сигналы ДНК-пробы 5R-C2 полностью отсутствовали.
Такой характер распределения сигналов позволил сделать заключение, что ДНК-проба 5R-C1 выявляла прицентромерные. и ядрышкообразующие районы хромосом за счет присутствия в ней разных наборов ГШ-ДНК, гомологичных последовательностям ДНК соответствующих районов хромосомы 5R. ДНК-проба 5R-C2 выявляла только прицентромерные районы хромосом, поскольку в ней отсутствовали ПП-ДНК, гомологичные ДНК ЯО-района хромосомы 5 я. Эти различия ДНК-проб согласуются с различием хромосомных районов, используемых для их получения при микродиссекции (рис. 5).
В хромосомах остальных видов обыкновенных полевок -M.rossiaemeridionalis, M.transcaspicus и M.kirgisorum — ДНК-проба 5R-C2 не давала сигналов ни в каких районах за исключением эухроматиновых районов в гомеологах хромосомы 5 M.arvalis (рис. 11). В то же время ДНК-проба 5R-C1 выявляла все ЯО-районы, но прилежащие к ним центромерные районы оставались неокрашенными.
В результате CISS-гибридизации ДНК-пробы 5R-C1 с метафазными хромосомами M.agrestis вообще не было выявлено никаких сигналов. Этот факт свидетельствует о том, что ЯО-районы обыкновенных полевок выявлялись ДНК-пробой 5R-C1 не за счет наличия в ней ДНК собственно рибосомных генов, а за счет каких-то других присутствующих в ЯО-районах ПП-ДНК. Несмотря на то, что при создании этой ДНК-пробы ЯО-район хромосомы 5R вошел в район диссекции, представительность в ней последовательностей ДНК рибосомных генов, видимо, оказалась недостаточно высока. Таким образом, характер распределения сигналов при CISS-гибридизации ДНК-проб блока 5RC с метафазными хромосомами полевок группы «arvalis» позволил выделить в составе этого «нового» гетерохроматинового блока несколько типов ПП-ДНК, имеющих гомологию с последовательностями ДНК разных районов многих хромосом обыкновенных полевок.
Это, во-первых, ассоциированные с ЯО-районами ПП-ДНК (но не рДНК), во-вторых, ПП-ДНК, характерные для прицентромерных блоков гетерохроматина, и, в-третьих, ПП-ДНК, составляющие небольшие прителомерные блоки хромосом. Следует отметить, что в ДНК-пробе 5R-C1 присутствуют все три типа ПП-ДНК, в то время как в ДНК-пробе 5R-C2 - только ПП-ДНК прицентромерных блоков.
У всех исследованных видов в разных аутосомах с помощью ДНК-проб гетерохроматинового блока 5RC были выявлены небольшие интеркалярные сигналы. Какой из типов ПП-ДНК определяет наличие подобных сигналов, в рамках данного исследования ответить не представляется возможным.
